夏季不同播期對(duì)苜?？购约霸蕉挠绊懷芯?/h1>
2024-04-11 02:48:26張慶昕張玉霞朱愛(ài)民陳衛(wèi)東田永雷
劉 罡，張慶昕，張玉霞，朱愛(ài)民，陳衛(wèi)東，田永雷
（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)草業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）
苜蓿（Medicago sativaL.）在世界各國(guó)均有種植，種植面積因地而異［1］，因其具有良好的適應(yīng)能力，寒冷地區(qū)和濕熱地區(qū)均有栽培，其秋眠級(jí)越低則越耐寒，反之則抗寒性較弱。自20世紀(jì)50年代起至今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)苜?？购缘难芯枯^多［2-5］，目的是探究苜?？购砑吧瘷C(jī)制，篩選苜?？购颍嘤弋a(chǎn)抗寒的苜蓿品種。苜蓿越冬期根頸會(huì)經(jīng)歷由多種脅迫共同引起的復(fù)雜過(guò)程，當(dāng)脅迫達(dá)到一定程度，會(huì)使苜蓿發(fā)生凍害，嚴(yán)重會(huì)造成苜蓿死亡。相關(guān)研究表明，苜蓿根頸保護(hù)酶活性會(huì)直接影響苜?？购芰Γ?-9］，其中，苜蓿根頸中的部分抗氧化酶能減輕低溫脅迫造成的活性氧分子對(duì)細(xì)胞的損害［10］?？芙ù宓龋?1］、朱愛(ài)民等［12］的研究顯示，在低溫鍛煉期苜蓿根頸中抗氧化酶活性增強(qiáng)。王絳輝等［13］指出，高海拔寒冷地區(qū)苜蓿根系中的抗氧化酶活性較強(qiáng)。苜蓿根頸中抗氧化酶活性與苜?？购悦芮邢嚓P(guān)，且苜蓿根頸中可溶性蛋白含量在不同水平低溫處理下的表現(xiàn)也有所差異。KRASNUK等［14］對(duì)紫花苜?？购缘难芯勘砻?，在苜蓿根內(nèi)可溶性蛋白含量升高過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵影響因素是低溫脅迫程度的增加。WLDNGM等［15］認(rèn)為，在提高植物抗寒性的過(guò)程中，可溶性蛋白含量的增加發(fā)揮了較大作用。在一定低溫條件下，苜蓿會(huì)為抵御低溫脅迫而進(jìn)行自我調(diào)控，但在不同低溫脅迫下，苜蓿發(fā)生的生理、生化反應(yīng)及苜蓿的抗冷閾值等，還有待進(jìn)一步研究。
選擇適合的播種時(shí)期對(duì)于苜蓿的健康生長(zhǎng)及安全越冬具有重要意義［16］。被譽(yù)為“中國(guó)草都”的內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗，該地區(qū)春季風(fēng)沙大、溫度低，不利于苜蓿的春季播種；夏季高溫，過(guò)早播種田間雜草多，過(guò)晚播種苜蓿生長(zhǎng)較弱，不利于安全越冬。因此，通過(guò)對(duì)不同播種時(shí)期的苜蓿做低溫處理，測(cè)定根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量，以翌年苜蓿越冬率為指標(biāo)，探討不同播期對(duì)苜蓿的抗寒性以及越冬能力的影響，為當(dāng)?shù)剀俎０踩蕉峁├碚撝С帧?/p>
1 材料和方法
1.1 試驗(yàn)區(qū)概況
試驗(yàn)于內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗牧草生產(chǎn)基地（42°30′50′′N，115°27′34′′E）進(jìn)行。該地區(qū)年均降水量約375 mm，無(wú)霜期140～150 d，年均風(fēng)速3.0～4.4 m/s，年均氣溫5.5 ℃，≥10 ℃的積溫為3 000～3 200 ℃；試驗(yàn)地土壤主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。
表1 試驗(yàn)地土壤營(yíng)養(yǎng)成分及pHTab.1 Soil nutrient and pH in the test site
1.2 試驗(yàn)材料
供試苜蓿品種為公農(nóng)1號(hào)（Gongnong No.1，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地研究所提供）、騎士T（Knight T，購(gòu)自北京佰青源畜牧業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）、擎天柱（Optimus prime，購(gòu)自北京正道生態(tài)科技有限公司）。
1.3 試驗(yàn)方法
試驗(yàn)于2017 年進(jìn)行，設(shè)4 個(gè)播期，分別為7 月1 日、7 月15 日、8 月1 日、8 月15 日，播種方式為條播。每個(gè)小區(qū)面積為3 m×4 m，隨機(jī)區(qū)組排列，4次重復(fù)，小區(qū)之間有0.5 m過(guò)道，共48個(gè)小區(qū)，不進(jìn)行秋季刈割，土壤凍融期（2017年11月10日）直接對(duì)苜蓿根系取樣。所采樣品4 ℃低溫保存，待低溫處理。
