師仁麗，劉欣宜，張彩玉，徐志悅，桑亞新，于文龍，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

棗是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（ZiziphusJujubaMill.）植物的成熟果實，已有4 000 年的栽培歷史[1]。紅棗營養(yǎng)價值高，且有很高的食用價值，是營養(yǎng)和醫(yī)療保健的優(yōu)質(zhì)滋補果品，是很重要的食用材料和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，享有“營養(yǎng)保健丸、木本糧食”的美譽[2-3]。由于其具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護(hù)心肌等功能而被用作營養(yǎng)食品和傳統(tǒng)藥品[4-6]。金絲小棗廣泛分布在河北滄州一帶，具有果核細(xì)小、可食率達(dá)97%、含可溶性固形物40%～45%、制干率55% 左右、質(zhì)脆細(xì)嫩、品質(zhì)優(yōu)良等特點[7-10]。

黃酮類化合物是植物產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，是一類重要的天然化合物，對人體健康起著重要的作用[11-13]。大量研究表明黃酮類物質(zhì)具有降血壓、降血脂、增大心臟血流量、增強心臟收縮、減少心臟搏動數(shù)、止咳祛痰、抗菌消炎的功效[14-16]。黃酮類化合物在植物中分布廣泛，目前發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物已達(dá)5 000 種。黃酮類化合物的生物活性日益受到廣泛關(guān)注，大量研究表明其具有抗氧化、降血糖血脂、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強機體免疫力等生理活性[17-20]。其中對棗中黃酮類化合物的抗氧化活性和免疫活性研究較多，但以上研究僅限于棗中黃酮類化合物的粗提物，并且對金絲小棗中的黃酮類化合物的生物活性研究甚少。

因此本試驗通過分別測定金絲小棗全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取物清除DPPH·、ABTS+·、·OH 的能力和總還原力，以及對小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響，研究比較金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮抗氧化活性和免疫活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金絲小棗：產(chǎn)地為山東省樂陵市；石油醚、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鄰二氮菲、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、三氯乙酸、氯化鐵、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2 ，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS ]、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.9%）：上海源葉生物科技有限公司；無菌小白鼠20 日齡：河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部；RPMI-1640 培養(yǎng)基：美國賽默飛世爾科技公司；刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、臺盼藍(lán)、Hank′s 液：美國Sigma 公司；原體新生牛血清、四甲基偶氮唑鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]：浙江天杭生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-OAB）：天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見風(fēng)光光度計（UV-2008H）：上海UNIC 公司；恒溫水浴鍋（DZWK-C）：北京市光明醫(yī)療儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）：上海亞榮生化儀器廠；酶標(biāo)儀（I500-823）：美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱（HF90）：廣州力康儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

將金絲小棗分為全棗、棗皮、棗肉三部分，分別洗凈烘干，取1 g 加10 mL 石油醚（60～90 ℃），超聲（180 W，45 ℃）30 min，置于60 ℃恒溫水浴鍋中揮干，加入20 mL 70%乙醇，超聲50 min，取上層清液，重復(fù)3 次，最后合并上清液，3 500 r/min，離心10 min，棄去沉淀，得到黃酮粗提液，參照優(yōu)化后最佳的純化工藝（上樣液pH3，吸附流速為3 mL/min，上樣濃度為0.35 mg/mL，洗脫劑為70%乙醇）將3 種粗提液進(jìn)行純化[21]，凍干，置于干燥器中備用。

1.3.2 抗氧化能力的測定

1.3.2.1 DPPH·清除能力的測定

配制DPPH 溶液：準(zhǔn)確稱量DPPH 20 mg，置于100 mL 容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，得到的DPPH 溶液濃度為0.5 mmol/L，于4 ℃下備用。

將1.3.1 得到的提取物用95% 乙醇分別稀釋為10、20、40、60、80、100 μg/mL，分別精密量取2 mL 與等體積的DPPH 溶液混合，振蕩混勻，靜置30 min，測定在517 nm 處的吸光度，記為Ai。將DPPH 溶液替換為60% 乙醇溶液，測得吸光度記為Aj，取DPPH 溶液2 mL 與等體積的60% 乙醇溶液混合，測得吸光度記為A0。60%乙醇溶液為空白對照，以Vc 為陽性對照，以上每個處理做3 個平行。DPPH·清除率（D，%）計算公式如下。

