張俊慧，陳然然，叢 賀，沈明花

（延邊大學醫(yī)學院，吉林 延吉 133002）

長期大量飲酒是造成心血管疾病的主要原因之一[1-2]。長期大量飲酒可引起脂類代謝紊亂，從而增加心血管疾病的風險[3]。內皮細胞是血管內膜的主要成分，是一種天然屏障，在調節(jié)血管張力以及白細胞黏附和血小板聚集過程中起重要作用，且在心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用[4]。因此，內皮細胞結構、功能的損傷與眾多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。乙醇所致的脂類代謝紊亂或其代謝過程中產生的代謝產物可直接作用于血管內皮細胞，影響其結構或功能。已有研究表明，大鼠慢性乙醇中毒會引起其腦毛細血管內皮細胞結構改變[6]。乙醇代謝過程中產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）[7]，后者引發(fā)氧化應激，最終會引起細胞凋亡[8]。因此，調節(jié)乙醇所致的脂類代謝紊亂或降低細胞ROS水平對保護血管內皮細胞以及心血管疾病的防治具有重要意義。

榛蘑（Armillaria mellea）是一種藥食用菌，主要分布于我國內蒙古、黑龍江和吉林等地區(qū)，具有抗氧化、降脂等功效[9-10]。前期研究表明，榛蘑多糖具有保護血管內皮的作用[11-12]。乙醇對血管內膜的損傷與氧化應激和高血脂有關，而榛蘑多糖具有抗氧化及降脂作用。為探究榛蘑多糖是否對乙醇誘導的血管內膜損傷有保護作用，本研究以乙醇誘導血管內膜損傷SD大鼠為模型，分析榛蘑多糖對血管內膜的影響。旨在為榛蘑多糖對乙醇所致大鼠血管內膜損傷的保護作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

清潔級SD大鼠40 只，體質量為180～200 g，雌雄各半，生產許可證號：SCXK（吉）2017-0003，由延邊大學實驗動物中心提供。動物實驗按照GB/T 35892—2018《實驗動物 福利倫理審查指南》執(zhí)行。

人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）購于上海佛雷堡生物科技發(fā)展有限公司。

榛蘑多糖由延邊大學醫(yī)學院生化教研室提供；總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、血清甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、內皮素1（endothelin 1，ET-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；NO、內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）檢測試劑盒 上海研謹生物科技有限公司；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；CCK8試劑盒 美國APExBio公司；ROS檢測試劑盒上海碧云天生物技術有限公司；AO/EB雙染色試劑盒、JC-1試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司；藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測試劑盒 美國BD公司；B淋巴細胞瘤2蛋白（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、Caspase-3、β-actin一抗、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔免疫球蛋白G（immunglobulin G，IgG）、HRP標記羊抗鼠IgG美國Cell Signaling公司。

1.2 儀器與設備

BX53F熒光倒置顯微鏡 日本Olympus株式會社；RT-2100酶標儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司；c280化學發(fā)光成像系統(tǒng) 美國Azure Biosystems公司；A00-1-1102流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

將SD大鼠隨機平分為4 組，即正常對照組、損傷組、榛蘑多糖低劑量組和榛蘑多糖高劑量組。每日8:00，除正常對照組外其余各組大鼠按10 mL/kgmb以體積分數(shù)40%乙醇灌胃，正常對照組使用生理鹽水代替。每日16:00，榛蘑多糖低、高劑量組分別按100、400 mg/kgmb灌胃榛蘑多糖溶液，正常對照組和損傷組均以等體積生理鹽水代替。連續(xù)灌胃4 周后大鼠禁食、禁水24 h。24 h后以烏拉坦麻醉大鼠，取頸動脈，用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，并心臟采血用于血清學指標的檢測。

1.3.2 頸動脈形態(tài)學觀察

將大鼠頸動脈用4%多聚甲醛溶液固定24 h，自來水沖洗，經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片后進行HE染色，在400 倍光學顯微鏡下觀察血管組織的病理變化。

1.3.3 血清學指標檢測

常規(guī)方法分離血清，按試劑盒說明書進行T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、MDA、NO、eNOS、iNOS和ET-1水平的檢測。

1.3.4 細胞培養(yǎng)及存活率測定

將HUVEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將HUVEC接種于96 孔板，分為對照組、乙醇組、榛蘑多糖低、高劑量組，每組設6 個復孔，每孔接種密度為1×105cells/mL。除對照組外，其余各組分別與終濃度600 μmol/mL乙醇作用12 h，對照組以RPMI-1640培養(yǎng)基代替。12 h后榛蘑多糖低、高劑量組分別與終質量濃度100、400 μg/mL的榛蘑多糖作用24 h，對照組和乙醇組以RPMI-1640培養(yǎng)基代替。24 h后每孔加入10 μL CCK8溶液（試劑盒自帶）孵育1 h。使用酶標儀在450 nm波長處測定光密度（OD450nm），細胞存活率按下式計算：

