金丹莉，程逸潮，洪杏德，董秀萍，陳躍文1，*

（1.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學(xué) 東海食品臺(tái)州研究院，浙江 臺(tái)州 318000；3.青島紐萃生生物健康科技有限公司，山東 青島 266071；4.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；5.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

海參（Cucumariafrondosa）是加拿大東海岸數(shù)量最多、分布最廣的物種之一，至2017 年，捕撈量已達(dá)9 萬(wàn)t以上，價(jià)值在1 830 萬(wàn)美金以上，常以冷凍、腌制和干品等形式出口到世界市場(chǎng)[1]。但是相較于刺參（Stichopus japonicus），海參仍然屬于低產(chǎn)值品種，有待更多地商業(yè)開(kāi)發(fā)。然而，傳統(tǒng)的熱加工方式容易導(dǎo)致海參形態(tài)不完整、破壞整體口感等，而且在貯藏過(guò)程中，容易變硬、變黏和降低食用品質(zhì)等，不適合長(zhǎng)途運(yùn)輸和遠(yuǎn)距離銷售[2]。將食品原料加工成粉末主要是為了保持其穩(wěn)定性，便于長(zhǎng)途運(yùn)輸和食用，還能將其用作調(diào)味品、色素和功能成分，因此此加工方式廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[3]。超微粉碎是一種能夠改變物料粒徑的新興機(jī)械技術(shù)，常應(yīng)用于面粉、奶粉、水果和蔬菜等，但在水產(chǎn)品領(lǐng)域中應(yīng)用較少。Wu 等[4]利用超微粉碎生產(chǎn)的鯉魚骨粉，其溶解性和蛋白溶解性等均得到了提高。此外，超微粉碎技術(shù)能夠提高物料的酶解速率[5]。目前，關(guān)于超微粉碎輔助酶解法制備產(chǎn)品的生物活性研究相對(duì)較少。冷凍干燥是一種改善蛋白質(zhì)水解物的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)保質(zhì)期和提高品質(zhì)的技術(shù)手段[6]。例如，Dadi 等[7]研究表明凍干微膠囊的總酚含量、總黃酮含量、抗氧化活性和消化率均明顯高于噴霧干燥微膠囊；Xie 等[8]研究表明水稻蛋白水解物凍干法比噴霧干燥法具有更高的羥基自由基和DPPH 自由基清除活性。研究表明，海參含有20 種酚類化合物，有利于提高產(chǎn)品附加價(jià)值[9]。Senadheera 等[10]研究發(fā)現(xiàn)海參具有完整的必需氨基酸組成，因此海參蛋白酶解物可作為功能食品成分。然而，針對(duì)超微粉碎輔助酶解法制備的海參凍干粉的生物活性研究較少。

本文對(duì)超微粉碎輔助酶解法制備的海參凍干粉進(jìn)行抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞和增強(qiáng)免疫力的生物活性研究，以期為海參的精深加工形式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參[體質(zhì)量（100±10）g，體長(zhǎng)（10±2.5）cm]：青島紐萃生生物健康科技有限公司；食品級(jí)中性蛋白酶（23 000 U/g）、食品級(jí)木瓜蛋白酶（102 000 U/g）：浙江一諾醫(yī)藥有限公司；水楊酸：上海麥克林生化科技有限公司；1，1－二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸亞鐵七水合物、鐵氰化鉀：上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水三氯化鐵、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HeLa 細(xì)胞：通派（上海）生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液：上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、RPMI-1640：武漢普諾賽生命科技有限公司；C57BL/6 雄性小鼠：杭州派思奧生物科技有限公司；無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）小鼠維持飼料：沈陽(yáng)茂華生物科技有限公司；注射用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CY）：江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)試劑盒、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）測(cè)試盒、乳酸（lactic acid，LA）測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所；以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

斬拌機(jī)（CM-14）：無(wú)錫市哈克遜工貿(mào)有限公司；振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)（XDW-6J）：濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司；冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-100FG/A）：寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（BPN-150CRH）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀（KW-6C）：南京卡爾文生物科技有限公司；電子天平（XPR106DUH/AC）：梅特勒-托利多科技（中國(guó)）有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan SkyHigh）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超微粉碎制備海參凍干粉