1.3.2.2 ABTS+·清除能力的測定

配制7.4 mmol/L 的ABTS 溶液和2.6 mmol/L 的過硫酸鉀溶液，將兩種溶液混合，在黑暗室溫下放置12 h，為ABTS 儲備液。使用前用95% 乙醇溶液稀釋40～50 倍，在734 nm 處測得的吸光度約為0.70±0.02，得到ABTS 工作液。

將1.3.1 得到的提取物用95% 乙醇分別稀釋為10、20、40、60、80、100 μg/mL，取1 mL 樣品溶液，加入ABTS 工作液4 mL，漩渦振蕩，靜置6 min。以95%乙醇溶液作為空白對照，在734 nm 波長下測得吸光度，記為A。將1 mL 95%乙醇溶液代替樣品溶液，測得吸光度記為A0，以VC為陽性對照。以上每個處理做3 個平行。ABTS+·清除率（B，%）計算公式如下。

1.3.2.3 ·OH 清除能力的測定

取2 mL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.4、150 mmol/L）與4 mL 蒸餾水混勻，作為空白管，在536 nm 處測定吸光度A0；2 mL PBS溶液與1 mL 鄰二氮菲（1.5 mmol/L）、1 mL 硫酸亞鐵（1.5 mmol/L）、2 mL 蒸餾水混勻，作為未損傷管，測定吸光度A1；2 mL PBS 溶液與1 mL 鄰二氮菲、1 mL 硫酸亞鐵溶液、1 mL 蒸餾水、1 mL 0.02%過氧化氫溶液混勻，作為損傷管，測定吸光度A2；2 mL PBS 溶液與1 mL樣品溶液、3 mL 蒸餾水混勻，作為樣品參比管，測定吸光度A3；2 mL PBS 溶液與1 mL 鄰二氮菲、1 mL 硫酸亞鐵溶液、1 mL 樣品溶液、1 mL 過氧化氫溶液混勻，作為樣品管，測定吸光度A4，以VC為陽性對照。在37 ℃恒溫水浴鍋中放置60 min，測定吸光度A。以上每個處理做3 個平行，計算平均值?！H 清除率（O，%）計算公式如下。

1.3.2.4 總還原力的測定

采用鐵氰化鉀法測定總還原力。取1.3.1 所得提取物，用95% 乙醇分別稀釋到含量為25、50、100、200、300、400 μg/mL，分別精密量取2 mL，加入2 mL PBS 溶液（pH6.6、0.2mol/L），再加入2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃孵育20 min，快速冷卻，加入2 mL 10% 三氯乙酸溶液，3 500 r/min 離心10 min，取上清液5 mL，加5 mL 蒸餾水，再加入1 mL 0.1% 三氯化鐵溶液，充分混勻，室溫靜置10 min，測定700 nm 處的吸光度。

1.3.3 免疫活性的測定

1.3.3.1 對小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖的影響

小鼠脾細(xì)胞的制備：將試驗小鼠眼球放血、脫頸、致死后，放置于75%酒精內(nèi)，5 min 后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)，解剖出小鼠脾臟，用Hank′s 液清洗，將鋼網(wǎng)放置到培養(yǎng)皿中，研磨小鼠脾臟，把懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，用Hank′s 液清洗后離心（2 000 r/min，20 min），重復(fù)3 次，加入1 mL RPMI-1640 培養(yǎng)液重懸。調(diào)整細(xì)胞懸液最終濃度為5×106個/mL。

