黃深振 齊 迪 裴曉婷 路頂立 司宏麗 黃杜鎏睿 張文瀟 巴夢(mèng)茹 軒書(shū)婷 李志杰

時(shí)差是由快速穿越多個(gè)時(shí)區(qū)引起的內(nèi)源性生物鐘和外部周?chē)h(huán)境的光-暗循環(huán)變化不同步現(xiàn)象。時(shí)差造成各種健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題,包括炎癥性腸病[1]、心血管疾病[2]、代謝疾病[3]、抑郁癥[4]、神經(jīng)退行性疾病[5]及癌癥[6]等。經(jīng)歷時(shí)差和輪班工作后,人血液轉(zhuǎn)錄組中的轉(zhuǎn)錄組遭受不利影響,且轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)目減少[7]。研究表明,時(shí)差會(huì)損傷小鼠眶外淚腺的結(jié)構(gòu)和功能,并使淚腺的晝夜節(jié)律遭到破壞,改變核受體亞家族1 D組成員1(NR1D1)的晝夜節(jié)律和表達(dá)量[8]。SR8278是NR1D1的合成拮抗劑[9],可抑制NR1D1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制。然而,SR8278是否可以改善時(shí)差造成的淚腺功能紊亂目前尚不十分清楚。因此,本研究利用光照周期相位前移建立時(shí)差小鼠模型,探討SR8278改善時(shí)差造成小鼠眶外淚腺結(jié)構(gòu)和功能的效果及可能機(jī)制。本研究將有助于理解時(shí)差或輪班工作期間淚腺轉(zhuǎn)錄組和功能的變化,以及為專門(mén)針對(duì)時(shí)差和與時(shí)差相關(guān)眼表疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑

SR8278(貨號(hào)HY-14415,MedChemExpress,美國(guó));鹽酸匹羅卡品(濃度為0.45 g·L-1,貨號(hào)HY-B0726,MedChemExpress,美國(guó));磷酸鹽緩沖鹽溶液(貨號(hào)G0002,Servicebio Company,中國(guó)武漢);牛血清白蛋白(貨號(hào)G5001,Servicebio公司,武漢,中國(guó));β-連環(huán)蛋白抗體(貨號(hào)GB11015,Servicebio公司,中國(guó)武漢);蘇木精溶液(貨號(hào)G1004,Servicebio公司,中國(guó)武漢);RNAeasy旋轉(zhuǎn)柱試劑盒(Qiagen,Hilden,德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及時(shí)差模型建立

于南京模式動(dòng)物研究所(中國(guó)南京)購(gòu)買(mǎi)36只健康的8～10周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠。小鼠飼養(yǎng)在溫度和濕度恒定的12 h光亮/12 h黑暗周期節(jié)律箱中,并可以自由飲水和進(jìn)食。小鼠適應(yīng)以上環(huán)境2周后,并且部分小鼠植入發(fā)射器在節(jié)律箱內(nèi)恢復(fù)2周后建立時(shí)差模型,時(shí)差模型建立參考之前的研究方案[8,10-11],將光照周期相位前移8 h。將小鼠分為正常組(未建立時(shí)差的小鼠)、時(shí)差組(建立時(shí)差的小鼠)和時(shí)差+SR8278組(建立時(shí)差,并給予25 mg·kg-1的SR8278干預(yù)),每組12只,共干預(yù)5 d。本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)涉及視力和眼科方面的研究均按照視覺(jué)和眼科研究協(xié)會(huì)說(shuō)明書(shū)中規(guī)定的使用指南進(jìn)行,并獲河南省人民醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):HNEECA-2022-02)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠活動(dòng)度和核心體溫檢測(cè)

參考之前的研究方法[12-17],通過(guò)無(wú)線遙測(cè)系統(tǒng)(model ER-4000 E-Mitter,Sunriver,OR,美國(guó))獲得C57BL/6J雄性小鼠的活動(dòng)度和核心體溫?cái)?shù)據(jù)。具體執(zhí)行步驟如下:小鼠適應(yīng)以上周期節(jié)律箱環(huán)境2周后,將各組隨機(jī)3只小鼠麻醉后在腹腔內(nèi)植入發(fā)射器?？p合傷口后,小鼠在節(jié)律箱內(nèi)恢復(fù)2周后建立1.2中的分組。將含有發(fā)射器的小鼠放置在無(wú)線遙測(cè)接收器上,收集小鼠的活動(dòng)度和核心體溫。將數(shù)據(jù)收集軟件設(shè)置為5 min和20 min分別監(jiān)測(cè)一次小鼠的活動(dòng)度和核心體溫。

