阿如熱，蘇如那，于紅珍，白 麗，付明海

（1.國家藥監(jiān)局中藥（蒙藥）質(zhì)量控制重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；3.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571199；4.中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081）

蒙醫(yī)學(xué)是一門古老而具有豐富理論體系和實踐經(jīng)驗的優(yōu)秀傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，也是蒙古民族長期在醫(yī)療實踐中與疾病斗爭的經(jīng)驗總結(jié)。體質(zhì)是由先天遺傳和后天獲得所形成的，是指在先天稟賦和后天獲得的基礎(chǔ)上所形成的生理功能和心理狀態(tài)。人的體態(tài)、相貌、胖瘦、胃火、消化功能、智慧、舉止、性格等各有差異，因此各有特性［1-3］。體質(zhì)特性取決于父母先天特性、環(huán)境影響以及體內(nèi)赫依、希拉、巴達干所含的比例。蒙醫(yī)理論認為，將人體體質(zhì)分為赫依型、希拉型、巴達干型、赫依希拉混合型、赫依巴達干混合型、希拉巴達干混合型、聚合型（赫依、希拉、巴達干三根聚合）等七種類型，其中尤以聚合型體質(zhì)最佳。體質(zhì)特性與父母的體質(zhì)特性遺傳密切相關(guān)，并且與胚胎發(fā)育過程中母親的飲食生活條件有著緊密聯(lián)系［4-5］，即以赫依、希拉、巴達干三者的哪個為主，其秉性特征表現(xiàn)就可突出體現(xiàn)于人體上，例如，赫依型體質(zhì)特性者主要表現(xiàn)為體態(tài)瘦小、膚色青灰、胃火不平、多言、行動輕盈，嗜好甘、酸、咸、辛味和熱性飲食；希拉型體質(zhì)特性者表現(xiàn)為體態(tài)中等、膚色及毛發(fā)微黃、胃火銳、耐寒、消化功能強、反應(yīng)敏銳、多汗等，嗜好甘、苦、澀味及涼性飲食；巴達干型體質(zhì)特性者表現(xiàn)為體態(tài)高大、身體肥胖、胃火鈍、耐熱、嗜睡、行動緩慢、性情溫柔等，嗜好辛、酸、咸味和糙性飲食；赫依希拉混合型、赫依巴達干混合型及希拉巴達干混合型體質(zhì)特性者可體現(xiàn)兩種體質(zhì)的秉性特征；聚合型體質(zhì)特性者可體現(xiàn)三根均衡的秉性特征［1，6］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，蒙醫(yī)三種基本體質(zhì)對健康人群血常規(guī)和血液流變個別指標(biāo)影響較大，且不同體質(zhì)人群中胃動素和胃泌素水平存在較大差異［7］，使赫依、希拉、巴達干三種基本體質(zhì)人員在形態(tài)結(jié)構(gòu)、性格特點及生理機能等方面都表現(xiàn)出顯著個體差異，成為辨別體質(zhì)類型的重要指標(biāo)。筆者通過對蒙醫(yī)三種體質(zhì)人群的尿常規(guī)、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、腸道菌群結(jié)構(gòu)差異等的分析，進一步為蒙醫(yī)體質(zhì)科學(xué)判定及蒙醫(yī)臨床個體化用藥提供科學(xué)依據(jù)；探討腸道菌群與蒙醫(yī)體質(zhì)的相關(guān)性，為蒙醫(yī)體質(zhì)現(xiàn)代研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院2018—2021屆18～25歲蒙古族本科生志愿者進行體質(zhì)判定。納入標(biāo)準：神智正常、無病史、行為配合、自愿受試并在研究開始前均簽署知情同意書的受試者；排除標(biāo)準：去掉混合體質(zhì)者，年齡小于18歲或者是大于25歲的受試者，填寫問卷項目不完整、有疾病的受試者（如：有遺傳病、先天性疾病、傳染病、肥胖者等），未在知情同意書上簽字的受試者，女生處于經(jīng)期者。本研究內(nèi)容已通過《內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會》倫理審查評議，倫理批件號為：NM-LL-2021-06-15-1。

1.2 體質(zhì)判定

1.2.1 判定方法

根據(jù)《額氏蒙醫(yī)體質(zhì)分類與判定評分表》，圍繞蒙醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論［3］對于赫依、希拉、巴達干三種基本體質(zhì)特征描述分別設(shè)問卷內(nèi)容。給每一位自愿受試者發(fā)放問卷表，填寫問卷內(nèi)容及姓名、性別、年齡、民族、健康狀況或病史、聯(lián)系方式等基本信息，對填寫表格的學(xué)生誠信度做判斷。學(xué)生完成問卷打分后，初步篩選出赫依、希拉、巴達干及聚合型體質(zhì)志愿者。最后，由蒙醫(yī)臨床專家結(jié)合打分結(jié)果經(jīng)“望”“問”“觸”三診方法最終確定受試者。

