陳丹妮，王賽男，尹朝春，許澤文，郭曉敏，李康瑗，王嘉煒，陳立平，曹 庸，肖蘇堯,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.華潤(rùn)怡寶飲料（中國(guó)）有限公司，廣東 深圳 518055）

肥胖是能量消耗與熱量攝入之間的失衡，是導(dǎo)致II型糖尿病和心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素[1]。肥胖與機(jī)體脂質(zhì)積累有關(guān)，一旦機(jī)體中脂質(zhì)獲取過(guò)多而分解不完全則會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂和血漿膽固醇偏高[2]，長(zhǎng)期積累可能導(dǎo)致高脂血癥、脂肪肝、腦動(dòng)脈硬化和II型糖尿病等多種慢性疾病[3]。在肝臟中，脂質(zhì)蓄積與胰島素抵抗的發(fā)展有關(guān)，胰島素抵抗是II型糖尿病的早期標(biāo)志[4]。臨床上減肥降脂常用藥物是奧利司他、芬特明-托吡酯等，但長(zhǎng)期攝入藥物會(huì)產(chǎn)生一定副作用，如攝入奧利司他會(huì)導(dǎo)致胃腸道紊亂[5]，服用芬特明-托吡酯會(huì)導(dǎo)致心率加快[6]。眾多研究表明，植物天然活性物質(zhì)如多酚、生物堿、多糖等具有一定的減肥降脂功效，能夠顯著降低體質(zhì)量和血脂水平，調(diào)節(jié)胰島素抵抗和脂肪合成代謝以及改善腸道菌群紊亂[7]。因此利用天然產(chǎn)物活性物質(zhì)對(duì)肥胖高脂相關(guān)疾病進(jìn)行治療干預(yù)是藥食同源物質(zhì)綜合醫(yī)學(xué)上的一項(xiàng)重大突破。

黃皮被譽(yù)為“嶺南佳果”，含有酰胺、多酚等多種生物活性物質(zhì)。黃皮新肉桂酰胺B（lansiumamide B，LB）是從雞心黃皮果核中提取得到的一種酰胺類(lèi)化合物，約占果核干質(zhì)量的千分之一，含量極為豐富[8]，且具有較強(qiáng)生物活性功能[9]，如能夠顯著抑制酪氨酸酶[10]、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶[11]的活性。據(jù)報(bào)道，LB對(duì)胰脂肪酶具有明顯抑制效果，還發(fā)現(xiàn)LB能夠顯著降低油酸誘導(dǎo)后HepG2細(xì)胞中的血脂水平和肝功能關(guān)鍵酶活力，該研究表明LB具有較好的降血脂功效[12]。但目前針對(duì)LB降血脂活性的相關(guān)動(dòng)物模型研究較少，因此對(duì)于LB的動(dòng)物體內(nèi)毒副作用及降血脂活性的進(jìn)一步探究具有重要研究意義，為開(kāi)發(fā)其成為天然降脂藥物提供理論依據(jù)。

經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)物質(zhì)毒性作用的基本實(shí)驗(yàn)，探究物質(zhì)24 h內(nèi)一次或多次經(jīng)口給藥后在7 d內(nèi)的毒性表現(xiàn)及死亡數(shù)量。英國(guó)毒理學(xué)會(huì)于1989年發(fā)表聲明：急性毒性實(shí)驗(yàn)不再完全以動(dòng)物死亡為終點(diǎn)，而是以“表現(xiàn)嚴(yán)重中毒，如再升高劑量則將會(huì)死亡”的效應(yīng)為實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的依據(jù)[12]，因此可依據(jù)無(wú)可見(jiàn)有害作用水平（no observed adverse effect level，NOAEL）作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)劑量的選擇，NOAEL是在規(guī)定實(shí)驗(yàn)條件下未觀察到任何與給藥物質(zhì)有關(guān)的毒性作用的最大染毒劑量[13]。亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)是監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)多日接觸大劑量給藥物質(zhì)出現(xiàn)的中毒效應(yīng)[14]。因此本研究通過(guò)經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)得到LB的NOAEL，并以該水平作為降脂實(shí)驗(yàn)藥物劑量，采用C57BL/6J小鼠建立高脂飲食模型，基于動(dòng)物模型較系統(tǒng)地研究LB的降血脂活性，為其廣泛應(yīng)用提供進(jìn)一步安全性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2019-0048，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及操作按照歐盟制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)指導(dǎo)原則，經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開(kāi)展（倫理申請(qǐng)?zhí)枺?021b189）。小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，12 h/12 h晝夜光照循環(huán)（自動(dòng)照明7:00—19:00），飼養(yǎng)過(guò)程中嚴(yán)格保持環(huán)境清潔，所有小鼠均自由采食和飲水。使用健康SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，其中藥物急性毒性實(shí)驗(yàn)組為8 周齡雄性小鼠12 只，體質(zhì)量（30.0±1.0）g；高脂實(shí)驗(yàn)組為4 周齡雄性小鼠60 只，體質(zhì)量（17.0±2.0）g；均購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證明編號(hào)：44007200098041）。小鼠生長(zhǎng)專(zhuān)用飼料由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂飼料購(gòu)于美國(guó)Research Diets公司，飼料主要高脂成分：豬油245 g/kg、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%、能量21.93 kJ/g。