低溫處理試驗(yàn)：參考朱愛(ài)民等［5］采用的試驗(yàn)方法，分別依照5、-5、-10、-15、-20、-25 ℃目標(biāo)溫度對(duì)苜蓿進(jìn)行低溫脅迫處理。以4 ℃/h的速率對(duì)低溫程控箱溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，達(dá)到目標(biāo)溫度后穩(wěn)定保持6 h。完成低溫處理后以4 ℃/h的速率對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行升溫，達(dá)到室溫后取出，并立即進(jìn)行抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的測(cè)定。
1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法
可溶性蛋白含量、過(guò)氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均采用鄒琦［17］生理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方法測(cè)定。越冬率以存活株數(shù)占植株總數(shù)的百分比表示。
1.5 數(shù)據(jù)分析
使用Microsoft Excel 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 播期和低溫處理對(duì)苜蓿根頸抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量的影響
品種、品種+播期、品種+播期+溫度處理對(duì)苜蓿根頸SOD活性、CAT活性、POD活性、可溶性蛋白含量影響均不顯著；播期對(duì)苜蓿根頸SOD活性和可溶性蛋白含量影響極顯著（P＜0.01）；SOD活性、CAT活性和POD活性對(duì)低溫的響應(yīng)較敏感（表2）?？梢?jiàn)播期和溫度處理與苜蓿的抗寒性密切相關(guān)。
表2 處理與超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、可溶性蛋白之間的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between treatment and superoxide dismutase，catalase，peroxidase，soluble protein
2.2 不同播期苜蓿越冬率比較
隨播種時(shí)期的推遲，供試3個(gè)苜蓿品種越冬率均逐漸降低。8月播種的苜蓿越冬率較7月1日播種均顯著降低（P＜0.05）。由于2017年至2018年冬季溫度較低，該地區(qū)苜蓿大面積受到凍害影響，7月1日播種的苜蓿越冬率均不足60.0%。見(jiàn)圖1。
圖1 苜蓿越冬率在不同播期下的變化Fig.1 Changes of overwintering rate of alfalfa in different sowing time
2.3 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影響
2.3.1 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中SOD活性的影響
隨處理溫度的降低，苜蓿根頸SOD活性呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)，其中，苜蓿根頸SOD活性于-15 ℃脅迫下最低，為134.3 U/g；-5、-20 ℃脅迫下根頸SOD活性均顯著大于-15 ℃處理（P＜0.05）；-25 ℃脅迫下根頸SOD活性最高，為209.9 U/g，且顯著高于其他5個(gè)處理（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。
圖2 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中SOD活性變化Fig.2 Changes of SOD activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress
2.3.2 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中CAT活性的影響
隨處理溫度的降低，苜蓿根頸CAT活性呈逐漸降低趨勢(shì)，其中，5、-5 ℃條件下苜蓿根頸CAT活性較高，分別為46.7、42.4 U/（min·g），均顯著高于其他4個(gè)處理（P＜0.05）；-25 ℃條件下苜蓿根頸CAT活性最低，為6.9 U/（min·g），顯著低于其他處理（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。
圖3 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中CAT活性變化Fig.3 Changes of CAT activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress
