盧 麗，周承哲，徐 凱，張孟聰，溫圣菁，段淋淵，田采云，石碧瀅，張 波,*，郭玉瓊,3,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002；3.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院（數(shù)字經(jīng)濟學(xué)院），福建 泉州 362400）

枸杞葉（Lyciumleaves）是茄科枸杞屬植物的嫩葉。據(jù)《本草綱目》記載，枸杞葉名“天精草”，是常用的中藥材和保健食品原料，主要產(chǎn)自寧夏、河北、甘肅、青海、新疆等地區(qū)[1]。枸杞葉和枸杞果實營養(yǎng)成分基本一致，富含氨基酸[2]、多酚、黃酮[3]、多糖等代謝物，但其蛋白質(zhì)、纖維、氨基酸、鐵和鈣等含量比枸杞果實中豐富[4]。同時，枸杞葉具有降血糖、抗氧化[5-6]、除煩益志[7]、清熱解毒、益精明目、延緩衰老等功效[8]。研究表明，枸杞葉茶中鐵含量高于觀音王和龍井茶，可補充人體需要的微量元素[9]。在我國和東南亞地區(qū)，枸杞葉被廣泛用作茶、蔬菜和中草藥；此外，在歐洲和北美地區(qū)，枸杞葉作為功能性茶或膳食補充劑被高度重視[10]。

枸杞作為寧夏特色產(chǎn)品，分為果用枸杞和葉用枸杞，其中，葉用枸杞是后期培育出的新品種，不開花、不結(jié)果、富含大量營養(yǎng)成分[11]。葉用枸杞的開發(fā)利用改變了構(gòu)杞種植業(yè)結(jié)構(gòu)單一的現(xiàn)狀，可作為藥用[12]、茶用[13]、菜用[14-16]和飼用。近年來，國際市場對特種茶需求強勢增長，枸杞茶作為一款新型茶品極具特色，且有很大市場空間。枸杞茶是在綠茶加工工藝基礎(chǔ)上，結(jié)合枸杞葉茶工藝制成[17]，其品質(zhì)鑒定處于起步階段，尤其關(guān)于茶湯滋味屬性與主要呈味化合物相關(guān)性方面研究較少。目前，感官評價、成分分析和新興技術(shù)是茶葉質(zhì)量評價的主要技術(shù)方法[18]。其中，感官評價具有方便、直觀、快捷等特點[19]，是消費者最易獲取茶葉品質(zhì)評價的一種方法。代謝組學(xué)是研究生物樣品中小分子代謝產(chǎn)物的方法，用于分析小分子質(zhì)量的非揮發(fā)性化合物，如氨基酸、糖類、核苷酸和有機酸等，已被廣泛應(yīng)用于食品研究中[20]。已有研究表明，應(yīng)用代謝組學(xué)對茶葉風(fēng)味成分進行鑒定，可以測定數(shù)百種內(nèi)源性代謝物[21-25]。而代謝組學(xué)和感官評價相結(jié)合有助于更加清晰地了解茶葉滋味屬性與關(guān)鍵成分的相關(guān)性[26]。目前，通過感官評價和代謝組學(xué)技術(shù)對葉用枸杞茶感官品質(zhì)和代謝物的研究較少。

鮮葉質(zhì)量作為茶葉品質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，其所含成分的豐富程度是影響茶葉質(zhì)量的重要因素之一，其中茶葉滋味受鮮葉中代謝物的影響顯著[27-28]。因此，本研究以26 個品種（系）葉用枸杞芽葉干樣及鮮葉為材料，通過感官評價、代謝組學(xué)方法并結(jié)合多元統(tǒng)計分析對26 個品種（系）葉用枸杞芽葉的感官品質(zhì)和非揮發(fā)性成分進行系統(tǒng)分析，探究葉用枸杞茶滋味特征及滋味成分與滋味屬性間的關(guān)系。以期為葉用枸杞茶滋味特征的科學(xué)評價提供參考，為優(yōu)良葉用枸杞芽茶適制品種（系）選育或資源利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

26 個品種（系）葉用枸杞芽葉于2022年6月8日取自國家枸杞種質(zhì)資源圃（位于寧夏回族自治區(qū)銀川市西夏區(qū)蘆花臺試驗地，東經(jīng)106°09′、北緯38°39′）。樣品信息如表1所示。