LB（純度98.7%）實(shí)驗(yàn)室自行分離純化；中鏈甘油三酯（medium chain triglyceride，MCT）上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（glucose，Glu）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、丙二醛（mondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力測(cè)定試劑盒以及小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；多聚甲醛 北京雷根生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、氯化鈉、鹽酸等（均為分析純）廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Enspire 2300多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)PerkinElmer公司；5415R低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf生命科學(xué)公司；SXL-1008T馬弗爐 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；220FS火焰原子吸收分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿分析儀器公司；ME204分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CX 41光學(xué)顯微鏡 廣州市明美光電技術(shù)有限公司；JXFSTPR-32全自動(dòng)樣品快速研磨儀上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LB急性毒性實(shí)驗(yàn)

分別稱(chēng)取20、200 mg LB，加入2 mL MCT，超聲10 min輔助溶解，配制成10、100 mg/mL的LB溶液。將小鼠分為2 組，按0.2 mL/10 gmb（即LB劑量200 mg/kgmb和2 g/kgmb）灌胃1 次后，連續(xù)觀察7 d記錄小鼠臨床表現(xiàn)及死亡情況，得到LB的NOAEL。

1.3.2 C57BL/6小鼠高脂飲食模型建立

將60 只C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為5 組：正常對(duì)照（normal control，NC）組、高脂飲食模型（high fat diet，HFD）組、LB低劑量（LLB）組（20 mg/kgmb，即1/100 NOAEL）、LB中劑量（MLB）組（40 mg/kgmb，即1/50 NOAEL）以及LB高劑量（HLB）組（80 mg/kgmb，即1/25 NOAEL），每組12 只。根據(jù)1.3.1節(jié)方法分別配制1、2、4 mg/mL的LB溶液，按0.2 mL/10 gmb對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃。NC組采用小鼠生長(zhǎng)專(zhuān)用飼料，HFD組和LB藥物組采用高脂飼料飼養(yǎng)，造模8 周后，LB藥物組灌胃給藥4 周，NC組和HFD組均給予等體積藥物溶劑MCT，實(shí)驗(yàn)總周期為12 周。自由飲水，每日更換墊料及飼料。

1.3.3 小鼠臨床表現(xiàn)觀察

給藥期間，每天灌胃藥物并更換飲水和飼料，觀察記錄其表觀變化并稱(chēng)水和飼料質(zhì)量；每隔3 d測(cè)量小鼠體質(zhì)量，記錄活躍程度、攀爬能力、進(jìn)食狀況和被毛光滑程度等臨床表現(xiàn)。

1.3.4 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用吸入式麻醉方法，將小鼠置于呼吸箱后通入一定量CO2氣體麻醉，之后對(duì)小鼠進(jìn)行心臟體外穿刺取血。取血后迅速解剖，取出心、肝、脾、肺、腎、腦等主要器官并稱(chēng)其質(zhì)量，臟器系數(shù)和Lee’s指數(shù)分別按式（1）、（2）計(jì)算。

式中：m1為臟器質(zhì)量/g；m為小鼠體質(zhì)量/g；L為小鼠體長(zhǎng)/cm。

1.3.5 機(jī)體指標(biāo)測(cè)定

口服葡萄糖耐量測(cè)定：灌胃給藥第3周末，對(duì)小鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）。小鼠禁食不禁水12 h后，尾靜脈取血，檢測(cè)小鼠基礎(chǔ)血糖水平，然后按2 g/kgmb灌胃葡萄糖溶液。分別在灌胃后30、60、90、120 min采集小鼠靜脈血樣本，測(cè)定血糖水平，并計(jì)算OGTT曲線下面積（area under the curve，AUC）。胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）按式（3）計(jì)算。