1.3.5 細胞ROS水平測定

將HUVEC以3×105cells/孔的密度接種于6 孔板，實驗分組及處理同1.3.4節(jié)。將4 組細胞以不同方式處理后，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次。加入1 mL按照1 000∶1用無血清培養(yǎng)基稀釋的2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodih ydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針，其終濃度為10 μmol/L，在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。后棄上清液，使用PBS洗滌。每孔加入1 mL RPMI-1640，在480 nm激發(fā)波長下觀察并拍照，分析細胞的熒光強度，該值代表細胞ROS水平。

1.3.6 JC-1染色法觀察線粒體跨膜電位水平

將HUVEC以3×105cells/孔的密度接種于24 孔板，實驗分組及處理同1.3.4節(jié)。將4 組細胞以不同方式處理后，棄上清液，用PBS洗滌后分別加入250 μL無血清培養(yǎng)基和JC-1染色工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。30 min后棄上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌。加無血清培養(yǎng)液500 μL，在515、585 nm激發(fā)波長下觀察并拍照，計算585、515 nm波長處的熒光強度比值，該值代表線粒體跨膜電位水平。

1.3.7 AO/EB染色法觀察細胞凋亡

將HUVEC接種于6 孔板爬片，細胞分組及處理同1.3.4節(jié)。按說明書加入AO/EB工作液，在室溫放置5 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

將HUVEC接種于6 孔板，細胞分組及處理同1.3.4節(jié)。小心收集細胞培養(yǎng)液到離心管中備用，每孔加入0.5 mL胰酶置于培養(yǎng)箱中消化細胞，至細胞可以被輕輕吹打下來時，加入收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有貼壁細胞，再次收集到離心管內，1 000×g離心3 min，沉淀細胞，小心吸除上清。用預冷PBS洗滌細胞2 次，然后以1×106cells/mL將細胞重懸于Annexin V結合緩沖液中。取100 μL細胞懸液，加入PE標記的Annexin V和7-氨基放線菌素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD）各5 μL，室溫下避光孵育15 min。加入400 μL Annexin V結合緩沖液，使用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.3.9 蛋白免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3的表達水平

將HUVEC接種于培養(yǎng)皿，實驗分組及處理方法同1.3.4節(jié)。收集各組細胞后用PBS洗滌并用RIPA緩沖液裂解細胞，提取蛋白質。用BCA法進行蛋白定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，用5 g/100 mL脫脂乳粉將聚偏氟乙烯膜室溫封閉2 h，加入相應的一抗，于4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h。最后進行沖洗、顯影。

1.4 數(shù)據處理

實驗數(shù)據用平均值±標準差表示，使用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行單因素方差統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異具有顯著意義。使用ImageJ軟件進行細胞熒光強度分析，使用Graphpad Prism 9.5.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 頸動脈形態(tài)學觀察結果

由圖1可知，正常對照組大鼠頸動脈結構正常，血管內膜結構完整并且內皮細胞連續(xù)性良好。經乙醇誘導后損傷組血管明顯收縮，管腔變窄，內皮細胞脫落明顯。表明所用的乙醇劑量可引起血管內皮的損傷。與損傷組相比，經榛蘑多糖處理后內膜較完整，內皮細胞脫落現(xiàn)象得到明顯改善，表明榛蘑多糖有一定的血管內膜保護作用。

圖1 大鼠頸動脈HE染色結果（×400）Fig.1 Morphological observation of carotid artery in rats (× 400)

2.2 榛蘑多糖對乙醇誘導大鼠血脂水平的影響

血清T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C水平可以反映機體脂類代謝水平[13]。大量飲酒可引起脂類代謝紊亂[14]，而血脂異常是內皮受損的誘因[15]。由表1可知，與正常對照組相比，經乙醇處理后大鼠血清T-CHO、TG、LDL-C水平極顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平極顯著降低（P＜0.01），表明乙醇引起脂類代謝的紊亂并進一步影響血管內膜的結構及功能。用不同劑量的榛蘑多糖干預后可逆轉上述指標的變化，說明榛蘑多糖具有一定的降脂作用。研究表明，榛蘑多糖通過降低血脂改善糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[16]，與本研究中榛蘑多糖的降脂作用相符。

表1 榛蘑多糖對乙醇誘導大鼠血清T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C濃度的影響Table 1 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on T-CHO,TG,LDL-C and HDL-C concentrations in serum of ethanol-induced rats mmol/L