1.3.2 小鼠淚液分泌量測(cè)試

小鼠淚液測(cè)試方法參考之前的研究方案[8,15,18]。各組隨機(jī)選擇剩余9只中的3只小鼠,將生理鹽水配制的鹽酸匹羅卡品注射到小鼠腹腔(4.5 mg·kg-1)后,用無(wú)菌鑷子將一根彎曲的酚紅棉線末端放置在眼睛內(nèi)眼角20 s,測(cè)量浸潤(rùn)長(zhǎng)度并記錄。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法評(píng)估眶外淚腺

參考之前的研究方案[13,15],采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)小鼠眶外淚腺進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。各組隨機(jī)選擇剩余6只中的3只小鼠處死,摘取雙側(cè)淚腺組織,于100 g·L-1磷酸鹽緩沖福爾馬林中保存24 h,之后短暫包埋在石蠟中。將包埋的石蠟切片(5 μm),通過(guò)二甲苯和75%～100%乙醇進(jìn)行脫蠟和再水合。為了淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,切片采用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌,然后在30 g·L-1過(guò)氧化氫中浸泡5 min。將切片在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖鹽溶液中加入30 g·L-1牛血清白蛋白中洗滌和封閉30 min,并與抗β-連環(huán)蛋白抗體一起孵育。然后將切片與二抗在室溫下孵育50 min。細(xì)胞核被Mayer的蘇木精溶液染色。最后,將切片封裝并在顯微鏡下檢查并拍照。

1.3.4 組織樣品收集和RNA高通量測(cè)序

在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),將3組各剩余的最后3只小鼠采用頸椎脫臼的方法處死,然后立即收集小鼠的2個(gè)眶外淚腺組織,使用分析天平(MS105DU,Mettler Toledo,瑞士)稱量淚腺重量,并迅速將眶外淚腺組織轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。按照TRIzol RNA提取方案,采用RNAeasy旋轉(zhuǎn)柱試劑盒提取RNA。然后將各組小鼠中每一只小鼠的2個(gè)淚腺的RNA分別匯集到一個(gè)獨(dú)立的樣品管中,共計(jì)9個(gè)RNA樣品分別用于高通量RNA測(cè)序分析。按照測(cè)序方法[16,19],在北京基因組研究所(華大基因研究院,中國(guó)深圳)進(jìn)行包含NR1D1的RNA-Seq測(cè)序分析。

1.3.5 KEGG和GO功能富集分析

差異基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)功能注釋分析[12,15]。本研究使用blastall軟件[National Center for Biotechnology Information (NCBI),貝塞斯達(dá),馬里蘭州,美國(guó)]對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)V81.0和NCBI RefSeq(GCF_000001635.25_GRCm38.p5)進(jìn)行KEGG路徑注釋。P<0.05的途徑被認(rèn)為顯著富集了差異表達(dá)基因。候選基因的分子功能和生物學(xué)過(guò)程通過(guò)基因本體(GO)進(jìn)行分析[20-21]。該分析首先將所有候選基因映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org)的每個(gè)術(shù)語(yǔ),并計(jì)算每個(gè)術(shù)語(yǔ)的基因數(shù)量。然后應(yīng)用超幾何學(xué)測(cè)試從該物種的所有遺傳背景中確定候選基因生物學(xué)功能方面的重要性。閾值設(shè)置為P<0.05。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組活動(dòng)度、核心體溫、淚腺重量、淚液分泌和細(xì)胞體積比較采用單因素方差分析。包含NR1D1的RNA-Seq高通量測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)通過(guò)SOAPnuke(1.5.2版本)軟件進(jìn)行過(guò)濾。使用 Bowtie2(2.2.5版本)軟件將干凈的讀數(shù)與參考編碼基因集進(jìn)行比對(duì),然后使用 RSEM(1.2.12版本)軟件計(jì)算包含NR1D1基因的表達(dá)水平。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SR8278改善時(shí)差小鼠的活動(dòng)度和核心體溫