血樣制備：將血樣于低溫高速離心機(jī)（4 ℃、10 000 r/min）離心15 min，分離取上層血清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，避免反復(fù)凍融。肝臟勻漿制備：稱(chēng)取50 mg肝臟組織，加入450 μL 0.9 g/100 mL生理鹽水低溫研磨后于低溫高速離心機(jī)（4 ℃、10 000 r/min ）離心15 min后吸取上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用試劑盒，按相應(yīng)操作說(shuō)明測(cè)定血清和肝臟勻漿蛋白濃度、TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、CAT、MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.3.6 組織切片觀察

稱(chēng)量肝臟組織、測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度后，將肝臟組織和結(jié)腸切取適宜大小，迅速置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，制備組織石蠟切片，再使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）進(jìn)行染色，在400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)，從而評(píng)價(jià)其組織病理學(xué)變化情況。

1.3.7 骨性能指標(biāo)測(cè)定

降脂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用直尺對(duì)麻醉后的小鼠進(jìn)行測(cè)量，得到小鼠體長(zhǎng)（H）；剖離小鼠雙腿肌肉組織和筋膜組織，分別取出股骨和脛骨：1）骨長(zhǎng)和骨徑：用直尺測(cè)量剖解后的骨骼，得到骨長(zhǎng)和骨徑；2）骨骼濕質(zhì)量、干質(zhì)量及骨骼指數(shù)：稱(chēng)量剖解后的股骨和脛骨質(zhì)量，得到骨骼濕質(zhì)量，之后將骨骼于100 ℃干燥12 h后，用乙醇-苯（2∶1，V/V）浸泡96 h，經(jīng)105 ℃烘干至恒質(zhì)量，得到脫脂后的骨骼干質(zhì)量（m2），按式（4）計(jì)算骨骼指數(shù)；3）骨骼灰分與鈣含量：脫脂脛骨樣品在550 ℃馬弗爐中燃燒處理16 h，將灼燒得到的骨骼灰分用研缽充分研磨得到灰分粉末，混勻后稱(chēng)質(zhì)量即為骨骼灰分質(zhì)量；將灼燒所得的骨骼灰分用6 mol/L HCl溶解，于容量瓶中定容至100 mL[15]，用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定骨骼灰分中鈣含量[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，t檢驗(yàn)比較2 組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，單因素方差分析比較多組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05表明組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用GraphPad Prism 8.0、Origin 2023軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LB的經(jīng)口急性毒性結(jié)果

將LB以200 mg/kgmb和2 g/kgmb的劑量分別灌胃小鼠后，觀察7 d內(nèi)小鼠情況。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，灌胃LB后小鼠均狀態(tài)良好，2 組小鼠灌胃一次后在7 d觀察期間均行為正常、被毛光滑、未見(jiàn)明顯中毒癥狀及死亡，由此可以初步判斷LB的NOAEL為2 g/kgmb。

2.2 LB對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

經(jīng)觀察記錄，在整個(gè)灌胃給藥期間，5 組小鼠的精神狀態(tài)良好、未出現(xiàn)打架撕咬情況、皮膚富有彈性、被毛光滑明亮、食欲正常、運(yùn)動(dòng)情況較活躍、攀爬能力佳、沒(méi)有出現(xiàn)死亡情況。由圖1A、C可知，經(jīng)過(guò)8 周高脂飲食喂養(yǎng)造模后，HFD和LB給藥組與NC組之間的體質(zhì)量差異高度顯著（P＜0.001），4 組平均值比NC組提高23.68%，大于20%，即認(rèn)為高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型造模成功[17]；造模8 周后開(kāi)始灌胃LB，給藥4 周后LB給藥組的體質(zhì)量均相較于HFD組下降，且差異顯著（P＜0.01，P＜0.001），其中HLB與HFD組相比體質(zhì)量下降15.51%（圖1B、D），接近NC組，說(shuō)明LB能夠顯著減少高脂飲食帶來(lái)的體質(zhì)量上升。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間不同處理組小鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body mass of mice from different treatment groups during the experiment