2.3.3 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中POD活性的影響
隨處理溫度的降低，苜蓿根頸中POD 活性呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢(shì)。5 ℃處理POD 活性為646.7 U/（min·g），顯著高于其他5個(gè)處理（P＜0.05）；在-5、-15 ℃處理下兩者間差異不顯著，分別為506.2、513.8 U/（min·g），顯著大于-20、-25 ℃處理（P＜0.05）；其他3個(gè)處理間苜蓿根頸POD活性差異不顯著。見(jiàn)圖4。
圖4 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中POD活性變化Fig.4 Changes of POD activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress
2.3.4 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中可溶性蛋白含量的影響
隨處理溫度的降低，苜蓿根頸可溶性蛋白含量呈升高-降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，在-5、-20 ℃時(shí)，分別達(dá)到高峰，-20 ℃條件下顯著大于其他處理（P＜0.05）；在-10、-25 ℃條件下各自達(dá)到一次低峰，分別為16.3、17.0 mg/g，較-5 ℃處理顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。
圖5 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中可溶性蛋白含量變化Fig.5 Changes of soluble protein content in alfalfa root collar in different low-temperature stress
2.4 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影響
2.4.1 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸SOD活性的影響
苜蓿根頸SOD 活性對(duì)不同播期處理響應(yīng)不同，其中，7 月播種的苜蓿根頸SOD 活性均偏高，分別為177.7、168.1 U/g，均顯著大于8 月播種的處理（P＜0.05）；8 月1 日和8 月15 日播期處理之間苜蓿根頸中SOD活性差異不顯著。見(jiàn)圖6。
圖6 苜蓿根頸SOD活性在不同播期下的變化Fig.6 Changes of alfalfa root collar SOD activity in different sowing time
2.4.2 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸CAT活性的影響
苜蓿根頸CAT活性在7月15日播種處理中達(dá)到31.3 U/（min·g），在4個(gè)播期中最高，顯著高于8月1日播種處理（P＜0.05），與7月1日播種處理的29.86 U/（min·g）和8月15日播種處理的28.58 U/（min·g）差異不顯著；苜蓿根頸CAT活性在另外3個(gè)播種時(shí)期處理間均無(wú)顯著差異。見(jiàn)圖7。
圖7 苜蓿根頸CAT活性在不同播期下的變化Fig.7 Changes of alfalfa root collar CAT activity in different sowing time
2.4.3 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸POD活性的影響
苜蓿根頸POD 活性在8 月15 日播期處理達(dá)到最高，為524.3 U/（min·g），顯著高于8 月1 日處理（P＜0.05），但與7 月1 日和7 月15 日播期處理間差異不顯著；7 月1 日、7 月15 日和8 月1 日播種的苜蓿根頸中POD 活性差異不顯著。見(jiàn)圖8。
圖8 苜蓿根頸POD活性在不同播期下的變化Fig.8 Changes of alfalfa root collar POD activity in different sowing time
2.4.4 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸可溶性蛋白含量的影響
苜蓿根頸可溶性蛋白含量7月1日和7月15日播種處理分別為30.74 mg/g和28.64 mg/g，顯著高于8月份播種的2個(gè)處理（P＜0.05）；而7月1日與7月15日播種處理之間、8月1日與8月15日播種處理之間苜蓿根頸可溶性蛋白含量差異均不顯著。見(jiàn)圖9。
圖9 苜蓿根頸可溶性蛋白含量在不同播期下的變化Fig.9 Changes of alfalfa root collar soluble protein content in different sowing time
2.5 苜蓿根頸生理生化指標(biāo)與越冬率的相關(guān)性分析
