曾 波，饒家權(quán)，鄒永芳，文 靜，黃治國,3，鄧 杰,3,*

（1.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.舍得酒業(yè)股份有限公司，四川 射洪 629000；3.中國輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點實驗室，四川 宜賓 644000）

濃香型白酒是中國白酒的典型代表，具有窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協(xié)調(diào)、回味悠長等特征，深受消費者青睞，其產(chǎn)量和銷量比例占整個白酒行業(yè)的70%[1]。酒醅是濃香型白酒生產(chǎn)的重要微生物來源之一，包括酵母、霉菌、細菌在內(nèi)的多種微生物對生產(chǎn)原料中大分子有機物分解能力較強，其代謝產(chǎn)物也可以作為白酒呈香物質(zhì)的前體物，對白酒生產(chǎn)過程中香味物質(zhì)的形成起關(guān)鍵作用[2]。因此，對白酒酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究成為近幾年白酒領(lǐng)域的研究熱點。

由于濃香型白酒發(fā)酵過程中窖內(nèi)環(huán)境的變化，酒醅微生物呈動態(tài)、有規(guī)律的演變[3]。肖辰等[4]通過對濃香型酒醅細菌群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，酒醅中乳桿菌屬（Lactobacillus）在發(fā)酵初期迅速增長，發(fā)酵中后期相對豐度呈緩慢上升趨勢，是酒醅中的絕對優(yōu)勢菌屬。田瑞杰等[5]采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對濃香型白酒窖池酒醅微生物的差異表達基因進行研究，發(fā)現(xiàn)酒醅微生物的代謝差異富集在RNA降解與糖酵解，且下層酒醅的微生物對代謝活動的貢獻最大，酒醅發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成不同，其代謝也會有所差異。Qian Wei等[6]對酒醅與窖泥微生物在濃香型白酒發(fā)酵過程中有機酸代謝的分工進行研究，結(jié)果表明，與乙酸、乳酸代謝相關(guān)的酶主要富集在酒醅中，這些酸隨后被窖泥菌群代謝為己酸和丁酸，酒醅與窖泥微生物合力推動濃香型白酒風(fēng)味的形成。目前的研究主要是對酒醅發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)解析，許多研究表明，乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、片球菌屬、地芽孢桿菌屬等是酒醅中的優(yōu)勢細菌屬[7-8]，哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、伊薩酵母屬等是酒醅中的優(yōu)勢真菌屬[9-10]，但濃香型酒醅中微生物的代謝尚不清晰，對不同發(fā)酵節(jié)點的濃香型白酒酒醅微生物的演替規(guī)律對代謝功能的影響研究較少，對微生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、多樣性及動態(tài)變化情況等方面認識不足。

本研究以四川某濃香型窖池不同發(fā)酵節(jié)點的酒醅作為研究對象，測定酒醅樣品發(fā)酵過程中理化指標的變化規(guī)律，并借助高通量測序技術(shù)分析酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)，使用冗余分析（redundancy analysis，RDA）、相關(guān)性分析研究微生物群落結(jié)構(gòu)與理化指標的關(guān)聯(lián)性，并利用PICRUSt分析發(fā)酵過程中酒醅微生物群落代謝的差異，旨在為明確濃香型白酒的釀造機理提供科學(xué)依據(jù)，及為釀造過程中微生物的調(diào)控和代謝機制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：酒醅樣品取自四川某濃香型白酒廠生產(chǎn)窖池，每個樣品分別于窖池的上、中、下3 層采集（圖1），合并混合均勻后作為該發(fā)酵節(jié)點的酒醅樣品（約200 g）。在60 d發(fā)酵期內(nèi)，分別從同一窖池取發(fā)酵5、10、15、20、30、40、50、60 d的樣品。樣品采集后暫存于-20 ℃，并及時進行酒醅微生物基因組DNA提取和理化檢測，每個樣品的理化指標檢測3 次。

圖1 取樣點示意圖Fig.1 Schematic diagram of sampling sites

E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒 上海晶諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DL-1電子萬用爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；T100聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀 美國Bio-Rad公司；PiCo21臺式高速離心機 美國Thermo Fisher公司；NanoDrop2000 DNA含量測定儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅理化檢測方法

水分含量采用常壓干燥法測定；酸度參照DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》采用酸堿滴定法測定；淀粉與還原糖含量采用菲林試劑法[11]測定。