表1 26 個品種（系）葉用枸杞芽葉樣品信息Table 1 Twenty-six cultivars (lines) of Lycium barbarum tested in this study

甲醇（純度≥99.0%）、乙腈（純度≥99.9%）美國Thermo Fisher Scientific公司；2-氯-L-苯丙氨酸（純度98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（色譜級）日本TCI公司；甲酸銨（純度≥99.9%）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish超高效液相色譜儀、Q Exactive質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞芽葉處理

將采集的葉用枸杞芽葉（自頂端向下長度4.0～4.5 cm）等分為2 部分。

第1部分用熱風(fēng)固樣處理：取100 g鮮葉置于烘焙提香機，于120 ℃殺青10 min，后取出攤晾；然后90 ℃烘干，制成原料干樣樣品。

第2部分用于代謝組測定：使用液氮固樣，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測；每次取樣進行3 次重復(fù)，代謝組數(shù)據(jù)分析由蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.2 葉用枸杞芽干樣感官評價

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[29]及DBS 64/684—2022《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 枸杞葉茶》[30]方法，由具有評茶員資質(zhì)（評茶員三級及以上）的5 名專業(yè)人員（2 男3 女，年齡21～56 歲）對原料干樣的外形、湯色、香氣、滋味和葉底進行評價。外形從形狀、色澤和勻整度方面進行評價；稱取3 g原料干樣，用150 mL沸水沖泡5 min，對湯色、香氣、滋味品質(zhì)進行評價；葉底放置于葉底盤進行評價。結(jié)果采用評語與評分形式展示，并按照加權(quán)法進行評分：總分＝外形×20%+湯色×5%+香氣×30%+滋味×35%+葉底×10%。同時對原料干樣滋味屬性（醇、厚、鮮、甜、苦味）進行強度評分（10 分制），0 分為強度最低，10 分為強度最高。每個小組成員對每個樣本進行3 次評估。

1.3.3 葉用枸杞芽代謝物測定

代謝物提取[31]：稱取（200.00±0.01）mg待測樣品，加入0.6 mL 4 mg/L 2-氯-L-苯丙氨酸-甲醇，渦旋振蕩30 s、研磨90 s；室溫超聲15 min；12 000 r/min、4 ℃離心10 min；取上清液200 μL，使用0.22 μm濾膜過濾，過濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，置于-20 ℃冰箱保存，每次實驗進行3 次重復(fù)。

使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）儀對代謝物進行測定。

LC條件[32]：使用ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），流速0.25 mL/min、柱溫4 0 ℃、進樣量2 μ L。正離子模式，流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，流動相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脫程序為：0～1 min，2%流動相B；1～9 min，2%～50%流動相B；9～12 min，50%～98%流動相B；12～13.5 min，98%流動相B；13.5～14 min，98%～2%流動相B；14～20 min，2%流動相B。負(fù)離子模式，流動相C為5 mmol/L甲酸銨溶液，流動相D為乙腈，梯度洗脫程序為：0～1 min，2%流動相D；1～9 min，2%～50%流動相D；9～12 min，50%～98%流動相D；12～13.5 min，98%流動相D；13.5～14 min，98%～2%流動相D；14～17 min，2%流動相D。

MS條件[33]：電噴霧電離源，正負(fù)離子電離模式，正離子模式噴霧電壓3.50 kV、負(fù)離子模式噴霧電壓2.50 kV、鞘氣壓力30 arb、輔助氣壓力10 arb、毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率70 000進行一級全掃描，掃描范圍為m/z100～1 000，并采用高能誘導(dǎo)裂解（higher energy collision induced dissociation，HCD）技術(shù)進行二級裂解，碰撞能量為30 eV、二級分辨率為17 500，采集信號前10離子進行碎裂，同時采用動態(tài)排除去除無必要的串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）信息。

質(zhì)量控制（quality control，QC）[34]：從提取好的待測樣本中取部分混合成QC樣本，并采用與分析樣本相同的方法處理和檢測，重復(fù)3 次。每10 個檢測分析樣本中插入1 個QC樣本，以監(jiān)測整個分析過程的重復(fù)性。采用RXCMS軟件包[35]對質(zhì)譜分析后獲得的原始數(shù)據(jù)進行峰檢測、峰過濾和峰對齊處理。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2021軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；TBtoolsV1.046軟件進行熱圖繪制；使用在線數(shù)據(jù)分析平臺（https://www.biodeep.cn/）進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）富集分析及繪制樹狀圖；使用SPSS 26軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析；使用SIMCA Version 14.1軟件進行偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），采用隨機200 次置換檢驗判別該模型的有效性和可靠性，變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）大于1為標(biāo)準(zhǔn)篩選重要變量；Origin 2021軟件繪制雷達圖和餅圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉用枸杞芽的感官評價結(jié)果