苜蓿越冬率受其根頸中SOD活性影響的同時(shí)，也受到可溶性蛋白含量的影響，數(shù)據(jù)表明越冬率與二者均顯著正相關(guān)（P＜0.05）；但苜蓿越冬率與苜蓿根頸中POD和CAT活性未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性（表3）。
表3 苜蓿越冬率與根頸抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of alfalfa overwintering rate with antioxidant enzyme activity and soluble protein content in root collar
3 討論
3.1 苜蓿根頸抗氧化酶活性對(duì)播期和低溫脅迫的響應(yīng)
田永雷等［18］研究表明，播種時(shí)期對(duì)紫花苜蓿根頸中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性影響明顯，播種較晚的苜蓿根頸中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性較低，與本研究結(jié)果相同。本研究結(jié)果表明，播期對(duì)苜蓿根頸SOD活性影響顯著，而對(duì)苜蓿根頸CAT和POD活性影響不明顯。根系中的保護(hù)酶活性直接影響紫花苜?？购芰Φ拇笮?，對(duì)于苜?？购Φ奶岣哂刑厥庖饬x［12］。但也有不同結(jié)論，馬周文等［19］研究低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿生理指標(biāo)的影響結(jié)果表明，不同低溫處理下苜蓿體內(nèi)SOD、CAT 活性的變化差異較小。而本研究結(jié)果顯示，苜蓿根頸CAT活性隨處理溫度的降低而降低，說(shuō)明苜蓿根頸CAT活性對(duì)低溫響應(yīng)明顯。羅新義等［20］、鄧雪柯等［21］研究表明，低溫脅迫下苜蓿根頸中SOD活性的提高有利于降低苜蓿自由基對(duì)細(xì)胞膜的損害以提高苜蓿的抗寒性，與本研究結(jié)果一致。前人研究結(jié)果表明［22-24］，POD活性對(duì)植物抗寒性具有積極作用。與馮昌軍等［24］研究結(jié)果部分相同，本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，苜蓿根頸POD活性與越冬率相關(guān)性不顯著，但POD 活性隨處理溫度的降低呈降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，說(shuō)明苜蓿根頸POD活性對(duì)低溫的響應(yīng)是明顯的，當(dāng)苜蓿受低溫脅迫強(qiáng)度較小時(shí)，苜?？梢酝ㄟ^(guò)增強(qiáng)根頸POD活性來(lái)抵御，當(dāng)脅迫溫度超過(guò)苜蓿耐寒極限時(shí)，苜蓿根頸POD活性迅速下降，并逐漸失去活性，造成苜蓿死亡。因此，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性對(duì)苜蓿的抗寒性具有正效作用，然而這種抗氧化酶保護(hù)機(jī)制是有限的，當(dāng)?shù)蜏孛{迫超過(guò)一定范圍時(shí)，苜蓿依然會(huì)受凍害而死亡。
3.2 苜蓿根頸可溶性蛋白含量對(duì)播期和低溫脅迫的響應(yīng)
有研究表明，低溫脅迫下苜蓿根和根頸中可溶性蛋白含量增加［25-28］。杜永吉等［29］、KRASNUK等［14］研究表明，苜蓿根內(nèi)可溶性蛋白含量會(huì)因低溫脅迫程度的增加而提高且達(dá)到差異顯著水平。崔國(guó)文［10］研究結(jié)果則與以上學(xué)者研究結(jié)果不同，在該研究中，苜蓿的抗寒能力強(qiáng)弱并不能與根頸中可溶性蛋白含量產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，在-5～-25 ℃低溫處理間苜蓿根頸中可溶性蛋白含量呈升高-降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，表明苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量與苜蓿抗寒性相關(guān)，且在不同低溫處理下表現(xiàn)不同；本研究相關(guān)性分析結(jié)果亦支持此觀點(diǎn)，低溫脅迫下根頸中可溶性蛋白含量變化很大程度上影響著苜蓿越冬率，而苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量又與播期的推遲顯著負(fù)相關(guān)，即播種越晚則苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量越低；而可溶性蛋白含量與苜蓿越冬率的相關(guān)性極顯著。因此，筆者認(rèn)為播種晚會(huì)造成苜蓿抵御低溫的能力減弱，同時(shí)，在苜蓿抵御低溫過(guò)程中，其根頸可溶性蛋白含量也具有重要作用。
4 結(jié)論