1.3.2 酒醅DNA的提取

細菌根據(jù)E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒說明書進行DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000 DNA含量測定儀進行檢測，同時利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。真菌根據(jù)十六烷基三甲基溴化銨法，將提取的DNA加適量含10 ng/μL RNase的100 μL超純水溶解，37 ℃孵育1 h，分裝2 管，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴增

細菌用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，27 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶、10 ng DNA模板。真菌通用引物ITS1FI2（5′-GAACCWGCGGARGGATCA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）用于真菌ITS序列的擴增，序列長度205 bp。PCR擴增體系為：模板DNA 100 ng，ITS1FI2（0.5 μmol/L）和ITS2（0.5 μmol/L）各2.5 μL，Premix ExTaqTMHot Start Version 12.5 μL，加ddH2O補至25 μL。PCR程序：98 ℃預(yù)變性10 s；98 ℃變性10 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，33 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[12]。全部樣本按照正式實驗條件進行，每個樣本3 個重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物技術(shù)有限公司進行測序，用于后續(xù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接。使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，并在聚類過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），參考京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp/），采用PICRUSt（https://cloud.majorbio.com/）工具對導(dǎo)入的OTU分類信息文件進行在線功能預(yù)測，基于KEGG注釋結(jié)果，將擴增子序列變體（amplicon sequence variant，ASVs）與其內(nèi)參序列比對，把ASVs置入相應(yīng)的參考樹中，推斷每個ASV基因家族的拷貝數(shù)，預(yù)測每個ASV的基因含量，結(jié)合MinPath確定每個樣本基因家族的豐度；將基因家族信息與KEGG數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的功能進行比對，獲得每個樣本的功能信息和豐度信息，繪制代謝途徑，根據(jù)酶的豐度信息繪制氣泡圖。利用Origin軟件分析理化指標的變化規(guī)律，酒醅理化數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，通過Origin軟件及R語言進行微生物群落的變化規(guī)律分析、理化指標相關(guān)性分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅理化指標的變化規(guī)律

如圖2所示，淀粉含量在發(fā)酵前期呈持續(xù)下降趨勢，30 d后趨于平穩(wěn)，質(zhì)量分數(shù)維持在7.8%，酒醅在發(fā)酵前期淀粉含量較高，細菌、霉菌等迅速繁殖使得糖化酶活力增高，導(dǎo)致還原糖含量升高，但還原糖含量變化在整個發(fā)酵過程中呈下降趨勢，可能是由于5 d后酵母菌等大量兼性厭氧微生物大量繁殖，還原糖被迅速利用[13]。發(fā)酵后期微生物發(fā)酵能力減弱，還原糖與淀粉含量趨于平穩(wěn)；發(fā)酵初期，酒醅中淀粉含量較高，微生物在利用淀粉時產(chǎn)生大量的熱量，同時糖化作用會產(chǎn)生大量水分，導(dǎo)致酒醅中的水分含量從發(fā)酵初期持續(xù)上升，水分含量在60 d達到最高，為74.01%；同時適宜的水分可以調(diào)節(jié)窖內(nèi)溫度和降低發(fā)酵酒醅的酸度，影響酒醅發(fā)酵的質(zhì)量[14]。酒醅中的有機酸是酒體重要的風(fēng)味物質(zhì)并且參與酯化過程，適宜的酸度可以抑制部分有害雜菌的繁殖[15]。酸度在整個發(fā)酵過程中呈上升趨勢，在30 d后趨于平穩(wěn)，60 d時酸度最高，為3.57 mmol/10 g，窖內(nèi)厭氧與兼性厭氧微生物代謝旺盛是酸度升高的原因之一。

圖2 發(fā)酵過程中酒醅理化指標的變化Fig.2 Changes in physicochemical indicators of fermented grains during fermentation process