由圖2A可知，高脂飲食的4 組小鼠攝食量低于NC組，差異高度顯著（P＜0.001）。由圖2B可知，高脂飲食的4 組小鼠能量攝入高于NC組，差異高度顯著（P＜0.001），可能是由于高脂飼料所含脂肪和熱量較高，而4 組高脂飼料喂養(yǎng)組間攝食量并無(wú)組間差異，表明LB并不通過(guò)抑制食欲從而起到降脂效果。Lee’s指數(shù)常用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠肥胖程度，Lee’s指數(shù)越大，則肥胖程度越高[18]。由圖2C可知，HFD組的Lee’s指數(shù)比NC組增加6.70%，差異高度顯著（P＜0.001），而LB低、中、高劑量組的Lee’s指數(shù)比HFD組分別降低2.87%、3.20%、3.25%，表明LB可以顯著改善小鼠由于高脂飲食引起的肥胖（P＜0.05）；5 組小鼠的體長(zhǎng)（圖2D）在組間無(wú)顯著差異，表明LB不會(huì)延緩小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育。綜合圖1、2結(jié)果可以初步判定LB攝入對(duì)小鼠正常發(fā)育無(wú)明顯毒副作用，具有一定的降脂活性且存在劑量依賴(lài)關(guān)系。

圖2 LB對(duì)小鼠攝食量（A）、能量攝入（B）、Lee’s指數(shù)（C）和體長(zhǎng)（D）的影響Fig.2 Effect of LB on food intake (A),energy intake (B),Lee’s index (C) and body length (D) of mice from different groups

2.3 LB對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)是毒理實(shí)驗(yàn)常用指標(biāo)，在正常生理?xiàng)l件下比較穩(wěn)定，其變化可以體現(xiàn)藥物對(duì)小鼠生長(zhǎng)的改變情況。臟器系數(shù)變大表示臟器充血、水腫等，反之則表示臟器出現(xiàn)萎縮亦或延緩發(fā)育等退行性變化[19]。由圖3可知，5 組小鼠的心臟、脾、肺和腎臟系數(shù)均無(wú)顯著差異，但HFD組肝臟、腦系數(shù)顯著低于NC組（P＜0.001，P＜0.05），可能是高脂飲食帶來(lái)的肥胖引起臟器萎縮。結(jié)果表明，LB對(duì)于小鼠除肝臟和腦以外的臟器組織正常發(fā)育沒(méi)有肥大或萎縮的不良影響[20]。

圖3 不同處理組小鼠的臟器系數(shù)Fig.3 Organ coefficients of mice from different treatment groups

2.4 LB對(duì)小鼠血脂4 項(xiàng)水平的影響

血脂水平可以直接反映機(jī)體的脂代謝變化，其中TG和TC是檢測(cè)血脂水平最靈敏的指標(biāo)[21]。由圖4A～C可知，HFD組小鼠血清TG、TC和LDL-C濃度分別是NC組的1.72、1.28、7.21 倍，表明小鼠存在顯著血脂代謝異?，F(xiàn)象[22]；與HFD組相比，經(jīng)給藥后，LB各劑量組小鼠血清TG、TC和LDL-C濃度均顯著下降，其中HLB組TG、TC和LDL-C濃度較HFD組分別降低30.05%、28.67%和65.81%。HDL-C可以通過(guò)清道夫B類(lèi)I型受體和低密度脂蛋白受體的作用從體內(nèi)清除，促進(jìn)膽固醇代謝，從而抑制膽固醇在血管壁的蓄積[23]。長(zhǎng)期高脂飲食使血清HDL-C濃度降低，而灌胃LB后HLB組血清HDL-C濃度較HFD組高度顯著升高38.04%（P＜0.001）（圖4D）。以上結(jié)果表明，LB能夠有效改善由高脂飲食造成的血脂水平紊亂。

2.5 LB對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積和肝功能的影響

由圖5A、B可知，LB給藥組肝臟TG、TC水平均高度顯著低于HFD組（P＜0.001）。肝臟脂質(zhì)過(guò)度沉積會(huì)導(dǎo)致其功能受損，當(dāng)肝細(xì)胞壞死時(shí)，ALT與AST會(huì)快速釋放到血液中，其上升水平和肝細(xì)胞損傷水平成正比，因此可依據(jù)二者水平判斷肝功能及其受損程度[24]。由圖5C、D可知，HFD組的ALT和AST活力分別是NC組的1.27、1.55 倍；與HFD組相比，LB給藥后ALT和AST活力均高度顯著降低（P＜0.001），其中HLB組的AST和ALT活力分別下降39.35%和42.40%。結(jié)果表明，LB能夠一定程度改善高脂飲食造成的肝損傷。