海參用流水解凍后浸泡脫鹽4 h。隨后，利用斬拌機(jī)和振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)物理粉碎海參體壁。加入物料質(zhì)量1.5%的活性酶（木瓜蛋白酶與中性蛋白酶質(zhì)量比1∶2）酶解，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間3.5 h。酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min，將酶解液冷凍干燥48 h，得到海參凍干粉。

1.3.2 海參凍干粉抗氧化活性的測(cè)定

1.3.2.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

參考Wu 等[11]的DPPH 自由基清除能力的測(cè)定方法，并作適當(dāng)修改。配制濃度為0、5、10、15、20 mg/mL的海參凍干粉溶液，吸取1 mL 樣品，加入4 mL 以無(wú)水乙醇配制的0.2 mmol/L DPPH 溶液，避光反應(yīng)30 min后，8 000 r/min 離心5 min。取200 μL 反應(yīng)后溶液于96 孔板，于517 nm 下用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A1，同時(shí)測(cè)定1 mL 樣品溶液與4 mL 無(wú)水乙醇溶液混合后的吸光度A2，以及1 mL 去離子水與4 mL 的DPPH 自由基溶液混合后的吸光度A3。平行3 次取平均值。按照以下公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH 自由基清除率（X，%）。

X=[1 - (A1-A2)/A3]× 100

1.3.2.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定

參考Ren 等[12]的測(cè)定羥基自由基清除能力的方法，并作適當(dāng)修改。分別取1 mL 海參凍干粉溶液、2 mL的6 mmol/L 亞硫酸鐵溶液、2 mL 的6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和2 mL 的6 mmol/L 過(guò)氧化氫溶液，混合均勻，37 ℃孵育60 min，8 000 r/min 離心5 min。在510 nm下測(cè)定吸光度A1，去離子水代替過(guò)氧化氫溶液測(cè)定其吸光度A2，去離子水代替樣品溶液平行測(cè)定其吸光度A3。按照以下公式計(jì)算樣品對(duì)羥基自由基的清除率（Y，%）。

Y=[1 - (A1-A2)/A3]× 100

1.3.2.3 還原力的測(cè)定

參考Li 等[13]的測(cè)定方法，稍作修改。取1 mL 海參凍干粉溶液、2.5 mL 的0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 值為6.6）和2.5 mL 的1% 鐵氰化鉀溶液混合均勻，在50 ℃下恒溫孵育20 min。冷卻至室溫后，加入2.5 mL的10% 三氯乙酸溶液，靜置10 min，然后8 000 r/min離心5 min。取2.5 mL 上清液、2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，反應(yīng)10 min。待體系顏色由黃色變?yōu)樗{(lán)色，取200 μL 于96 孔板，在700 nm 處測(cè)定吸光度，吸光度越高代表還原能力越強(qiáng)。

1.3.3 海參凍干粉對(duì)HeLa 細(xì)胞的影響

1.3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10% FBS 和1% 青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640 培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行HeLa 細(xì)胞的培養(yǎng)。

待測(cè)海參凍干粉溶液：10.0 mg 海參凍干粉用1 mL DMSO 溶解，再用RPMI-1640 培養(yǎng)基稀釋至0、10、100、1 000、2 000、3 000 μg/mL，最終DMSO 在培養(yǎng)體系中的體積含量需小于0.5%，以避免溶劑毒性。最后，利用微孔濾膜（0.22 μm）除菌，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

在倒置顯微鏡下觀察HeLa 細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，采用0.25%胰蛋白酶消化液消化，制備細(xì)胞懸液。利用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約為5×104個(gè)/mL，接種于96 孔板。除空白組外，加入100 μL 細(xì)胞懸液，在37 ℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。第2 天棄去舊的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組和空白組加入100 μL 海參凍干粉溶液，陰性對(duì)照組加入100 μL DMSO 溶液，培養(yǎng)24、48 h 和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入10 μL 的CCK-8 溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h 后，在450 nm 測(cè)吸光度，按以下公式計(jì)算HeLa 細(xì)胞增殖抑制率（Z，%）[14]。