1.2.2 判定標(biāo)準

依據(jù)《額氏蒙醫(yī)體質(zhì)分類與判定評分表》對受試者進行體質(zhì)判定。判定評分表中，赫依、希拉、巴達干偏盛體質(zhì)者各有18個選項，總共有54個選項（表1）。54個選項中每人必選18個選項，每項記1分，3組分別計算總得分以及百分比。每2個體質(zhì)者相差小于33.33%的看作為聚合型體質(zhì)者，最高值和其余2型的相差均高于33.33%的視為單一體質(zhì)者，余視為混合型體質(zhì)者。

表1 額氏蒙醫(yī)體質(zhì)特性判定表Tab.1 Evaluation table of E’s Mongolian medicine physical constitution characteristics

1.3 樣本的測定

1.3.1 尿樣采集

受試者采集樣本前1天不吃高脂類食品，不飲酒，不過度勞累，采集前空腹，不解小便，女生在經(jīng)期不做尿常規(guī)。采用一次性專用塑料尿杯接中段尿液30～50 mL，迅速送往通遼市科爾沁區(qū)健安醫(yī)院體檢中心，使用自動尿液分析儀BT-200進行尿常規(guī)檢測分析。

1.3.2 糞便樣品采集

受試者在采樣前1個月禁止服用胃腸動力類藥品、各類抗生素和微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等引起腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境改變的藥品或食品。受試者于門診采集新鮮自然排出的糞便約3 g，裝入10 mL 大便采集管中，置于-80 ℃儲存、備用。

1.3.3 實驗儀器

電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），冷凍離心機（Multifuge X1R.Thermo Scientific），NovaSeq 6000測序儀（USA ILLumina），Qubit2.0 DNA 蛋白定量儀（賽默飛世爾科技有限公司），Agilent 5400 全自動毛細管電泳儀。

1.3.4 16S rRNA測序

采用試劑盒提取樣本中DNA后，在1∶100瓊脂糖凝膠上檢測DNA含量和純度。根據(jù)濃度，用無菌敷料水稀釋DNA。使用特異性條形碼引物（341F-806R 為F：CCTAYGGGRBGCASCAG，R：GGACTACNNGGGTATCTAAT）擴增16S V3+V4區(qū)。

PCR反應(yīng)使用0.2 μL正向和反向引物以及約10 ng的模板DNA高保真PCR預(yù)混液（New England Biolabs）。循環(huán)過程包括在98 ℃初始變性1 min，然后再在98 ℃變性30 s，在50 ℃退火30 s以及在72 ℃延伸30 s的30個循環(huán)。將等容積的緩沖液（包含SYB綠色染料）和PCR產(chǎn)物以等比例混勻，并在2∶100瓊脂糖的凝膠材料上通過電泳以完成測定。然后，用德國Qiagen凝膠材料提取檢測試劑盒（德國Qiagen）純化混合物的PCR產(chǎn)品，再使用美國Illumina公司的TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫檢測試劑盒完成文庫的建設(shè)，對建好的文庫實行Qubit定量和文庫測試，合格后使用NovaSeq 6000上機測試。

對檢測后所得的原始數(shù)據(jù)（Raw Data）進行拼接、篩選，獲得修飾統(tǒng)計數(shù)據(jù)（Clean Data）。再進行OTUs（Operational taxonomic units）聚集和生物類型解析，依據(jù)OTUs聚集結(jié)果，對各個OTU的代表順序做生物標(biāo)注，得出相應(yīng)的種類統(tǒng)計信息和基于種類的豐度分布。同時，對OTUs 采用豐度、Alpha 多樣性統(tǒng)計、Venn圖等分析，以獲得樣本內(nèi)生物富集度和均勻度統(tǒng)計信息。分別在各個類別水平（以門、屬為主）上，統(tǒng)計各樣本的信息種群組成。依據(jù)OTU及其聚類的分析結(jié)果和分類學(xué)相關(guān)信息，在各水平上開展對菌群構(gòu)成的統(tǒng)計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）及群落組成分析等。

1.4 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 8.0.2進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。各分析指標(biāo)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準差（xˉ±s）表示。方差分析方法用于多組間比較，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種基本體質(zhì)人群生理指標(biāo)分析

本研究共調(diào)查了283人，平均年齡為21歲，發(fā)放問卷回收率為100%，其中，赫依體質(zhì)者24人（8%），希拉體質(zhì)者57人（20%），巴達干體質(zhì)者13人（5%），聚合型體質(zhì)者42人（15%），剩余147人（52%）為混合型體質(zhì)者。從各體質(zhì)人群中隨機抽取12人分配到各個不同體質(zhì)組中，男女各半。