2.3 榛蘑多糖對乙醇誘導大鼠血清eNOS、iNOS及NO水平的影響

研究表明，乙醇及其代謝過程中產生的ROS可以激活NOS。此外，乙醇對精氨酸酶的抑制作用促進L-精氨酸轉變成NO[17]。由表2可知，損傷組大鼠iNOS和NO水平極顯著高于正常對照組（P＜0.01），這可能與乙醇所致的氧化應激有關。有研究表明，乙醇上調iNOS，促進主動脈環(huán)收縮[18]，這與本研究結果相符。經榛蘑多糖干預后，與損傷組相比，高劑量組iNOS和NO水平極顯著降低（P＜0.01），而各組之間eNOS水平無顯著差異。在生理條件下，eNOS催化NO生成，調節(jié)血管舒張及血小板聚集[19]。在氧化應激、炎癥等刺激下iNOS被激活，產生大量NO，繼發(fā)產生過氧亞硝基陰離子（ONOO-），引起細胞損傷[20-21]。因此，降低iNOS活性對氧化應激所致細胞損傷具有一定積極意義。本研究結果表明，乙醇誘導后iNOS水平顯著增高，產生過量NO，后者氧化產生的產物直接損傷血管內膜。而經榛蘑多糖干預后，抑制乙醇所致的iNOS活性升高，以及NO過度生成，從而保護內皮細胞，這與本研究的HE染色結果相符。

表2 榛蘑多糖對乙醇誘導大鼠血清eNOS、iNOS及NO水平的影響Table 2 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on the levels of eNOS,iNOS and NO in serum of ethanol-induced rats

2.4 榛蘑多糖對乙醇誘導大鼠血清ET-1、SOD和MDA水平的影響

ET-1是一種血管收縮物質，主要由內皮細胞產生和釋放，可作為檢測內皮功能障礙的指標[22]。SOD作為重要的抗氧化酶，可以清除體內的超氧陰離子[23]。MDA是一種脂質過氧化產物，可以間接反映細胞受自由基攻擊的程度。乙醇的代謝過程中產生ROS[7]，而過量ROS可引起細胞氧化損傷。因此，提高機體的抗氧化水平對乙醇所致的細胞氧化損傷有保護作用。由表3可知，與正常對照組相比，乙醇處理后ET-1和MDA水平極顯著升高，而SOD活性極顯著下降（P＜0.01）。然而，與損傷組相比，經榛蘑多糖干預后，高劑量組大鼠血清ET-1和MDA水平顯著降低，SOD活性顯著升高（P＜0.05）。結果表明，榛蘑多糖通過提高抗氧化酶活性抑制氧化損傷，從而保護血管內膜，與本研究中血管內膜病理改變結果相符。

表3 榛蘑多糖對乙醇誘導大鼠血清ET-1、SOD和MDA水平的影響Table 3 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on the levels of ET-1,SOD and MDA in serum of ethanol-induced rats

2.5 榛蘑多糖對乙醇誘導HUVEC存活率的影響

由圖2可知，在體外實驗中，經乙醇處理后細胞存活率顯著下降，說明600 μmol/mL乙醇有一定的內皮毒性。榛蘑多糖干預后細胞存活率逐漸提高，高劑量組平均存活率極顯著高于乙醇組（P＜0.01），提示榛蘑多糖可以保護乙醇所致的細胞損傷。

圖2 榛蘑多糖對HUVEC存活率的影響Fig.2 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on HUVEC viability

2.6 榛蘑多糖對乙醇誘導HUVEC ROS水平的影響

DCFH-DA常用于細胞ROS水平的檢測[24]。DCFH-DA在細胞內經酯酶水解生成DCFH，后者被ROS氧化生成具有綠色熒光的2′,7′-二氯熒光素，其熒光強度可以反映細胞ROS水平。由圖3可知，乙醇作用后細胞ROS水平極顯著升高（P＜0.01），而榛蘑多糖干預后高劑量組ROS水平較乙醇組極顯著降低（P＜0.01）。過量ROS可促進不飽和脂肪酸的氧化，導致MDA等脂質過氧化產物增多。榛蘑多糖可能通過提高SOD等抗氧化酶活性，清除自由基，抑制脂質過氧化，從而保護細胞，這與2.4、2.5節(jié)得到的結果相符。

圖3 榛蘑多糖對HUVEC ROS水平的影響Fig.3 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on ROS levels in HUVEC