為明確葉用枸杞芽的品質(zhì)特征，對26 個品種（系）葉用枸杞芽原料干樣外形、湯色、香氣、滋味和葉底進行感官審評（表2、圖1A）。結(jié)果表明：26 種葉用枸杞芽干茶外形成朵形、黃綠、輕飄、較勻整；湯色橙黃明亮；香氣呈現(xiàn)甜香、枸杞香、草藥香；滋味呈現(xiàn)醇厚、清甜鮮爽；葉底多為紅褐，肥厚軟亮。綜合得分最高的前10 個樣品為N1、N9、Z30、Z62、Z68、Z29、Q3、Z90、Z20和Z88。參考滋味感官術(shù)語，總結(jié)出鮮、醇、厚、甜和苦5 個滋味描述詞用來描述葉用枸杞芽干樣的滋味特點。如圖1B所示，葉用枸杞芽干樣的厚、甜和鮮滋味屬性距離原點較遠(yuǎn)，說明整體以厚、甜和鮮3 種滋味屬性為主，表現(xiàn)為內(nèi)含物豐富、口感柔和、帶有鮮甜味。

圖1 葉用枸杞芽的感官評價結(jié)果Fig.1 Sensory evaluation results of Lycium barbarum buds

表2 葉用枸杞芽的感官評分Table 2 Sensory evaluation scores of Lycium barbarum buds

2.2 葉用枸杞芽的總體代謝物分析結(jié)果

為探明葉用枸杞芽葉內(nèi)源代謝物的差異，利用LC-MS技術(shù)對26 個品種（系）葉用枸杞芽（圖2A）進行測定并分析，其正負(fù)離子模式下重疊的總離子流圖信號強、峰容量大且分離度高（圖2B、C）。去除冗余和噪聲信號，通過質(zhì)荷比（m/z）進行代謝物注釋，共測到22 548 個代謝信號，表明檢測到的數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。其中26 個品種（系）葉用枸杞芽共有6 459 個代謝信號，構(gòu)建樹狀圖，由圖2D可知：將26 個品種（系）葉用枸杞芽分為3 類，第1類為Z29、Z20、Z99、Z30、Z92、Z85、Z95、Z90、Z82、Z68、Z77和Z56；第2類為N1、N9、Q6-13、Z63、Z32、Q3、Z48、Z58和Z9；第3類為Z88、GY、GJ、T3和Z62。

圖2 葉用枸杞芽葉表型和總體代謝物分析Fig.2 Phenotypes and metabolite profiles of Lycium barbarum buds and leaves

2.3 差異代謝物分析結(jié)果

2.3.1 差異代謝物篩選

對代謝組數(shù)據(jù)進行定性和定量分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、準(zhǔn)確質(zhì)量、質(zhì)譜、保留時間、代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻[36-41]檢索，由圖3A、B可知，26 個品種（系）葉用枸杞芽共鑒定出879 種代謝物，包括生物堿57 種、氨基酸及其衍生物164 種、糖類77 種、黃酮79 種、木脂素和香豆素12 種、核苷酸及其衍生物47 種、脂類73 種、有機酸73 種、酚酸67 種、萜類33 種和其他197 種。由圖3C可知，將26 個品種（系）葉用枸杞分為3 類，與采用代謝組數(shù)據(jù)構(gòu)建的樹狀圖分類一致，其擬合參數(shù)為＝0.975，Q2＝0.947。由圖3D可知，200 次置換檢驗顯示R2和Q2截距分別為0.82和-0.41，證明PLS-DA模型可靠。通過PLS-DA和方差分析共篩選到211 種代謝物在不同品種（系）葉用枸杞芽間差異顯著（VIP＞1、P＜0.05）。

圖3 26 個品種（系）葉用枸杞芽代謝物多元統(tǒng)計分析Fig.3 Multivariate statistical analysis of metabolites in 26 cultivars (lines) of Lycium barbarum buds