Z=[1 - (A1-A2)/(A3-A2)]× 100

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組（含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 和含DMSO 的待測(cè)試樣）吸光度；A2為空白組（只含有培養(yǎng)基、CCK-8 和含DMSO 的待測(cè)試樣，無(wú)細(xì)胞）吸光度；A3為陰性對(duì)照組（含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 和DMSO 溶液，無(wú)待測(cè)樣品）吸光度。

參考王麗嬌[15]的方法，按以下公式計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50（H）。

H=Ym-B×[H-(3 -Zm-Zn)/4]

式中：Ym為最大藥物劑量，1 g；B為最大藥物劑量/相鄰劑量；H為細(xì)胞增殖抑制率之和，%；Zm為最大細(xì)胞增殖抑制率，%；Zn為最小細(xì)胞增殖抑制率，%。

1.3.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

C57BL/6 雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)SCXK（滬）2017-0005，6～8 周齡，18～22 g，每組6 只，共54 只。小鼠飼養(yǎng)條件為SPF 小鼠維持飼料，室溫控制在20～25 ℃，濕度控制在50%～60%，明暗交替各12 h，自由飲水取食，鼠籠每2 d 換洗1 次?；A(chǔ)飼料適應(yīng)環(huán)境性喂養(yǎng)7 d。

1.3.5 模型建立、實(shí)驗(yàn)分組及給藥

分別進(jìn)行抗疲勞和增強(qiáng)免疫力實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法如下。

急性疲勞小鼠模型的建立[16]：在正式實(shí)驗(yàn)前3 d，將灌胃30 min 后的小鼠放于40 r/min 的小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上進(jìn)行5 min 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)，作為實(shí)驗(yàn)前的適應(yīng)性訓(xùn)練。在連續(xù)灌胃14 d 后測(cè)定轉(zhuǎn)棒時(shí)間。對(duì)照組：0.3 mL生理鹽水；低劑量組：0.3 mL 生理鹽水+200 mg/kg 海參凍干粉；中劑量組：0.3 mL 生理鹽水+400 mg/kg 海參凍干粉；高劑量組：0.3 mL 生理鹽水+800 mg/kg 海參凍干粉。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，小鼠禁水不禁食24 h。所有小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，每日上午9：00～10：00 按照組別設(shè)定連續(xù)灌胃14 d，小鼠灌胃深度為3 cm。

免疫缺陷小鼠模型的建立[17]：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，小鼠禁水不禁食24 h。除對(duì)照組外，其他各組小鼠給予環(huán)磷酰胺免疫抑制劑（40 mg/kg），腹腔注射連續(xù)5 d，與對(duì)照組對(duì)比，小鼠的體質(zhì)量和免疫球蛋白IgG 含量出現(xiàn)顯著差異，即造模成功。此后，所有小鼠常規(guī)飼養(yǎng)。每日上午9：00～10：00 按照組別設(shè)定連續(xù)灌胃20 d。對(duì)照組：0.3 mL 生理鹽水；模型組：40 mg/kg 環(huán)磷酰胺免疫抑制劑+0.3 mL 生理鹽水；低劑量組：40 mg/kg 環(huán)磷酰胺免疫抑制劑+0.3 mL 生理鹽水+200 mg/kg 海參凍干粉；中劑量組：40 mg/kg 環(huán)磷酰胺免疫抑制劑+0.3 mL生理鹽水+400 mg/kg 海參凍干粉；高劑量組：40 mg/kg環(huán)磷酰胺免疫抑制劑+0.3 mL 生理鹽水+800 mg/kg 海參凍干粉。

1.3.6 抗疲勞實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.6.1 小鼠體質(zhì)量的測(cè)定

記錄小鼠初始體質(zhì)量，每7 d 及處死前，稱重。

1.3.6.2 小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法，稍作修改。在14 d 結(jié)束時(shí)，末次灌胃30 min 后，將小鼠置于30 r/min 小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀進(jìn)行運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)試。記錄各組小鼠在小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上運(yùn)動(dòng)直至因疲勞而從轉(zhuǎn)棒上跌倒的時(shí)段，該時(shí)段即為小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力時(shí)間。如果小鼠抓住桿子并隨著翻轉(zhuǎn)，則認(rèn)為跌倒。