2.2 酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的α多樣性分析

經(jīng)測序數(shù)據(jù)的處理，8 個酒醅樣品共得到445 296 條真菌有效序列和602 328 條細菌有效序列，由表1可知，所有樣品的覆蓋率均達到99.84%以上，表明酒醅樣品的測序結(jié)果能反映微生物群落全部信息，經(jīng)分析，酒醅中的細菌OTU數(shù)量為134～481，真菌OTU數(shù)量為135～293，說明在發(fā)酵過程中，細菌的物種豐富度高于真菌。細菌Shannon指數(shù)為1.16～2.44，真菌Shannon指數(shù)為1.42～2.04，Shannon指數(shù)用于衡量物種多樣性，隨著發(fā)酵進行，酒醅中細菌的Shannon指數(shù)呈先升高后降低的趨勢，這與王鵬[16]、Zhang Yanyan[17]等研究結(jié)果相似，這可能是酒醅發(fā)酵前期存在大量來源于大曲的微生物，且酒醅營養(yǎng)豐富，適宜的酸度使酒醅微生物大量繁殖，導(dǎo)致酒醅細菌多樣性在10 d前增加，真菌的Shannon指數(shù)變化較小。酒醅中細菌的Chao1指數(shù)呈先升高后降低的趨勢，而真菌的Chao1指數(shù)波動變化，表明酒醅發(fā)酵過程中真菌和細菌的豐度在不斷變化。

表1 酒醅中微生物的α多樣性Table 1 α-Diversity of microbial communities in fermented grains

2.3 酒醅發(fā)酵過程中細菌群落演替規(guī)律

如圖3 所示，細菌群落中的厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）占主導(dǎo)地位；濃香型發(fā)酵酒醅主要存在12 個優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞1%），分別為Lactobacillus、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、unclassified_f_Enterobacteriaceae、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、Kroppenstedtia、不動桿菌屬（Acinetobacter）、片球菌屬（Pediococcus）等，在窖內(nèi)發(fā)酵前期，Lactobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Weissella、Pseudomonas、Klebsiella等是優(yōu)勢細菌屬，Bacillus和Staphylococcus的相對豐度分別為5.3%～13.9%和0.4%～15.6%，隨著酒醅發(fā)酵進行，Thermoactinomyces、Weissella的相對豐度迅速下降。發(fā)酵15 d后，Bacillus、Staphylococcus等菌屬的相對豐度降低，Lactobacillus在發(fā)酵15～20 d相對豐度增加29%，15 d后成為酒醅發(fā)酵過程中的絕對優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞89.6%），Lactobacillus在酒醅整個發(fā)酵過程中占據(jù)絕對的優(yōu)勢地位，相對豐度維持在47%以上，優(yōu)勢細菌屬與高江婧[18]、翟磊[19]等研究結(jié)果一致。

圖3 細菌群落結(jié)構(gòu)門水平（A）和屬水平（B）組成分布Fig.3 Distribution of bacterial community structure at phylum (A) and genus (B) levels

2.4 酒醅發(fā)酵過程中真菌群落演替規(guī)律

如圖4 所示，真菌群落中的子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）占主導(dǎo)地位；濃香型發(fā)酵酒醅中主要存在12 個優(yōu)勢真菌屬（相對豐度＞1%），分別為Kazachstania、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、青霉屬（Penicillium）、unclassified_f_Aspergillaceae、季也蒙酵母屬（Meyerozyma）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、假絲酵母菌屬（Candida）、unclassified_f__Dipodascaceae、曲霉菌屬（Aspergillus）、Thermoascus等。其中，Kazachstania、Wickerhamomyces是濃香型白酒酒醅整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬，在發(fā)酵5～10 dKazachstania的相對豐度為47%～53%，10 d后開始降低，但始終高于14%；Penicillium在發(fā)酵30 d相對豐度達到最高（12%），與細菌群落結(jié)構(gòu)不同的是酒醅發(fā)酵過程中真菌存在多個優(yōu)勢菌屬，Meyerozyma在發(fā)酵5～10、40～60 d是優(yōu)勢菌屬，Debaryomyces在10～15 d相對豐度由0.4%增加到17.0%，Candida在10～15、40～60 d是優(yōu)勢菌屬之一，此外Aspergillus、Thermoascus、嗜熱真菌屬（Thermomyces）等微生物均為濃香型白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬。

圖4 真菌群落結(jié)構(gòu)門水平（A）和屬水平（B）組成分布Fig.4 Distribution of fungal community structure at phylum (A) and genus (B) levels

綜上，濃香型酒醅細菌以Lactobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces為主，真菌以Kazachstania、Wickerhamomyces、Penicillium、Meyerozyma、Debaryomyces、Candida、Aspergillus為主，其中Lactobacillus、Kazachstania、Wickerhamomyces占絕對優(yōu)勢。