2.3.2 差異代謝物分布情況

為研究代謝產(chǎn)物與不同品種（系）葉用枸杞之間的相關(guān)性，對26 個品種（系）葉用枸杞芽葉211 個差異代謝物進行PLS-DA雙標(biāo)圖分析。由圖4可知，第1類品種（Z29、Z20、Z99、Z30、Z92、Z85、Z95、Z90、Z82、Z68、Z77、Z56）分布在雙標(biāo)圖上方，4-羥基香豆素（M286）、N-乙酰組胺（M797）、β-D-葡萄糖1-磷酸（M731）、花翠素-3,5-二糖苷（M283）、枸橘苷（M276）、異牡荊黃素（M258）、D-葡萄糖-6-磷酸（M646）、蝦青素（M572）、(9S,10E,12Z)-9-羥基十八碳-10,12-二烯酸（9S-hydroperoxy-(10E,12Z,15Z)-octadecatrienoic acid，9(S)-HODE，M328）、12-氧代-十醚（12-oxo-5Z,8Z,10E,14Zeicosatetraenoic acid，12-oxo-ETE，M694）、乙酰膽堿（M424）、肉豆蔻酸（M312）、橄欖苦苷（M877）分布在PLS-DA 雙標(biāo)圖上方，表明這些化合物在第1類品種中含量更豐富。第2類品種（N1、N9、Q6-13、Z63、Z32、Q3、Z48、Z58、Z9）分布在雙標(biāo)圖左下方，精胺（M40）、海藻糖（M203）、蜜糖醇（M732）、亞洲酸（M571）、N-乙酰-D-半乳糖胺（M198）、N5-甲基-L-谷氨酰胺（M838）、N-乙酰-L-谷氨酰胺（M117）、二硫蘇糖醇（M23）、葡萄糖酸（M196）、α-姜黃烯（M825）、N-乙酰鳥氨酸（M783）、13-氧代-十八碳二烯酸（13-oxooctadecadienoic acid，13-oxo-ODE，M330）、亞精胺（M96）、石竹素（M826）、N-甲基酪胺（M599）、畢澄茄烯（M827）、鳥氨酸（M89）、油酸（M324）等分布在PLS-DA雙標(biāo)圖的左下區(qū)域，表明這些化合物在第2類品種中含量較高。第3類品種（Z88、GY、GJ、T3、Z62）分布在雙標(biāo)圖的右下方，N-甲基色胺（M30）、α-乳糖（M723）、花青素（M174）、α-酮酸（M10）、異甘草素（M221）、苯乙胺（M6）、Nα-甲基組氨酸（M840）、山柰苷（M275）、兒茶酚-3-羧酸（M499）、胞嘧啶（M35）分布在PLS-DA雙標(biāo)圖右下區(qū)域，表明這些化合物在第3類品種中含量較高。

圖4 差異代謝物PLS-DA雙標(biāo)圖Fig.4 PLS-DA biplot of differential metabolites

2.3.3 差異代謝物KEGG富集分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對211 種差異代謝物進行通路富集分析。由圖5可知，與這211 種化合物相關(guān)的主要代謝通路為亞油酸代謝、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、苯丙醇生物合成、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、谷胱甘肽代謝、酪氨酸代謝、α-亞麻酸代謝和β-丙氨酸代謝。其中氨基酸及其衍生物、黃酮、脂類和糖類物質(zhì)代謝通路是26 個品種（系）葉用枸杞芽主要差異代謝通路。

圖5 差異代謝物KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differential metabolites

2.3.4 主要差異代謝物熱圖分析

為可視化26 個品種（系）葉用枸杞芽中化合物的差異，對其主要差異代謝物氨基酸及其衍生物、黃酮、糖類、脂質(zhì)、酚酸、萜類和生物堿進行熱圖分析（圖6）。

圖6 主要差異代謝物熱圖分析Fig.6 Heatmap analysis of major differential metabolites

氨基酸對茶風(fēng)味屬性至關(guān)重要，在茶湯鮮爽度的提高及降低苦澀味方面具有重要作用[42-43]。共有36 種氨基酸及其衍生物發(fā)生明顯變化，其中第2類葉用枸杞芽中含有更高含量的γ-谷氨酰半胱氨酸、N-乙酰組胺、N-甲基酪胺、Nα-乙酰賴氨酸、亮氨酸、N-乙酰鳥氨酸、順-4-羥基-D-脯氨酸、焦谷氨酸、鳥氨酸、L-4-羥基苯甘氨酸、L-茶氨酸、色氨酸酰胺等，主要參與酪氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運體、賴氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝。