圖5 LB對(duì)小鼠肝臟TG（A）、TC（B）含量及血清ALT（C）、AST（D）活力的影響Fig.5 Effect of LB on the contents of TG (A),TC (B),and activity of ALT (C),AST (D) in liver tissues of mice

2.6 小鼠肝臟組織病理學(xué)切片觀察

肝臟是人體最大的代謝器官，肝毒性問(wèn)題會(huì)造成藥物代謝障礙和肝臟損傷[25]。根據(jù)文獻(xiàn)切片結(jié)果比較判定，由圖6可知，NC組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整且大小正常[26]，細(xì)胞核大而圓，周?chē)窗l(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[27]，而HFD組肝臟組織中有大量明顯空泡，細(xì)胞核邊緣變得模糊[28]；LB給藥組肝臟空泡現(xiàn)象明顯，但隨LB劑量的增加而減輕，細(xì)胞核邊緣逐漸變得清晰，且HLB組接近于NC組，表明LB對(duì)小鼠肝臟無(wú)傷害且能夠有效抑制高脂飲食造成的肝臟組織空泡和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象[29]。

圖6 不同處理組小鼠肝臟HE染色圖（400×）Fig.6 HE staining sections of liver tissues of mice in different treatment groups (400 ×)

2.7 LB對(duì)小鼠胰島素調(diào)節(jié)作用的影響

長(zhǎng)期攝入高脂飲食會(huì)誘發(fā)機(jī)體胰島素抵抗，初期表現(xiàn)為胰島素敏感性，OGTT可以體現(xiàn)機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)控能力[17]。由圖7A、B可知，在灌胃葡萄糖30 min后各組小鼠血糖濃度均急劇升高，其中HFD組小鼠血糖濃度相比NC組提高29.01%，AUC高度顯著大于NC組（P＜0.001），說(shuō)明高脂飲食降低了機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力，造成糖代謝紊亂[30]。LB給藥組灌胃葡萄糖后30 min，LLB、MLB、HLB組OGTT血糖濃度最大值相較于HFD組分別降低14.97%、24.36%、24.97%。胰島素抵抗會(huì)造成血液中的葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞受阻，導(dǎo)致機(jī)體血糖水平上升，同時(shí)機(jī)體的代償性分泌又會(huì)使胰島素含量上升[31]。HFD組小鼠空腹血糖濃度（8.28 mmol/L）和胰島素水平（18.16 mIU/L）高度顯著高于NC組（P＜0.001），分別提高74.29%和84.66%，表明高脂飲食使小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗（圖7C、D）。由圖7E可知，HFD組的HOMA-IR為6.68，是NC組的2.25 倍；而與HFD組相比，3 組LB給藥后小鼠的空腹血糖濃度、空腹胰島素水平及HOMA-IR均顯著下降（圖7C～E），其中LLB組相比HFD組分別下降19.37%、15.09%、30.36%。上述結(jié)果表明，LB可以顯著改善由高脂飲食誘發(fā)的血糖調(diào)節(jié)能力下降和降低機(jī)體胰島素抵抗。

圖7 LB對(duì)小鼠OGTT及胰島素抵抗的影響Fig.7 Effect of LB on oral glucose tolerance and insulin resistance in mice

2.8 LB對(duì)小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，也是氧化應(yīng)激的重要生物標(biāo)志物[32]。CAT、SOD、GSH-Px通常用于評(píng)價(jià)機(jī)體的抗氧化能力，而MDA是氧自由基與脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的一種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物[33]，反映組織中自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度。正常情況下，機(jī)體具有較好的抗氧化應(yīng)激能力，CAT、SOD和GSH-Px活力相對(duì)較高，MDA含量則較低；而機(jī)體一旦受到損傷則相反。由圖8可知，與NC組相比，小鼠飼喂高脂飼料后，肝臟與血清中的CAT、SOD和GSH-Px活力均高度顯著降低（P＜0.001），MDA含量則高度顯著增高（P＜0.001），HFD組血清MDA含量較NC組提高82.72%。與HFD組相比，LB給藥后小鼠肝臟和血清中抗氧化酶活力顯著提高，其中，HLB組肝臟SOD、GSH-Px和CAT活力分別較HFD組提高41.86%、41.95%和105.50%，而MDA含量高度顯著降低（P＜0.001）。與HFD組相比，3 組給藥組的血清MDA含量分別下降20.21%、21.84%和25.87%，肝臟MDA含量則分別下降15.76%、22.58%、30.97%，表明LB能夠有效改善小鼠由于高脂飲食產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷。