各組小鼠的活動(dòng)度和核心體溫變化見(jiàn)圖1。正常組小鼠的活動(dòng)度和核心體溫具有晝夜變化規(guī)律,其夜間的活動(dòng)度及核心體溫均高于白天(均為P<0.001)。與正常組相比,時(shí)差組小鼠白天活動(dòng)度較高,夜間活動(dòng)度較低,白天核心體溫較高,夜間核心體溫較低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。時(shí)差改變了正常小鼠的運(yùn)動(dòng)規(guī)律與核心體溫。與時(shí)差組相比,時(shí)差+SR8278組小鼠白天活動(dòng)度較低,夜間活動(dòng)度較高,白天核心體溫較低,夜間核心體溫較高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。SR8278改善了時(shí)差小鼠晝夜活動(dòng)度和核心體溫變化。

A:3組小鼠24 h活動(dòng)度變化曲線;B:3組小鼠白天及夜間的活動(dòng)度平均值;C:3組小鼠24 h的核心體溫變化曲線;D:3組小鼠白天及夜間的核心體溫平均值。黑色陰影代表晝夜時(shí)間中的黑暗期間,白色背景代表晝夜時(shí)間的光亮期間。兩組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖1 正常組、時(shí)差組及時(shí)差+SR8278組小鼠24 h活動(dòng)度和核心體溫變化比較

2.2 SR8278改善時(shí)差小鼠淚腺重量、淚液分泌量及細(xì)胞大小

與正常組相比,時(shí)差組小鼠淚腺重量及淚液分泌量降低,淚腺細(xì)胞增大,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與時(shí)差組相比,時(shí)差+SR8278組小鼠淚腺重量及淚液分泌量增加,淚腺細(xì)胞減小,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

與正常組相比,時(shí)差組小鼠夜晚淚腺中NR1D1表達(dá)量較高;與時(shí)差組相比,時(shí)差+SR8278組小鼠夜晚淚腺中NR1D1表達(dá)量較低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖2)。

A:3組小鼠淚腺重量比較;B:3組小鼠淚液分泌量比較;C:3組小鼠淚腺細(xì)胞大小比較;D:正常組小鼠淚腺細(xì)胞大小典型免疫組織化學(xué)圖;E:時(shí)差組小鼠淚腺細(xì)胞大小典型免疫組織化學(xué)圖;F:時(shí)差+SR8278組小鼠淚腺細(xì)胞大小典型免疫組織化學(xué)圖;G:3組小鼠淚腺中NR1D1的mRNA表達(dá)量比較。兩組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2 正常組、時(shí)差組及時(shí)差+SR8278組小鼠淚腺重量、淚液分泌量及細(xì)胞大小比較

2.3 SR8278影響時(shí)差小鼠淚腺的差異基因數(shù)目

正常組和時(shí)差組共有602個(gè)顯著性差異基因,其中顯著性上調(diào)基因416個(gè),顯著性下調(diào)基因186個(gè)。時(shí)差組和時(shí)差+SR8278組共有947個(gè)顯著性差異基因,其中顯著性上調(diào)基因43個(gè),顯著性下調(diào)基因904個(gè)(圖3)。

A:正常組與時(shí)差組的差異表達(dá)基因火山圖;B:時(shí)差組與時(shí)差+SR8278組的差異表達(dá)基因火山圖。圖3 正常組、時(shí)差組及時(shí)差+SR8278組小鼠差異表達(dá)基因分析

2.4 SR8278影響小鼠淚腺的KEGG通路

正常組與時(shí)差組小鼠的差異基因富集前10名KEGG通路可以分為3類(圖4A):(1)代謝:代謝途徑,氧化磷酸化,碳代謝,糖胺聚糖生物合成,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,C5-支鏈二元酸代謝及不飽和脂肪酸的生物合成;(2)遺傳信息處理:硫繼電器系統(tǒng)和核糖體;(3)有機(jī)系統(tǒng):PPAR信號(hào)通路。時(shí)差組與時(shí)差+SR8278組小鼠的差異基因富集前10名KEGG通路可以分為3類(圖4B):(1)代謝:甘油脂質(zhì)代謝和磷酸肌醇代謝;(2)環(huán)境信息處理:Notch信號(hào)通路,Hippo信號(hào)通路,mTOR信號(hào)通路,Wnt信號(hào)通路,AMPK信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路;(3)有機(jī)系統(tǒng):甲狀腺激素信號(hào)通路和軸突引導(dǎo)。