苜蓿根頸中抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量規(guī)律性變化對(duì)苜蓿的抗寒性具有正效作用。夏季早播（7月1日至7月15日）有利于苜蓿安全越冬，苜蓿可以通過(guò)提高根頸抗氧化酶活性來(lái)抵御低溫脅迫。
劉 罡，張慶昕，張玉霞，朱愛(ài)民，陳衛(wèi)東，田永雷
（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)草業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）
苜蓿（Medicago sativaL.）在世界各國(guó)均有種植，種植面積因地而異［1］，因其具有良好的適應(yīng)能力，寒冷地區(qū)和濕熱地區(qū)均有栽培，其秋眠級(jí)越低則越耐寒，反之則抗寒性較弱。自20世紀(jì)50年代起至今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)苜?？购缘难芯枯^多［2-5］，目的是探究苜?？购砑吧瘷C(jī)制，篩選苜?？购颍嘤弋a(chǎn)抗寒的苜蓿品種。苜蓿越冬期根頸會(huì)經(jīng)歷由多種脅迫共同引起的復(fù)雜過(guò)程，當(dāng)脅迫達(dá)到一定程度，會(huì)使苜蓿發(fā)生凍害，嚴(yán)重會(huì)造成苜蓿死亡。相關(guān)研究表明，苜蓿根頸保護(hù)酶活性會(huì)直接影響苜?？购芰Γ?-9］，其中，苜蓿根頸中的部分抗氧化酶能減輕低溫脅迫造成的活性氧分子對(duì)細(xì)胞的損害［10］?？芙ù宓龋?1］、朱愛(ài)民等［12］的研究顯示，在低溫鍛煉期苜蓿根頸中抗氧化酶活性增強(qiáng)。王絳輝等［13］指出，高海拔寒冷地區(qū)苜蓿根系中的抗氧化酶活性較強(qiáng)。苜蓿根頸中抗氧化酶活性與苜?？购悦芮邢嚓P(guān)，且苜蓿根頸中可溶性蛋白含量在不同水平低溫處理下的表現(xiàn)也有所差異。KRASNUK等［14］對(duì)紫花苜?？购缘难芯勘砻?，在苜蓿根內(nèi)可溶性蛋白含量升高過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵影響因素是低溫脅迫程度的增加。WLDNGM等［15］認(rèn)為，在提高植物抗寒性的過(guò)程中，可溶性蛋白含量的增加發(fā)揮了較大作用。在一定低溫條件下，苜蓿會(huì)為抵御低溫脅迫而進(jìn)行自我調(diào)控，但在不同低溫脅迫下，苜蓿發(fā)生的生理、生化反應(yīng)及苜蓿的抗冷閾值等，還有待進(jìn)一步研究。
選擇適合的播種時(shí)期對(duì)于苜蓿的健康生長(zhǎng)及安全越冬具有重要意義［16］。被譽(yù)為“中國(guó)草都”的內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗，該地區(qū)春季風(fēng)沙大、溫度低，不利于苜蓿的春季播種；夏季高溫，過(guò)早播種田間雜草多，過(guò)晚播種苜蓿生長(zhǎng)較弱，不利于安全越冬。因此，通過(guò)對(duì)不同播種時(shí)期的苜蓿做低溫處理，測(cè)定根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量，以翌年苜蓿越冬率為指標(biāo)，探討不同播期對(duì)苜蓿的抗寒性以及越冬能力的影響，為當(dāng)?shù)剀俎０踩蕉峁├碚撝С帧?/p>
1 材料和方法
1.1 試驗(yàn)區(qū)概況
試驗(yàn)于內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗牧草生產(chǎn)基地（42°30′50′′N，115°27′34′′E）進(jìn)行。該地區(qū)年均降水量約375 mm，無(wú)霜期140～150 d，年均風(fēng)速3.0～4.4 m/s，年均氣溫5.5 ℃，≥10 ℃的積溫為3 000～3 200 ℃；試驗(yàn)地土壤主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。
表1 試驗(yàn)地土壤營(yíng)養(yǎng)成分及pHTab.1 Soil nutrient and pH in the test site
1.2 試驗(yàn)材料
供試苜蓿品種為公農(nóng)1號(hào)（Gongnong No.1，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地研究所提供）、騎士T（Knight T，購(gòu)自北京佰青源畜牧業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）、擎天柱（Optimus prime，購(gòu)自北京正道生態(tài)科技有限公司）。
1.3 試驗(yàn)方法
試驗(yàn)于2017 年進(jìn)行，設(shè)4 個(gè)播期，分別為7 月1 日、7 月15 日、8 月1 日、8 月15 日，播種方式為條播。每個(gè)小區(qū)面積為3 m×4 m，隨機(jī)區(qū)組排列，4次重復(fù)，小區(qū)之間有0.5 m過(guò)道，共48個(gè)小區(qū)，不進(jìn)行秋季刈割，土壤凍融期（2017年11月10日）直接對(duì)苜蓿根系取樣。所采樣品4 ℃低溫保存，待低溫處理。