各受試者其尿液pH均在5.5～7.5正常范圍內(nèi)，組間無顯著差異。尿蛋白（PRO）、尿糖（GLU）、膽紅素（BI）、維生素C及尿酮（KET）均為陰性。赫依組、希拉組、巴達干組、聚合型組等各組間比較無顯著性差異（表2）。

表2 各組BMI及尿常規(guī)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of BMI and urine routine indexes in each group

根據(jù)各體質(zhì)受試者身高（m）與體質(zhì)量（kg），按BMI=體質(zhì)量（kg）/身高2（m2）公式計算其BMI。表2結(jié)果顯示，巴達干組與希拉組和聚合型組比較，BMI值顯著增高（P＜0.05）；赫依組BMI值顯著高于希拉組（P＜0.05）。

2.2 腸道菌群物種進化樹分析

通過多序列比對獲得top100屬的代表順序，繪制進化樹，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)細菌的進化途徑分支主要集中在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、廣古菌門（Euryarchaeota）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、梭桿菌門（Fusobacteriota）等8種菌門，其中厚壁菌門（Firmicutes）物種相對豐度最高，其次是擬桿菌門（Bacteroidota）和變形菌門（Proteobacteria）（圖1）。

圖1 各體質(zhì)組腸道菌群物種系統(tǒng)發(fā)育圖Fig.1 Gut microflora phylogenetic map of different physical constitution groups

2.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映個體菌群的生物多樣性。腸道菌群生物多樣性主要以ACE、Chao1、Observed-species、PD-whole-tree、Simpson和Shannon指數(shù)等來反映。如圖2所示，Observed-species、ACE和Chao1指數(shù)在赫依、希拉、巴達干三種單型體質(zhì)組顯著高于聚合型組（P＜0.05）。PD-whole-tree指數(shù)中，赫依和希拉組顯著高于聚合型組（P＜0.05）。Shannon 和Simpson 指數(shù)在4組間比較無顯著差異。以上結(jié)果提示，赫依組、希拉組、巴達干組與聚合型組相比，腸道菌群群落豐度發(fā)生了顯著變化。

圖2 Alpha多樣性指數(shù)圖Fig.2 Index charts of Alpha diversity

2.4 OTU數(shù)及Beta多樣性分析

腸道菌群分析結(jié)果共獲得2 583 203 條原始reads，平均長度為414 bp。經(jīng)質(zhì)控過濾后，平均每個樣本得到80 045個有效數(shù)據(jù)。經(jīng)聚類分析，共鑒定出2 536個OTU，獲得了40門、286科、465屬的微生物群落信息。維恩圖顯示，在2 536個OTU的總豐度中，4組重疊共有OTU 386個。赫依、希拉、巴達干3組與聚合型組之間單獨重疊OTU 數(shù)依次為178、133、18（圖3A）。該結(jié)果說明，三種基本體質(zhì)組與聚合型組OTU相似度依次為赫依組＞希拉組＞巴達干組。

圖3 OTU（A）及Beta多樣性（B～D）分析圖Fig.3 Analysis charts of OTU（A）and Beta diversity（B-D）

Beta多樣性反映生物復(fù)雜性的差別程度，利用該指數(shù)得到的分析圖中距離越大表示樣本間的差異越大。PCoA分析技術(shù)用于研究樣品群體構(gòu)成的相似之處或不同，每個點代表一個樣品，點和點之間的相距越大表示樣品間菌群構(gòu)成差異性越大。4組PCoA分布出現(xiàn)明顯分離（圖3B），其中，聚合型組與其他3組相比分離度最大，說明其菌群構(gòu)成與三種基本體質(zhì)組差異較大。此外，隨著樣品測序量的增加，稀薄曲線達到平臺，趨于飽和，物種數(shù)量不再線性或快速增加，表明測序數(shù)據(jù)量合理（圖3C）。4組斜率的秩豐度呈現(xiàn)一致的趨勢，說明測序深度足以反映群落的微生物多樣性（圖3D）。

2.5 各組菌落結(jié)構(gòu)分析

各組受試者10種門水平腸道菌落中，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）的相對豐度最高，約占75%；而在屬水平腸道菌落中，糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、普氏菌屬（Prevotella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）4種菌屬占比最高，約占50%（圖4）。