1.3.6.3 血乳酸含量的測(cè)定

根據(jù)Xian 等[19]的測(cè)定方法，稍作修改。于轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)前30 min 時(shí)對(duì)各組小鼠禁食，在小鼠運(yùn)動(dòng)前30 min及運(yùn)動(dòng)后立即取血。采血后，將血液于4 ℃冰箱靜置1 h，以3 000 r/min 離心30 min，得到血清。采集的血清嚴(yán)格按照LA 測(cè)試盒說(shuō)明書操作。

1.3.7 增強(qiáng)免疫力實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.7.1 小鼠體質(zhì)量的測(cè)量

記錄小鼠初始體質(zhì)量，每5 d 及處死前，稱重。

1.3.7.2 IgG 含量的測(cè)定

在末次灌胃后，對(duì)小鼠進(jìn)行采血，3 000 r/min 離心30 min，得到血清。采集的血清嚴(yán)格按照IgG 測(cè)試盒操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019 軟件分析整理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、OriginPro 2023b 進(jìn)行作圖。P<0.05 被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參凍干粉的抗氧化活性分析

DPPH 自由基清除率、羥基自由基清除率和還原力被用于評(píng)估海參凍干粉的抗氧化活性潛力，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 海參凍干粉的DPPH 自由清除率、羥基自由基清除率和還原力Fig.1 DPPH and hydroxyl radical scavenging activities and reducing power of sea cucumber freeze-dried powder

如圖1 所示，隨著海參凍干粉濃度增加，其對(duì)DPPH自由基清除能力逐步增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴性，且IC50為12.46 mg/mL。羥基自由基是活躍的自由基之一，它對(duì)周圍的生物分子會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p害，容易引起癌癥、衰老等不良影響[20]。隨著海參凍干粉濃度增加，其對(duì)羥基自由基清除能力逐步增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴性，IC50為15.22 mg/mL?？寡趸芰瓦€原力一般存在正相關(guān)關(guān)系，抗氧化劑通過(guò)自身的還原作用給出電子，自由基接受電子形成穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而阻斷氧化過(guò)程的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[21]。海參凍干粉給出電子，將體系中的Fe3+還原成Fe2+，給出的電子越多，產(chǎn)生的Fe2+越多，在700 nm處吸光度越大。吸光度隨著海參凍干粉溶液的濃度增加而增加，當(dāng)濃度為20 mg/mL 時(shí)，還原力為0.35，表明海參凍干粉具備抗氧化能力，且具有量效關(guān)系。海參凍干粉中含有大量氨基酸，而甘氨酸被認(rèn)為是具有抗氧化功能的氨基酸殘基，是有效的質(zhì)子供體，對(duì)抗氧化活性有重要影響[22]。Mamelona 等[23]的研究結(jié)果表明海參的抗氧化能力與總酚、類黃酮含量存在顯著相關(guān)性，表現(xiàn)出了抗氧化潛力。

2.2 海參凍干粉對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖抑制分析

海參凍干粉對(duì)HeLa 細(xì)胞的影響如圖2和圖3所示。

圖2 HeLa 細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Morphology of HeLa cells

圖3 不同時(shí)間對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖抑制率的影響Fig.3 Effect of different treatment time of sea cucumber freezedried powder on the proliferation inhibition rate of HeLa cells