低溫處理試驗(yàn)：參考朱愛(ài)民等［5］采用的試驗(yàn)方法，分別依照5、-5、-10、-15、-20、-25 ℃目標(biāo)溫度對(duì)苜蓿進(jìn)行低溫脅迫處理。以4 ℃/h的速率對(duì)低溫程控箱溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，達(dá)到目標(biāo)溫度后穩(wěn)定保持6 h。完成低溫處理后以4 ℃/h的速率對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行升溫，達(dá)到室溫后取出，并立即進(jìn)行抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的測(cè)定。
1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法
可溶性蛋白含量、過(guò)氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均采用鄒琦［17］生理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方法測(cè)定。越冬率以存活株數(shù)占植株總數(shù)的百分比表示。
1.5 數(shù)據(jù)分析
使用Microsoft Excel 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 播期和低溫處理對(duì)苜蓿根頸抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量的影響
品種、品種+播期、品種+播期+溫度處理對(duì)苜蓿根頸SOD活性、CAT活性、POD活性、可溶性蛋白含量影響均不顯著；播期對(duì)苜蓿根頸SOD活性和可溶性蛋白含量影響極顯著（P＜0.01）；SOD活性、CAT活性和POD活性對(duì)低溫的響應(yīng)較敏感（表2）?？梢?jiàn)播期和溫度處理與苜蓿的抗寒性密切相關(guān)。
表2 處理與超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、可溶性蛋白之間的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between treatment and superoxide dismutase，catalase，peroxidase，soluble protein
2.2 不同播期苜蓿越冬率比較
隨播種時(shí)期的推遲，供試3個(gè)苜蓿品種越冬率均逐漸降低。8月播種的苜蓿越冬率較7月1日播種均顯著降低（P＜0.05）。由于2017年至2018年冬季溫度較低，該地區(qū)苜蓿大面積受到凍害影響，7月1日播種的苜蓿越冬率均不足60.0%。見(jiàn)圖1。
圖1 苜蓿越冬率在不同播期下的變化Fig.1 Changes of overwintering rate of alfalfa in different sowing time
2.3 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影響
2.3.1 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中SOD活性的影響
隨處理溫度的降低，苜蓿根頸SOD活性呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)，其中，苜蓿根頸SOD活性于-15 ℃脅迫下最低，為134.3 U/g；-5、-20 ℃脅迫下根頸SOD活性均顯著大于-15 ℃處理（P＜0.05）；-25 ℃脅迫下根頸SOD活性最高，為209.9 U/g，且顯著高于其他5個(gè)處理（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。
圖2 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中SOD活性變化Fig.2 Changes of SOD activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress
2.3.2 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中CAT活性的影響
隨處理溫度的降低，苜蓿根頸CAT活性呈逐漸降低趨勢(shì)，其中，5、-5 ℃條件下苜蓿根頸CAT活性較高，分別為46.7、42.4 U/（min·g），均顯著高于其他4個(gè)處理（P＜0.05）；-25 ℃條件下苜蓿根頸CAT活性最低，為6.9 U/（min·g），顯著低于其他處理（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。