黃酮類化合物是茶葉感官品質(zhì)的關(guān)鍵因素，決定茶葉色澤和風(fēng)味[44]。共24 種黃酮類化合物發(fā)生明顯變化，主要富集于黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、花青素生物合成代謝通路。其中，柚皮素7-O-β-D-葡萄糖苷、異槲皮素、表兒茶素、異櫻花素、槲皮素、花旗松素、異牡荊黃素、蘆丁等在第2類葉用枸杞芽中有更高含量。山柰苷、飛燕草素3-O-β-D-葡萄糖苷5-O-(6-香豆酰-β-D-葡萄糖苷)和花青素在第1類和第3類葉用枸杞芽中含量較高。

糖類是使茶湯滋味甘甜的重要成分，可降低茶湯的苦澀味[45]。共有27 種糖類物質(zhì)存在明顯變化，主要富集于半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、ABC轉(zhuǎn)運體、光合生物碳固定代謝通路。第1、2類葉用枸杞芽含更高含量D-葡萄糖-6-磷酸、D-木糖醇、果糖-1,6-二磷酸、甘露醇、葡萄糖酸、D-甘露糖、乙酰麥芽糖、海藻糖、葡萄糖苷等。

脂類是茶的重要成分之一，與茶的感官品質(zhì)有關(guān)。共有25 種脂類化合物發(fā)生了明顯變化，主要富集于亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成及脂肪酸生物合成通路，其中，12-oxo-ETE、肉豆蔻酸、9(S)-HPODE、13-oxo-ODE、辛酸、法尼酸、棕櫚油酸等在第2類葉用枸杞芽中含量較高。

酚酸及其衍生物是茶葉中重要的抗氧化成分，有助于茶湯色澤和滋味的形成，主要呈澀味[46]。共有18 種酚酸類物質(zhì)存在顯著差異，主要參與苯丙醇生物合成與酪氨酸代謝。其中，4-甲基兒茶酚、橄欖苦苷、兒茶酚-3-羧酸和紫蘇酸等在第3類葉用枸杞芽中含量較高。

綜上所述，氨基酸及其衍生物、黃酮、脂質(zhì)和糖類可能是影響葉用枸杞芽滋味的主要差異代謝物。

2.4 滋味屬性與代謝物關(guān)聯(lián)分析

為進一步明確葉用枸杞芽干樣滋味屬性與非揮發(fā)性差異代謝物的關(guān)系，對滋味感官屬性與代謝物進行PLSR相關(guān)性分析。以211 種差異代謝物作為自變量（X），滋味屬性感官強度值作為因變量（Y），建立PLSR模型。由圖7可知，PLSR模型共提取5 個PC，對X和Y的貢獻率分別為56.6%和89.3%，說明該模型能較好地解釋樣本提供的信息。

圖7 滋味屬性與差異代謝物PLSR分析Fig.7 PLSR analysis of taste attributes and differential metabolites

VIP值可以反映PLSR模型中任何一個X對Y的重要程度，根據(jù)VIP＞1的原則篩選出關(guān)鍵變量，并計算關(guān)鍵變量與Y的加權(quán)回歸系數(shù)（weighted regression coefficient，BW），|BW|與相關(guān)性成正比，選取|BW|≥0.035的關(guān)鍵變量為顯著相關(guān)物質(zhì)。

結(jié)果顯示，VIP＞1的代謝物有86 種，與葉用枸杞芽干樣醇、厚、鮮、甜、苦滋味屬性呈正相關(guān)的代謝物分別有57、74、61、39、67 種，主要為氨基酸及其衍生物、黃酮、糖類、脂類等，其中醇滋味屬性與L-茶氨酸（M121）、香葉基焦磷酸銨鹽（M556）、辛酸（M298）、植物醇（M555）、檳榔堿（M603）、S-甲基-L-蛋氨酸（M839）、二硫蘇糖醇、木犀草素（M230）、乙酰麥芽糖（M810）、12-oxo-ETE呈顯著正相關(guān)（|BW|≥0.035）；與花旗松素（M241）、二十五碳五烯酸（M336）、矢車菊素3-O-蕓香糖苷5-O-β-D-葡萄糖苷（M749）、異牡荊黃素、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸（M53）、N-乙酰-D-半乳糖胺、β-丙氨酸基-L-精氨酸（M157）、胡椒堿（M50）、13-oxo-ODE等呈正相關(guān)。