A:正常組與時(shí)差組差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路富集分析柱狀圖;B:時(shí)差組與時(shí)差+SR8278組差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路富集分析柱狀圖。圖中顯示的是P<0.05的前10名通路。圖4 正常組、時(shí)差組及時(shí)差+SR8278組小鼠差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路富集分析和GO注釋分析

2.5 SR8278影響時(shí)差小鼠淚腺的生物學(xué)過(guò)程

正常組與時(shí)差組小鼠淚腺差異基因富集前10名GO_生物學(xué)過(guò)程可以分為4類(圖5A):(1)代謝過(guò)程:長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝過(guò)程,有氧呼吸,胞質(zhì)翻譯及超長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝過(guò)程;(2)對(duì)刺激的反應(yīng):急性期反應(yīng);(3)發(fā)育過(guò)程:心房形態(tài)發(fā)生,流出道隔形態(tài)發(fā)生,T淋巴細(xì)胞分化及組織發(fā)育;(4)免疫系統(tǒng)過(guò)程:抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫反應(yīng)。時(shí)差組與時(shí)差+SR8278組小鼠淚腺差異基因富集前10名GO_生物學(xué)過(guò)程可以分為3類(圖5B):(1)代謝過(guò)程:RNA聚合酶II對(duì)轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控,磷酸化,蛋白質(zhì)磷酸化及蛋白質(zhì)自磷酸化;(2)發(fā)育過(guò)程:神經(jīng)管閉合術(shù),參與神經(jīng)管閉合的平面細(xì)胞極性通路,血管發(fā)生,血管發(fā)育混合肺發(fā)育;(3)生物調(diào)節(jié):GTP酶活性的正調(diào)節(jié)。

A:正常組與時(shí)差組差異表達(dá)基因GO_生物學(xué)過(guò)程富集分析氣泡圖;B:時(shí)差組與時(shí)差+SR8278組差異表達(dá)基因GO_生物學(xué)過(guò)程富集分析氣泡圖;C:正常組與時(shí)差組差異表達(dá)基因GO_分子功能富集分析氣泡圖;D:時(shí)差組與時(shí)差+SR8278組差異表達(dá)基因GO_分子功能富集分析氣泡圖。圖中顯示的是P<0.05的前10名通路。圖5 正常組、時(shí)差組及時(shí)差+SR8278組小鼠差異表達(dá)基因GO注釋分析

正常組與時(shí)差組小鼠淚腺差異基因富集前10名GO_分子功能可以分為5類(圖5C):(1)催化活性:硫酯水解酶活性,NADH脫氫酶(泛醌)活性,乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶活性,醛脫氫酶[NAD(P)+]活性及硫代硫酸鹽硫轉(zhuǎn)移酶活性;(2)分子轉(zhuǎn)換活性:五聚蛋白受體活性;(3)結(jié)構(gòu)分子活性:核糖體的結(jié)構(gòu)成分;(4)整合:信息素活性及小分子結(jié)合;(5)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性:脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。時(shí)差組與時(shí)差+SR8278組小鼠淚腺差異基因富集前10名GO_分子功能可以分為4類(圖5D):(1)催化活性:轉(zhuǎn)移酶活性,激酶活性,蛋白激酶活性,組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性(H3-K4 特異性);(2)分子功能調(diào)節(jié)劑:鳥(niǎo)苷酸交換因子活性,GTP酶激活劑活性;(3)整合:Rho鳥(niǎo)苷酸交換因子活性,蛋白質(zhì)結(jié)合,PDZ域綁定;(4)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性:轉(zhuǎn)錄共激活因子活性。