圖3 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中CAT活性變化Fig.3 Changes of CAT activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress
2.3.3 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中POD活性的影響
隨處理溫度的降低，苜蓿根頸中POD 活性呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢(shì)。5 ℃處理POD 活性為646.7 U/（min·g），顯著高于其他5個(gè)處理（P＜0.05）；在-5、-15 ℃處理下兩者間差異不顯著，分別為506.2、513.8 U/（min·g），顯著大于-20、-25 ℃處理（P＜0.05）；其他3個(gè)處理間苜蓿根頸POD活性差異不顯著。見(jiàn)圖4。
圖4 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中POD活性變化Fig.4 Changes of POD activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress
2.3.4 低溫脅迫對(duì)苜蓿根頸中可溶性蛋白含量的影響
隨處理溫度的降低，苜蓿根頸可溶性蛋白含量呈升高-降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，在-5、-20 ℃時(shí)，分別達(dá)到高峰，-20 ℃條件下顯著大于其他處理（P＜0.05）；在-10、-25 ℃條件下各自達(dá)到一次低峰，分別為16.3、17.0 mg/g，較-5 ℃處理顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。
圖5 不同低溫脅迫下苜蓿根頸中可溶性蛋白含量變化Fig.5 Changes of soluble protein content in alfalfa root collar in different low-temperature stress
2.4 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影響
2.4.1 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸SOD活性的影響
苜蓿根頸SOD 活性對(duì)不同播期處理響應(yīng)不同，其中，7 月播種的苜蓿根頸SOD 活性均偏高，分別為177.7、168.1 U/g，均顯著大于8 月播種的處理（P＜0.05）；8 月1 日和8 月15 日播期處理之間苜蓿根頸中SOD活性差異不顯著。見(jiàn)圖6。
圖6 苜蓿根頸SOD活性在不同播期下的變化Fig.6 Changes of alfalfa root collar SOD activity in different sowing time
2.4.2 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸CAT活性的影響
苜蓿根頸CAT活性在7月15日播種處理中達(dá)到31.3 U/（min·g），在4個(gè)播期中最高，顯著高于8月1日播種處理（P＜0.05），與7月1日播種處理的29.86 U/（min·g）和8月15日播種處理的28.58 U/（min·g）差異不顯著；苜蓿根頸CAT活性在另外3個(gè)播種時(shí)期處理間均無(wú)顯著差異。見(jiàn)圖7。
圖7 苜蓿根頸CAT活性在不同播期下的變化Fig.7 Changes of alfalfa root collar CAT activity in different sowing time
2.4.3 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸POD活性的影響
苜蓿根頸POD 活性在8 月15 日播期處理達(dá)到最高，為524.3 U/（min·g），顯著高于8 月1 日處理（P＜0.05），但與7 月1 日和7 月15 日播期處理間差異不顯著；7 月1 日、7 月15 日和8 月1 日播種的苜蓿根頸中POD 活性差異不顯著。見(jiàn)圖8。
圖8 苜蓿根頸POD活性在不同播期下的變化Fig.8 Changes of alfalfa root collar POD activity in different sowing time
2.4.4 不同播期處理對(duì)苜蓿根頸可溶性蛋白含量的影響
苜蓿根頸可溶性蛋白含量7月1日和7月15日播種處理分別為30.74 mg/g和28.64 mg/g，顯著高于8月份播種的2個(gè)處理（P＜0.05）；而7月1日與7月15日播種處理之間、8月1日與8月15日播種處理之間苜蓿根頸可溶性蛋白含量差異均不顯著。見(jiàn)圖9。
圖9 苜蓿根頸可溶性蛋白含量在不同播期下的變化Fig.9 Changes of alfalfa root collar soluble protein content in different sowing time
2.5 苜蓿根頸生理生化指標(biāo)與越冬率的相關(guān)性分析