由圖2 可知，HeLa 細(xì)胞本身呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞形態(tài)，形態(tài)飽滿，呈現(xiàn)梭形或?yàn)槎嘟切?，彼此?xì)胞連接緊密。海參凍干粉組，從細(xì)胞連接來(lái)看，處理后細(xì)胞呈現(xiàn)疏松排布的狀態(tài)；從形態(tài)方面來(lái)看，多數(shù)細(xì)胞膜邊緣皺縮，失去原本上皮樣細(xì)胞形態(tài)，整體變圓，細(xì)胞膜附近出現(xiàn)膜囊的“小泡”。高劑量組中這種現(xiàn)象更為明顯，一部分細(xì)胞還出現(xiàn)了內(nèi)容物外溢。由圖3 可知，海參凍干粉的濃度越高，對(duì)HeLa 細(xì)胞增殖抑制率越高，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。濃度增至1 000 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞抑制率可達(dá)80%，后趨于平緩。海參凍干粉對(duì)HeLa細(xì)胞干預(yù)24、48 h 和72 h 后的半數(shù)抑制濃度IC50分別為556.2、536.60 μg/mL 和611.9 μg/mL，沒(méi)有體現(xiàn)出明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。因此，海參凍干粉可以有效抑制HeLa 細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明海參凍干粉具備良好的抗腫瘤作用潛力。王婷等[24]的研究結(jié)果顯示，通過(guò)純化后的海參精多糖組分2 對(duì)HeLa 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞均有良好的抑制效果，當(dāng)10 mg/mL 時(shí)，抑制率分別為80.28%和83.11%。李超峰[25]利用正丁醇提取的刺參加工廢棄液對(duì)HeLa 細(xì)胞抑制率為12.29%，而海參凍干粉能夠達(dá)到80%左右。

2.3 海參凍干粉的抗疲勞生物活性分析

2.3.1 海參凍干粉對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響海參凍干粉對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響如圖4 所示。

圖4 海參凍干粉對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of sea cucumber freeze-dried powder on the body weights of mice

由圖4 可知，在連續(xù)14 d 的實(shí)驗(yàn)中，小鼠的飲食、飲水、毛發(fā)、大小便等均沒(méi)有異常。小鼠體質(zhì)量總體為增長(zhǎng)趨勢(shì)，但增長(zhǎng)情況與對(duì)照組相比差異不明顯。

2.3.2 海參凍干粉對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)反映小鼠耐力，轉(zhuǎn)棒時(shí)間的長(zhǎng)短反映動(dòng)物抗阻力運(yùn)動(dòng)時(shí)的疲勞程度。海參凍干粉對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響見(jiàn)表1。

表1 海參凍干粉對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響Table 1 Effect of sea cucumber freeze-dried powder on the rotarod exercise duration of mice

如表1 所示，低、中、高劑量組與對(duì)照組相比，在單位時(shí)間30 min 內(nèi)，小鼠掉落次數(shù)逐漸從11 次減少至2 次，平均運(yùn)動(dòng)時(shí)間從78.89 s 延長(zhǎng)至1 540.12 s，最長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間由88.53 s 延長(zhǎng)至1 800.00 s。因此，表明海參凍干粉能夠提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

2.3.3 海參凍干粉對(duì)小鼠血清中LA 含量的影響

在人類或動(dòng)物中，劇烈或過(guò)度的運(yùn)動(dòng)可能導(dǎo)致細(xì)胞從需氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬醢l(fā)酵。這種情況下，會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，當(dāng)活性氧水平、內(nèi)pH 值和滲透壓不平衡時(shí)，會(huì)出現(xiàn)疲勞狀態(tài)[26]。因此，LA 含量與疲勞程度相關(guān)。海參凍干粉對(duì)小鼠LA 含量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 海參凍干粉對(duì)小鼠LA 含量的影響Fig.5 Effects of sea cucumber freeze-dried powder on the lactic acid（LA）content in mice

如圖5 所示，運(yùn)動(dòng)后，對(duì)照組LA 含量明顯上升，說(shuō)明轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)能夠使小鼠體內(nèi)的葡萄糖經(jīng)過(guò)無(wú)氧酵解產(chǎn)生LA，導(dǎo)致LA 不能快速分解而被大量堆積，出現(xiàn)肌肉酸痛狀態(tài)，使小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)[27]。在轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)前，低、中、高劑量組與對(duì)照組（43.23 mmol/L）相比，LA 含量顯著減少（P<0.05），分別為25.17、13.74、12.27 mmol/L。而運(yùn)動(dòng)后，低、中、高劑量組的LA 含量比對(duì)照組（74.00 mmol/L）差距加大，分別為34.96、22.02、19.15 mmol/L。因此，海參凍干粉通過(guò)提高小鼠體內(nèi)的有氧代謝能力，增強(qiáng)了小鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力，發(fā)揮了抗疲勞功能活性[28]。王敏等[29]通過(guò)負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估得出海參復(fù)合物具有較好的緩解疲勞作用。Wang 等[30]研究結(jié)果表明通過(guò)調(diào)節(jié)NRF2 和AMPK 信號(hào)通路顯著改善了氧化應(yīng)激蛋白相對(duì)水平和線粒體功能，海參酶解產(chǎn)物可提高運(yùn)動(dòng)耐力，發(fā)揮抗疲勞作用。