鮮滋味屬性與L-茶氨酸、二硫蘇糖醇、二氨基庚二酸（M218）、色氨酸酰胺（M867）、辛酸、18α-甘草次酸（M541）、胡椒堿、乙酰麥芽糖、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸呈顯著正相關(guān)（|BW|≥0.035）；與N-乙酰-D-半乳糖胺（M19）、N-乙酰-L-谷氨酰胺、β-丙氨酸基-L-精氨酸、花旗松素、S-甲基-L-蛋氨酸呈正相關(guān)。

甜滋味屬性與N-乙酰葡糖胺-6-磷酸、矢車菊素3-O-蕓香糖苷5-O-β-D-葡萄糖苷、S-甲基-L-蛋氨酸、4-羥基肉桂醇4-D-葡萄糖苷（M754）呈顯著正相關(guān)（|BW|≥0.035）；與異牡荊黃素、毛果蕓香堿（M41）、L-4-羥基苯基甘氨酰-L-精氨酸（M803）、乙酰膽堿、L-茶氨酸、檳榔堿、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-甲基酪胺（M599）、β-丙氨酸基-L-精氨酸、二硫蘇糖醇呈正相關(guān)。

厚滋味屬性與十九酸（M462）、迷迭香酸（M536）、9-oxo-ODE（M329）、13(S)-過氧羥基-9,11-十八碳二烯酸（M331）、法尼酸（M314）、油酸呈顯著正相關(guān)。

苦滋味屬性與α-亞麻酸（M322）、γ-亞麻酸（M321）、D-木糖醇（M601）、十九酸、9-oxo-ODE、11-二十碳烯酸（M706）呈顯著正相關(guān)（|BW|≥0.035），與迷迭香酸、法尼酸、油酸、香紫蘇醇（M738）、異槲皮素（M268）、13-oxo-ODE、翠雀花苷3-葡萄糖苷（M267）、毛茶堿（M54）呈正相關(guān)。

其中，共有26 種代謝物共同影響葉用枸杞芽醇、厚、鮮、甜和苦滋味屬性，包括L-茶氨酸、表兒茶素（M236）、花旗松素、異槲皮素、蘆?。∕281）、二硫蘇糖醇及棕櫚油酸（M316）等。

3 討論

感官評價是評價茶葉綜合品質(zhì)的重要手段，本研究通過感官審評對26 個不同品種（系）葉用枸杞干樣分析可知，外形、湯色、香氣、滋味和葉底綜合得分為76.20～82.65；通過感官評價結(jié)果可知，葉用枸杞芽干樣滋味整體上以厚、甜、鮮3 種滋味屬性為主，表現(xiàn)為內(nèi)含物豐富、口感柔和、帶有鮮甜味、無異味。通過LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)在26 個品種（系）葉用枸杞芽中共鑒定到879 種代謝物，包括氨基酸及其衍生物、黃酮類、酚酸類、糖類等11 類。通過樹狀圖以及PLS-DA評分圖可以將26 個品種（系）葉用枸杞芽分為3 類，并推測葉用枸杞芽葉代謝物受品種差異影響較大。其中，氨基酸及其衍生物、黃酮、糖類和脂類等是葉用枸杞芽代謝物的重要差異組分，這些物質(zhì)是茶湯滋味形成的主要貢獻物質(zhì)[47]。以上感官評價結(jié)果和代謝組數(shù)據(jù)在一定程度上解釋了葉用枸杞芽具有適制為茶的特點。