苜蓿越冬率受其根頸中SOD活性影響的同時(shí)，也受到可溶性蛋白含量的影響，數(shù)據(jù)表明越冬率與二者均顯著正相關(guān)（P＜0.05）；但苜蓿越冬率與苜蓿根頸中POD和CAT活性未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性（表3）。
表3 苜蓿越冬率與根頸抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of alfalfa overwintering rate with antioxidant enzyme activity and soluble protein content in root collar
3 討論
3.1 苜蓿根頸抗氧化酶活性對(duì)播期和低溫脅迫的響應(yīng)
田永雷等［18］研究表明，播種時(shí)期對(duì)紫花苜蓿根頸中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性影響明顯，播種較晚的苜蓿根頸中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性較低，與本研究結(jié)果相同。本研究結(jié)果表明，播期對(duì)苜蓿根頸SOD活性影響顯著，而對(duì)苜蓿根頸CAT和POD活性影響不明顯。根系中的保護(hù)酶活性直接影響紫花苜?？购芰Φ拇笮?，對(duì)于苜?？购Φ奶岣哂刑厥庖饬x［12］。但也有不同結(jié)論，馬周文等［19］研究低溫脅迫對(duì)紫花苜蓿生理指標(biāo)的影響結(jié)果表明，不同低溫處理下苜蓿體內(nèi)SOD、CAT 活性的變化差異較小。而本研究結(jié)果顯示，苜蓿根頸CAT活性隨處理溫度的降低而降低，說(shuō)明苜蓿根頸CAT活性對(duì)低溫響應(yīng)明顯。羅新義等［20］、鄧雪柯等［21］研究表明，低溫脅迫下苜蓿根頸中SOD活性的提高有利于降低苜蓿自由基對(duì)細(xì)胞膜的損害以提高苜蓿的抗寒性，與本研究結(jié)果一致。前人研究結(jié)果表明［22-24］，POD活性對(duì)植物抗寒性具有積極作用。與馮昌軍等［24］研究結(jié)果部分相同，本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，苜蓿根頸POD活性與越冬率相關(guān)性不顯著，但POD 活性隨處理溫度的降低呈降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，說(shuō)明苜蓿根頸POD活性對(duì)低溫的響應(yīng)是明顯的，當(dāng)苜蓿受低溫脅迫強(qiáng)度較小時(shí)，苜?？梢酝ㄟ^(guò)增強(qiáng)根頸POD活性來(lái)抵御，當(dāng)脅迫溫度超過(guò)苜蓿耐寒極限時(shí)，苜蓿根頸POD活性迅速下降，并逐漸失去活性，造成苜蓿死亡。因此，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性對(duì)苜蓿的抗寒性具有正效作用，然而這種抗氧化酶保護(hù)機(jī)制是有限的，當(dāng)?shù)蜏孛{迫超過(guò)一定范圍時(shí)，苜蓿依然會(huì)受凍害而死亡。
3.2 苜蓿根頸可溶性蛋白含量對(duì)播期和低溫脅迫的響應(yīng)
有研究表明，低溫脅迫下苜蓿根和根頸中可溶性蛋白含量增加［25-28］。杜永吉等［29］、KRASNUK等［14］研究表明，苜蓿根內(nèi)可溶性蛋白含量會(huì)因低溫脅迫程度的增加而提高且達(dá)到差異顯著水平。崔國(guó)文［10］研究結(jié)果則與以上學(xué)者研究結(jié)果不同，在該研究中，苜蓿的抗寒能力強(qiáng)弱并不能與根頸中可溶性蛋白含量產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，在-5～-25 ℃低溫處理間苜蓿根頸中可溶性蛋白含量呈升高-降低-升高-降低的變化趨勢(shì)，表明苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量與苜蓿抗寒性相關(guān)，且在不同低溫處理下表現(xiàn)不同；本研究相關(guān)性分析結(jié)果亦支持此觀點(diǎn)，低溫脅迫下根頸中可溶性蛋白含量變化很大程度上影響著苜蓿越冬率，而苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量又與播期的推遲顯著負(fù)相關(guān)，即播種越晚則苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量越低；而可溶性蛋白含量與苜蓿越冬率的相關(guān)性極顯著。因此，筆者認(rèn)為播種晚會(huì)造成苜蓿抵御低溫的能力減弱，同時(shí)，在苜蓿抵御低溫過(guò)程中，其根頸可溶性蛋白含量也具有重要作用。
4 結(jié)論
苜蓿根頸中抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量規(guī)律性變化對(duì)苜蓿的抗寒性具有正效作用。夏季早播（7月1日至7月15日）有利于苜蓿安全越冬，苜蓿可以通過(guò)提高根頸抗氧化酶活性來(lái)抵御低溫脅迫。