2.7 榛蘑多糖對乙醇誘導HUVEC線粒體跨膜電位的影響

線粒體是細胞進行物質代謝和能量代謝的主要細胞器。線粒體跨膜電位可以反映線粒體功能，其水平的降低是線粒體功能障礙的標志之一[25]。本研究用JC-1熒光探針檢測線粒體跨膜電位水平。當線粒體跨膜電位高時JC-1以聚合體的形式存在，發(fā)出紅色熒光；而其水平降低時JC-1則以單體形式存在，產生綠色熒光。JC-1紅/綠熒光比值可以反映線粒體跨膜電位相對水平。由圖4可知，與對照組相比，乙醇組綠色熒光顯著增強，JC-1紅/綠熒光比值極顯著降低（P＜0.01），說明乙醇引起ROS水平的升高并誘導氧化應激，引起線粒體跨膜電位降低；而與乙醇組相比，榛蘑多糖高劑量組綠色熒光強度減弱，JC-1紅/綠熒光比值極顯著升高（P＜0.01），說明榛蘑多糖可以抑制乙醇所致的線粒體跨膜電位降低，這可能與其清除ROS作用有關。

圖4 榛蘑多糖對HUVEC線粒體跨膜電位的影響Fig.4 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on mitochondrial membrane potential in HUVEC

2.8 榛蘑多糖對乙醇誘導HUVEC凋亡的影響

研究表明，乙醇所致的氧化損傷會引起細胞凋亡[26]。由圖5A可知，正常對照組細胞形態(tài)正常，呈梭形，細胞核呈均勻綠色熒光；乙醇組細胞失去正常結構、明顯變小變圓，細胞核固縮并呈黃綠色，呈凋亡細胞形態(tài)，提示乙醇誘導細胞凋亡。與乙醇組相比，經榛蘑多糖干預后可見凋亡細胞明顯減少，細胞形態(tài)趨于正常，說明榛蘑多糖可以抑制乙醇所致的細胞凋亡。為進一步觀察榛蘑多糖對乙醇所致細胞凋亡的影響，用流式細胞儀檢測凋亡率。由圖5B～C可知，與對照組相比，乙醇作用后細胞凋亡率極顯著增加（P＜0.01），而榛蘑多糖干預后細胞凋亡減少，榛蘑多糖高劑量組作用尤為顯著，與圖5A結果相一致。線粒體跨膜電位是觀察早期細胞凋亡的重要指標[27]。榛蘑多糖抑制乙醇所致的線粒體跨膜電位降低，從而可以解釋減少細胞凋亡的結果。

圖5 榛蘑多糖對HUVEC凋亡的影響Fig.5 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on apoptosis in HUVEC

2.9 榛蘑多糖對乙醇誘導HUVEC凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3表達的影響

線粒體凋亡是細胞凋亡的主要途徑之一[28]。Bax、Bcl-2和Caspase-3介導線粒體凋亡途徑[29]。Bax和Bcl-2調控線粒體膜的通透性，調節(jié)細胞色素C的釋放，進而影響Caspase-3的活化。由圖6可知，與對照組相比，乙醇極顯著下調Bcl-2表達，極顯著上調Bax和Cleaved caspase-3水平（P＜0.01）。與乙醇組相比，經榛蘑多糖干預后上調Bcl-2表達水平、降低Bax和Cleaved caspase-3表達并降低Bax/Bcl-2。上述結果提示，榛蘑多糖通過調控線粒體凋亡相關蛋白表達，從而抑制細胞凋亡。

圖6 榛蘑多糖對Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3表達的影響Fig.6 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on the expression of Bax,Bcl-2 and cleaved caspase-3

3 結論

血管內膜作為直接與乙醇或其代謝產物接觸的部位，是乙醇毒性作用的靶點。本研究以體積分數(shù)40%乙醇溶液灌胃4 周的方法建立大鼠血管內膜損傷模型，分析榛蘑多糖對血管內膜的保護作用。結果表明，乙醇作用后大鼠血管明顯收縮、管腔變窄、可見部分內皮細胞脫落，ET-1水平升高，提示乙醇誘導的血管內膜損傷模型建立成功。同時，損傷組大鼠的T-CHO、TG、LDL-C、NO、MDA水平顯著升高，表明乙醇引起脂代謝紊亂并引發(fā)氧化應激反應，促進脂質過氧化。體外實驗結果表明，600 μmol/mL的乙醇降低細胞存活率、提高細胞ROS水平、降低線粒體跨膜電位，從而促進細胞凋亡。Bax、Bcl-2和Caspase-3是介導線粒體凋亡途徑的重要蛋白。Bax/Bcl-2的增加促進細胞色素C釋放，后者介導凋亡復合體的形成，進而活化Caspase-3，從而促進細胞凋亡。線粒體跨膜電位的下降是線粒體凋亡途徑的早期事件。經不同劑量榛蘑多糖干預后減輕了血管內膜的氧化損傷，降低細胞ROS水平、抑制乙醇所致的線粒體跨膜電位下降，從而抑制細胞凋亡，這可能與其下調Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3有關。綜上所述，榛蘑多糖對乙醇誘導的大鼠血管內膜損傷有保護作用，其機制可能與其降脂、抗氧化和抗凋亡作用有關，具體作用機制有待進一步研究。