細(xì)胞增殖實驗：將100 μL 細(xì)胞懸液加入到96 孔培養(yǎng)板中，分別加8 個孔，實驗組加入50 μL 不同含量的樣品溶液（5、10、25、50、100 μg/mL），10 μL 刀豆蛋白（ConA），40 μL RPMI-1640 培養(yǎng)液。對照組加入10 μL刀豆蛋白（ConA）、90 μL RPMI-1640 培養(yǎng)液。空白組加入100 μL RPMI-1640 培養(yǎng)液，測定570 nm 處吸光度，記為A0。將96 孔培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，44 h 時加入MTT 10 μL，48 h 時終止培養(yǎng)，每孔棄去100 μL 上清液，加入100 μL 二甲基亞砜，在漩渦混勻器上振蕩搖勻，室溫放置30 min，測定吸光度A1。計算細(xì)胞的增殖率（Z，%）。

1.3.3.2 對小鼠B 淋巴細(xì)胞增殖的影響

操作同1.3.3.1，用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）替換刀豆蛋白（ConA）。計算細(xì)胞的增殖率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測試數(shù)據(jù)和圖形處理分別采用Excel 2016 和Graphpad prism 9 軟件，差異顯著性分析采用SPSS 16.0 軟件中Duncan 法評價，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化能力的測定

2.1.1 DPPH·清除能力

金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物對DPPH·的清除作用如圖1 所示。

圖1 金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物對DPPH·的清除作用Fig.1 Effect of flavonoids extracted from the whole fruit，skin and flesh of Ziziphus Jujuba on DPPH·scavenging

由圖1 可知，金絲小棗全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取物對DPPH·均有清除作用，且含量在10～40 μg/mL時，隨著黃酮含量的增加，DPPH·清除率逐漸增大，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，全棗、棗皮、棗肉的清除率均高于VC，當(dāng)含量大于60 μg/mL 時，增加趨勢不明顯，含量達(dá)到100 μg/mL 時，DPPH·清除率高于90%。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，10～40 μg/mL 范圍內(nèi)金絲小棗全棗、棗皮、棗肉DPPH·清除率存在顯著差異（P<0.05）。80～100 μg/mL 時，差異不顯著，在同一含量下，3 個部位提取液的DPPH·清除能力差異不明顯，棗皮，全棗、棗肉提取液的DPPH·清除能力均高于VC。

2.1.2 ABTS+·清除能力

金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物對ABTS+·的清除作用如圖2 所示。

圖2 金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物對ABTS+·的清除作用Fig.2 Effect of flavonoids extracted from the whole，skin and flesh of Ziziphus Jujuba on ABTS+·scavenging

由圖2 可知，金絲小棗全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取物對ABTS+·均有清除作用，且10～60 μg/mL 時，隨著黃酮含量增加，ABTS+·清除率也不斷增大，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，并且差異顯著（P<0.05），60～100 μg/mL，無增長趨勢，無顯著差異。ABTS+·清除活性順序為棗皮>全棗>棗肉，最高ABTS+·清除率分別可達(dá)到97.17%、96.65%、96.38%，全棗、棗皮、棗肉ABTS+·清除率均低于VC。

2.1.3 ·OH 清除能力

金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物對·OH 的清除作用如圖3 所示。

圖3 金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物對·OH 的清除作用Fig.3 Effect of flavonoids extracted from the whole，peel and flesh of Ziziphus Jujuba on·OH scavenging

由圖3 可知，金絲小棗全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取物對·OH 的清除能力存在一定差異，黃酮含量為10～80 μg/mL 時，·OH 清除率隨著黃酮含量的增加而增大，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；黃酮含量為80～100 μg/mL 時，·OH 清除率小幅度下降。·OH 清除能力順序為棗皮>全棗>棗肉。表明棗皮中具有·OH 清除能力的成分含量較大，而棗肉中含量相對較低。·OH 最高清除率分別可達(dá)到86.15%、84.55%、69.47%，全棗、棗皮、棗肉的·OH 清除率均高于VC。

2.1.4 總還原力的測定結(jié)果

金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物總還原力測定結(jié)果如圖4 所示。

圖4 金絲小棗全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物總還原力測定結(jié)果Fig.4 Results of total reducing power of flavonoids extracted from the whole，skin and flesh of Ziziphus Jujuba