2.4 海參凍干粉的增強(qiáng)免疫力生物活性分析

2.4.1 海參凍干粉對(duì)小鼠體質(zhì)量的作用

研究表明，長(zhǎng)期使用CY 會(huì)產(chǎn)生有害副作用，如免疫抑制、骨髓抑制和白細(xì)胞減少，因此，CY 常被用于建立小鼠免疫抑制模型[31]。海參凍干粉對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響如圖6 所示。

圖6 海參凍干粉對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of sea cucumber freeze-dried powder on the body weights of mice

由圖6 可知，0～5 d 內(nèi)，除對(duì)照組外，均出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量下降現(xiàn)象，說(shuō)明免疫力低下的小鼠造模成功。經(jīng)過(guò)20 d 灌胃喂養(yǎng)，小鼠體質(zhì)量緩慢上升。小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況與對(duì)照組相比存在明顯差異，但是與模型組相比差異不明顯。綜上所述，海參凍干粉可以緩解由CY 導(dǎo)致的體質(zhì)量下降。

2.4.2 海參凍干粉對(duì)小鼠IgG 含量的影響

免疫球蛋白IgG 是血清中最豐富和最持久的抗體，它在單核細(xì)胞的吞噬作用機(jī)制中起至關(guān)重要的作用[32]，健康成年人IgG 含量應(yīng)在7～18 mg/mL[33]。因此，通過(guò)測(cè)定IgG 含量可反映小鼠的免疫能力，結(jié)果如圖7所示。

圖7 海參凍干粉對(duì)小鼠IgG 含量的影響Fig.7 Effect of sea cucumber freeze-dried powder on the IgG content in mice

如圖7 所示，小鼠經(jīng)過(guò)CY 誘導(dǎo)后IgG 含量顯著降低（P<0.05），說(shuō)明CY 可導(dǎo)致小鼠免疫力下降。小鼠組間差異顯著（P<0.05），同時(shí)，和模型組（5.66 mg/mL）相比，海參凍干粉灌胃的小鼠IgG 含量增長(zhǎng)明顯，特別是高劑量組可達(dá)到11.98 mg/mL，但低于對(duì)照組IgG 含量（14.56 mg/mL）。結(jié)果表明海參凍干粉在一定程度上可以增強(qiáng)CY 誘導(dǎo)免疫缺陷小鼠的免疫力。楊軍楠等[34]通過(guò)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞免疫活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同蛋白酶酶解的海參都具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力的潛力。樂(lè)卿清等[35]利用地塞米松誘導(dǎo)免疫低下小鼠，海參肽在200 mg/kg 和400 mg/kg 均具有提高免疫力的作用，且具有量效關(guān)系。

3 結(jié)論

以超微粉碎輔助酶解法制備海參凍干粉為切入點(diǎn)，在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，DPPH 自由基清除率、羥基自由和還原力均呈現(xiàn)了濃度依賴性。海參凍干粉對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制效果顯著，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。通過(guò)小鼠轉(zhuǎn)棒及血乳酸含量實(shí)驗(yàn)，小鼠的轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，血乳酸含量降低。利用CY誘導(dǎo)的免疫缺陷小鼠實(shí)驗(yàn)，海參凍干粉可緩解CY 造成的體質(zhì)量下降，小鼠IgG 含量增長(zhǎng)明顯。綜上，海參凍干粉具有抗氧化能力、抗腫瘤、抗疲勞和增強(qiáng)免疫力的多功能活性潛力，且具有量效關(guān)系。這為進(jìn)一步深入研究其生物學(xué)活性、藥理學(xué)特性以及安全性提供了基礎(chǔ)。未來(lái)，可以聚焦于探索海參凍干粉中活性成分的作用機(jī)制，深化對(duì)其與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用的效果以及拓展其在醫(yī)學(xué)和保健領(lǐng)域的應(yīng)用前景。