圖8 不同處理對(duì)小鼠血清及肝臟組織CAT、SOD和MDA水平的影響Fig.8 Effects of different treatments on the levels of CAT,SOD and MDA in serum and liver tissues of mice

2.9 LB對(duì)小鼠結(jié)腸形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道是人體吸收的主要器官，可能蓄積外來(lái)化合物，從而對(duì)腸道造成損傷[34]。由圖9A、B可知，HFD組結(jié)腸長(zhǎng)度短于NC組，差異高度顯著（P＜0.001），而LB給藥組與NC組沒(méi)有顯著差異，且結(jié)腸表面均勻光滑、無(wú)水腫充血和萎縮現(xiàn)象。由圖9C可知，NC組小鼠結(jié)腸黏膜層完整，腺體細(xì)胞排列整齊；而HFD組小鼠結(jié)腸黏膜腺體缺失、出現(xiàn)大量炎癥并浸潤(rùn)至肌層、部分隱窩和杯狀細(xì)胞消失、上皮層不完整[14]；LB給藥組的絨毛排列結(jié)構(gòu)隨著LB劑量增加有所改善，逐漸恢復(fù)至與NC組相似，其結(jié)腸黏膜除形成環(huán)狀襞外、絨毛結(jié)構(gòu)也趨于完整、整體結(jié)構(gòu)密集、排列有序，使得腸黏膜的表面積增加，更有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[35]。綜合結(jié)腸的表觀與切片結(jié)果，可以判斷LB的攝入不會(huì)對(duì)小鼠結(jié)腸造成萎縮等損傷并能夠顯著改善由于高脂飲食對(duì)其帶來(lái)的腸黏膜腺體缺失等影響。

圖9 不同處理組小鼠結(jié)腸實(shí)際圖片（A）、結(jié)腸長(zhǎng)度（B）及結(jié)腸HE染色切片圖（C）Fig.9 Photographs (A),length (B) and HE staining slices (C) of colon in mice from different treatment groups

2.10 LB對(duì)小鼠股骨與脛骨骨性能的影響

骨骼是人體內(nèi)最主要的鈣存儲(chǔ)部位，鈣對(duì)骨骼健康至關(guān)重要。當(dāng)體內(nèi)鈣含量降低時(shí)，一系列生理反應(yīng)（如誘導(dǎo)甲狀旁腺激素觸發(fā)骨鈣釋放、增加腸鈣吸收和增加腎鈣重吸收）將會(huì)啟動(dòng)進(jìn)而維持鈣分子體內(nèi)平衡[36]。由圖10可知，綜合骨性能檢測(cè)結(jié)果可以說(shuō)明LB攝入12 周對(duì)于小鼠股骨與脛骨未造成顯著退行性變化，沒(méi)有毒副作用。

圖10 不同處理對(duì)小鼠股骨和脛骨骨性能的影響Fig.10 Effects of different treatments on femur and tibia properties of mice

3 結(jié)論

通過(guò)經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)LB的NOAEL進(jìn)行探究，為該植物源天然活性物質(zhì)的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)，急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出LB的NOAEL為2 g/kgmb?；诟咧嬍承∈竽Ｐ脱芯縇B的降脂活性，結(jié)果表明：LB具有良好降脂活性，能夠減輕體質(zhì)量、顯著改善高脂飲食造成的血脂水平紊亂，還能夠調(diào)節(jié)肝功能、體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷和血糖紊亂，降低機(jī)體胰島素抵抗；骨性能結(jié)果顯示，長(zhǎng)期攝入LB不會(huì)對(duì)小鼠造成退行性變化，基本無(wú)毒副作用。綜合本研究結(jié)果認(rèn)為，LB在NOAEL內(nèi)的劑量對(duì)小鼠具有顯著降脂活性且無(wú)可見(jiàn)毒副作用，且LB對(duì)于肝臟脂質(zhì)沉積和代謝有積極作用，未來(lái)可著眼于研究LB在機(jī)體中膽固醇吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，進(jìn)一步探索其具體降脂作用機(jī)制。