由圖4 可知，隨著黃酮含量的增加，各部位黃酮的吸光度也逐漸增大，且具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，但存在一定差異。除全棗與棗皮差異不明顯，其它樣品間差異明顯，VC的吸光度明顯高于3 種樣品。當(dāng)黃酮含量為400 μg/mL 時，棗皮的吸光度可達(dá)1.20，而棗肉僅為0.76。金絲小棗全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取液均為良好的電子供應(yīng)者，所提供的電子可使Fe3+還原為Fe2+，說明全棗、棗皮、棗肉均具有抗氧化潛力。

2.1.5 相關(guān)性分析

為了更進(jìn)一步確定金絲小棗不同部位黃酮提取液與其抗氧化活性之間的關(guān)系，將各提取液對DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除率作相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)和P值見表1。

表1 黃酮含量與其抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between total flavonoid content and antioxidant activity

由表1 可知，各部位提取液的黃酮含量與其對DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除率以及總還原力均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），表明黃酮在抗氧化活性功能上發(fā)揮著重要作用且有很大的貢獻(xiàn)。綜上，黃酮含量可作為評價金絲小棗抗氧化活性的重要指標(biāo)。此外，4 種抗氧化活性指標(biāo)之間也存在極顯著相關(guān)性（P<0.01），可能是因為它們具有相似的反應(yīng)機理。

2.2 免疫活性的測定

2.2.1 對小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

金絲小棗黃酮提取物對小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖影響，如圖5 所示。

圖5 金絲小棗黃酮提取物對小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖影響Fig.5 Effect of total flavonoids of Ziziphus Jujuba on mouse T lymphocyte proliferation

由圖5 可知，在ConA 誘導(dǎo)小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中，金絲小棗的全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取物對T 淋巴細(xì)胞均具有促進(jìn)作用，在5～100 μg/mL 范圍內(nèi)伴隨黃酮含量的增加促進(jìn)作用也逐漸增大。其中促進(jìn)作用順序為棗皮>全棗>棗肉。當(dāng)含量為100 μg/mL時，增殖率分別達(dá)到46.64%、45.98%、34.36%。棗肉與棗皮、全棗黃酮對T 淋巴細(xì)胞的增殖率差異明顯。

2.2.2 對小鼠B 淋巴細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

金絲小棗黃酮提取物對小鼠B 淋巴細(xì)胞增殖影響如圖6 所示。

圖6 金絲小棗黃酮提取物對小鼠B 淋巴細(xì)胞增殖影響Fig.6 Effect of total flavonoids of Ziziphus Jujuba on mouse B lymphocyte proliferation

由圖6 可知，在LPS 誘導(dǎo)小鼠脾臟B 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中，金絲小棗的全棗、棗皮、棗肉黃酮提取物對B 淋巴細(xì)胞均具有促進(jìn)作用，在5～100 μg/mL 范圍內(nèi)伴隨含量的增加促進(jìn)作用也逐漸增大。其中促進(jìn)作用順序為棗皮>全棗>棗肉。當(dāng)含量為100 μg/mL 時，增殖率分別能達(dá)到46.86%、28.37%、15.11%。棗肉與棗皮黃酮對B 淋巴細(xì)胞的增殖率差異明顯。棗肉、棗皮黃酮含量5、10、25、50 μg/mL 間差異不顯著，100 μg/mL與其他含量間差異顯著（P<0.05）。

3 結(jié)論

對金絲小棗全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取物的抗氧化活性和免疫活性進(jìn)行研究。通過對DPPH·、ABTS+·、·OH 自由基清除能力和總還原力的測定，發(fā)現(xiàn)棗皮、棗肉、全棗均具有較強的抗氧化活性，其中棗皮的抗氧化活性最強，棗肉最弱。在DPPH·和·OH 的清除試驗中，各樣品清除率均高于VC，而ABTS+·清除活性和總還原力低于VC。各提取液黃酮含量與其DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除率以及總還原力均呈顯著正相關(guān)（P<0.01）。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取物對小鼠T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞的增殖均具有較強的直接促進(jìn)作用，強弱順序為棗皮>全棗>棗肉。綜上所述，金絲小棗是一種具有開發(fā)前景的天然抗氧化劑，全棗、棗皮、棗肉的黃酮提取物均可以達(dá)到提高機體免疫力的作用。