圖4 門和屬水平群落分析圖Fig.4 Analysis charts of gut microflora at phylum and genus level

不同體質(zhì)組間特征菌落存在顯著差異（圖5）。在門水平上，赫依組擬桿菌門（Bacteroidota）顯著高于聚合型組（P＜0.05），而變形菌門（Proteobacteria）在巴達干組顯著高于赫依組（P＜0.05）。在屬水平上，赫依組與巴達干組相比，巨單胞菌屬（Megamonas）和埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）在2 組間存在顯著差異（P＜0.05）；希拉組與巴達干組相比，普氏菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides）在2組間具有顯著差異（P＜0.05）；擬桿菌屬（Bacteroides）在希拉組中表達顯著高于聚合型組（P＜0.01）；糞桿菌屬（Faecalibacterium）在巴達干組表達顯著低于聚合型組（P＜0.05）。

圖5 各組間特征菌落差異Fig.5 Differences of characteristic microflora among groups

2.6 功能預(yù)測

在Level2水平上，赫依組、希拉組、巴達干組和聚合型組等4組中豐度排序靠前的特征功能信息包括藥物抵抗（Drug resistance）、脂肪代謝（Lipid metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、免疫系統(tǒng)（Immune system）等，說明不同體質(zhì)人群在營養(yǎng)代謝、藥物耐受和免疫功能方面存在較大差異（圖6）。

圖6 各組間特征Tax4Fun功能預(yù)測Fig.6 Tax4Fun functional prediction among different groups

3 討論

體質(zhì)是人體生理和心理與生俱來的特性［8］。蒙醫(yī)理論將人的體質(zhì)分為七種，其中，赫依、希拉、巴達干為主的單一體質(zhì)稱為三種基本體質(zhì)。赫依體質(zhì)人群嗜甘、酸、咸、辛食物之品，根據(jù)胃火不均特點，宜食易消化飲食；希拉體質(zhì)人群嗜甘、苦、澀食物之品，根據(jù)胃火旺盛特點，應(yīng)少服用具有土源、重效的飲食；巴達干體質(zhì)人群嗜辛、酸、咸食物之品，根據(jù)腹堅特點，宜食溫?zé)嵝暂p的易消化食物［9-10］。因此，筆者選擇蒙古族年輕人群（18～25歲）為受試者，結(jié)合《額氏蒙醫(yī)體質(zhì)分類與判定評分表》和蒙醫(yī)三診方法判定受試者基本體質(zhì)，對其腸道菌群結(jié)構(gòu)差異進行了分析，為蒙醫(yī)基本體質(zhì)判定和臨床個體化用藥提供科學(xué)依據(jù)。

腸道菌群被稱為調(diào)控人體的“第二基因組”，在人類預(yù)防和治療疾病中的作用逐漸被重視［11］。本研究中Alpha 多樣性和Beta多樣性分析結(jié)果表明，三種基本體質(zhì)及聚合型體質(zhì)人群之間菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，其中，赫依組擬桿菌門（Bacteroidota）顯著高于聚合型組，其與代謝性疾病呈負相關(guān)，它也是腸道菌群中的主要菌群，有促進腸道黏膜血管的形成、維持腸道生態(tài)平衡的作用［12］。從擬桿菌門的變化來看，各體質(zhì)組相對豐度按高低排序依次為赫依組＞希拉組＞巴達干組＞聚合型組?？梢姼黧w質(zhì)組因個體差異所導(dǎo)致擬桿菌門的豐度不同。Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果顯示，巴達干組的豐度和多樣性降低，與以往文獻報道的長期高脂飲食能降低腸道菌群物種的豐富性以及多樣性相一致［13-14］。變形菌（Proteobacteria）外膜有脂多糖，使人體內(nèi)脂肪沉積增加，致使人肥胖［15］。因此，巴達干體質(zhì)人群體重和BMI值顯著高于其余組，可能與變形菌表達較高相關(guān)。同樣，巨單胞菌屬（Megamonas）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、普氏菌屬（Prevotella）與碳水、氨基酸以及脂肪代謝密切相關(guān)，并與體重和BMI呈正相關(guān)［16-18］。糞桿菌屬（Faecalibacterium）是有益菌，與免疫功能密切相關(guān)，對人體健康起到重要作用［19］。此外，功能預(yù)測結(jié)果提示，不同體質(zhì)人群腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異化導(dǎo)致了對藥物的耐受和抵抗機制不同［20］，進一步表明對不同體質(zhì)患者實施個體化用藥的重要性和科學(xué)性。

4 結(jié)論

筆者從蒙醫(yī)學(xué)角度對三種基本體質(zhì)人群腸道菌群進行了分析，發(fā)現(xiàn)不同體質(zhì)人群腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，且與調(diào)節(jié)多種營養(yǎng)物質(zhì)代謝、免疫功能和藥物耐受等重要生理功能密切相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為蒙醫(yī)體質(zhì)科學(xué)判定和臨床個體化用藥提供科學(xué)依據(jù)。