滋味是茶湯風(fēng)味最主要的品質(zhì)特征之一，取決于數(shù)百種不同結(jié)構(gòu)類型的非揮發(fā)性代謝物。其中，氨基酸類主要影響茶湯的鮮味和甜味，黃酮苷類化合物是茶湯的主要澀味物質(zhì)，且對生物堿的苦味有增強作用[48]。對葉用枸杞芽滋味品質(zhì)與非揮發(fā)性差異代謝物進行相關(guān)性分析，PLSR模型中有86 個非揮發(fā)性物質(zhì)的VIP＞1，主要為氨基酸及其衍生物、黃酮、糖類、脂類等，這些不同類型的非揮發(fā)物共同形成了葉用枸杞鮮葉干樣茶湯醇、厚、鮮、甜、苦等滋味特征。其中，甜、醇、鮮滋味屬性主要位于PLSR模型右上方，N1、N9、Z90、Q3、Z85、Z82、Z77品種在PLSR模型的右上方區(qū)域，表明這些樣品甜、醇、鮮滋味屬性較明顯；厚、苦滋味屬性主要位于PLSR模型右下方，Q6-13、Z48、Z68、Z32、Z85等品種在PLSR模型的右下方區(qū)域，表明這些樣品厚、苦滋味屬性較明顯，這些結(jié)果表明，茶湯滋味屬性受品種差異影響較大。黃酮及苷類、氨基酸及其衍生物、核苷酸、有機酸與醇厚滋味屬性呈顯著正相關(guān)，其中有74 種代謝物與厚滋味屬性呈正相關(guān)，可能與葉用枸杞芽中滋味物質(zhì)成分豐富度有關(guān)。

氨基酸類物質(zhì)是茶制品中重要呈味物質(zhì)，其含量直接影響茶滋味品質(zhì)。Yang Chen等[22]研究表明，茶氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺與白茶的鮮味呈顯著正相關(guān)。糖類是使茶湯滋味甘甜的重要成分，對茶湯苦味和澀味有一定的掩蓋和協(xié)調(diào)作用，糖類含量越高，茶葉滋味就越甘醇[49-50]。感官評價結(jié)果顯示，苦滋味強度較其他4 種滋味屬性較弱，與葉用枸杞中含有大量氨基酸和糖類相關(guān)。氨基酸是鮮味的重要代謝物[51]，亦可作為鑒別標(biāo)志來區(qū)分茶葉品種，白茶和綠茶的氨基酸含量最高，其次是烏龍茶和紅茶[52]。Chen Dan等[53]通過非靶向代謝組學(xué)測得的適制綠茶、紅茶、白茶和烏龍茶的不同品種茶鮮葉中代謝物含量分布差異較大，綠茶品種具有較高的氨基酸含量和較低的黃烷醇含量，紅茶呈現(xiàn)出較高水平的黃烷醇、黃烷醇-O-糖苷和茶黃素，烏龍茶品種具有較高含量的萜類化合物。綠茶品種的鮮葉具有游離糖和氨基酸含量高、黃烷-3-醇和酚酸含量低的代謝特征[54]。茶多酚、氨基酸、生物堿、可溶性糖、有機酸等是綠茶的主要呈味成分[55]。Wang Lin等[56]研究表明，綠茶中游離氨基酸含量遠(yuǎn)高于發(fā)酵茶。其中，葉用枸杞茶中谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、組氨酸、亮氨酸、酪氨酸為主要游離氨基酸[57]，本研究葉用枸杞芽葉中含有較高含量的氨基酸和糖類，推測其具有適制白茶和綠茶的潛力，將在后續(xù)實驗中進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究通過感官評價、LC-MS技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析對26 個品種（系）葉用枸杞芽代謝物進行分析。結(jié)果表明，葉用枸杞芽干樣滋味醇厚、鮮爽、有甜味，具有開發(fā)為特色或健康茶產(chǎn)品的前景。LC-MS結(jié)果顯示，共檢測出10 類、879 種非揮發(fā)性代謝物。基于PLS-DA模型共篩選到211 個差異代謝物，主要富集在亞油酸代謝、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、苯丙醇生物合成、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝等代謝通路。PLSR分析表明，氨基酸及其衍生物、黃酮、糖類、脂質(zhì)是葉用枸杞芽主要滋味差異代謝物。其中，L-茶氨酸、表兒茶素、花旗松素、異槲皮素、蘆丁、二硫蘇糖醇、棕櫚油酸等26 種代謝物共同影響葉用枸杞芽醇、厚、鮮、甜、苦等滋味，同時，篩選出感官品質(zhì)較好且滋味物質(zhì)成分豐富的7 個葉用枸杞品種，包括‘寧杞菜1號’‘寧杞9號’、Z90、Z68、Q3、Q6-13和Z48。本研究結(jié)合感官審評與代謝產(chǎn)物的深入分析為26 個品種（系）葉用枸杞茶選育和資源利用提供了科學(xué)依據(jù)。