3 討論

時(shí)差也被稱為晝夜節(jié)律不同步,是由于人們快速跨越多個(gè)時(shí)區(qū),與身體的自然晝夜節(jié)律和外部環(huán)境不匹配引起的一種睡眠障礙[22]。時(shí)差可影響所有年齡段的人群,且對(duì)老年人的影響可能更明顯。時(shí)差的不良反應(yīng)程度包含許多因素,如跨越時(shí)區(qū)的數(shù)量、航班的方向和時(shí)間。個(gè)體的差異性解釋了適應(yīng)新時(shí)區(qū)的能力和癥狀期的持續(xù)時(shí)間。旅行者通常在跨越至少2個(gè)時(shí)區(qū)的航空旅行后出現(xiàn)不適癥狀,不適癥狀包括睡眠紊亂、白天疲勞、執(zhí)行腦力和體力任務(wù)的能力下降、警覺(jué)性降低和頭痛等[23-24]。睡眠障礙通常會(huì)持續(xù)幾天,但如果時(shí)區(qū)變化超過(guò)8 h,睡眠障礙可能會(huì)持續(xù)長(zhǎng)達(dá)一周。雖然頻繁的去同步是一種短暫的疾病,但流行病學(xué)和動(dòng)物研究證明,時(shí)差可能導(dǎo)致長(zhǎng)期的不良后果,如認(rèn)知障礙、胃腸功能障礙紊亂,并增加癌癥、不孕癥和心臟病的風(fēng)險(xiǎn)[3,22]。

淚膜是眼表與外界環(huán)境的重要界面,其對(duì)于維持眼表穩(wěn)態(tài)和角膜光學(xué)功能具有重要作用[25]。淚膜由3層組成,從前到后分別為脂質(zhì)層、水層和黏蛋白層。淚腺通過(guò)分泌淚膜的水層維持眼表的穩(wěn)定性和角膜視覺(jué)功能,從而維持眼睛的健康和功能[26-27]。淚腺的分泌受多種因素影響,如更年期[28]、糖尿病[18]、衰老[17]、時(shí)差[8]及高脂飲食[16],以上這些因素均會(huì)降低淚腺的分泌功能,威脅眼表健康。有研究發(fā)現(xiàn),時(shí)差可重編程小鼠淚腺的晝夜轉(zhuǎn)錄組,損傷小鼠淚腺的重量、細(xì)胞大小及淚液分泌量[8]。然而是否可以通過(guò)藥理學(xué)干預(yù)策略改善時(shí)差造成的淚腺結(jié)構(gòu)和功能損傷目前尚不十分清楚。SR8278作為NR1D1的拮抗劑,可以抑制NR1D1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制[9]。本研究利用光照周期相位前移建立時(shí)差小鼠模型,探討SR8278改善時(shí)差造成小鼠眶外淚腺結(jié)構(gòu)和功能的效果及可能機(jī)制。Xue等[29]研究發(fā)現(xiàn),SR8278可以促進(jìn)損傷后角膜的有絲分裂和再上皮化動(dòng)力學(xué)過(guò)程,從而促進(jìn)角膜損傷后修復(fù)。Guo等[30]研究發(fā)現(xiàn),SR8278通過(guò)靶向抑制NR1D1/2限制了鐵死亡,從而改善小鼠葉酸誘導(dǎo)的急性腎損傷。Lee等[31]研究發(fā)現(xiàn),SR8278通過(guò)拮抗NR1D1/2可減輕阿爾茨海默病小鼠模型中的淀粉樣蛋白斑塊沉積。本研究通過(guò)時(shí)差小鼠體內(nèi)SR8278干預(yù)發(fā)現(xiàn),其不僅可以改善時(shí)差小鼠的活動(dòng)度和核心體溫,還可改善時(shí)差小鼠的淚腺重量、淚液分泌量及細(xì)胞大小。進(jìn)一步的功能富集分析發(fā)現(xiàn),SR8278可能是通過(guò)Notch信號(hào)通路影響了小鼠淚腺的功能。

4 結(jié)論

SR8278可通過(guò)靶向抑制NR1D1,重編程小鼠淚腺的轉(zhuǎn)錄組,改變KEGG信號(hào)通路、GO_分子功能及GO_生物學(xué)過(guò)程,改善小鼠淚腺的重量和分泌功能,其過(guò)程可能是通過(guò)Notch信號(hào)通路完成的。這一結(jié)果可為臨床上因?yàn)闀r(shí)差導(dǎo)致的淚腺功能紊亂的治療提供新思路,但SR8278對(duì)淚腺的晝夜節(jié)律影響和具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。