由上述濃香型酒醅微生物群落演替規(guī)律可知，酒醅發(fā)酵前期與后期的微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，15～20 d是微生物群落結(jié)構(gòu)劇烈變化的時期，Lactobacillus在發(fā)酵過程中相對豐度不斷升高，該菌具有較強的碳水化合物代謝能力，能夠?qū)⑻穷愞D(zhuǎn)化為乳酸，這可能是酒醅發(fā)酵過程中酸度不斷升高的原因，同時乳酸能與乙醇通過酯化反應(yīng)生成濃香型白酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)乳酸乙酯，還可以作為其他脂肪酸的底物[20]。Kazachstania、Wickerhamomyces等真菌屬在酒醅發(fā)酵過程中保持較高的豐度，Kazachstania廣泛分布于酸面團、泡菜、青貯飼料等植物乳酸發(fā)酵過程，同化乳酸，并水解葡萄糖醛酸苷作為異型發(fā)酵乳酸菌的代謝底物，促進其利用果糖產(chǎn)乙酸[21]。Kazachstania也是濃香型白酒酒醅微環(huán)境的標志性酵母種屬之一，對濃香型白酒風(fēng)味有重要影響[22]。Jood等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Kazachstania對酒體風(fēng)味的貢獻主要體現(xiàn)在異丙醇和異戊醇。研究表明，濃香型白酒的發(fā)酵過程主要是微生物間的共同發(fā)酵，通過互相協(xié)調(diào)和抑制實現(xiàn)釀造過程中的微生物動態(tài)平衡[24]，微生物在發(fā)酵過程中的演替使酒醅菌群代謝更完整，同時與窖內(nèi)酒醅的理化環(huán)境密切相關(guān)。

2.5 酒醅理化指標與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

根據(jù)微生物群落結(jié)構(gòu)的組成，將不同發(fā)酵時間的酒醅分為2 個階段（5～15 d和20～60 d），通過相關(guān)性分析闡明酒醅樣品、發(fā)酵參數(shù)與微生物之間的關(guān)系。如圖5A、B所示，RDA結(jié)果顯示了細菌群落與真菌群落在樣品中的分布，解釋了不同發(fā)酵時期理化指標與酒醅樣品96.15%和65.27%的關(guān)系，說明樣品的分布與理化指標存在一定的相關(guān)性。水分、還原糖、淀粉含量對濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)具有強烈影響[25]，RDA表明，發(fā)酵前期細菌群落和真菌群落主要受到淀粉與還原糖的影響，Bacillus、Pseudomonas、unclassified_f_Enterobacteriaceae、Kazachstania、Wickerhamomyces與還原糖、淀粉含量呈正相關(guān)，發(fā)酵后期細菌群落和真菌群落主要受到水分含量與酸度的影響，Lactobacillus、Penicillium、unclassified_f_Aspergillaceae與水分含量、酸度呈正相關(guān)，可見在濃香型白酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵參數(shù)的驅(qū)動力可能會影響微生物的組成結(jié)構(gòu)。

圖5 酒醅發(fā)酵過程中理化指標與微生物相關(guān)性分析Fig.5 Analysis of correlation between physicochemical indicators and microbial communities

為了解理化指標對優(yōu)勢菌屬的影響，通過Spearman系數(shù)評估微生物與理化指標的相關(guān)性，如圖5C、D所示，水分含量、酸度與Lactobacillus呈顯著正相關(guān)（P＜0.0 5），但與10 個細菌屬呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；還原糖含量與Lactobacillus呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），與Pseudomonas、Enterobacter等8 個細菌屬呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；淀粉含量與Bacillus、Staphylococcus等8 個細菌屬呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。淀粉和還原糖含量與真菌中的Kazachstania呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與其他菌屬呈負相關(guān)，但相關(guān)性未達到顯著水平，水分含量和酸度與Kazachstania呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），可見濃香型白酒發(fā)酵過程中的理化指標對真菌群落的影響較小，相關(guān)性分析表明，酒醅的酸度、水分、淀粉、還原糖含量與微生物菌群顯著相關(guān)，有研究表明，水分、還原糖、淀粉含量可作為酒醅微生物調(diào)控和香氣調(diào)控的指標，從而間接調(diào)節(jié)白酒的風(fēng)味和品質(zhì)，理化指標對濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響通過微生物代謝實現(xiàn)[26]。

2.6 酒醅發(fā)酵過程中微生物代謝的變化

結(jié)合酒醅微生物物種注釋結(jié)果和KEGG數(shù)據(jù)庫繪制代謝圖，濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程中微生物主要參與的代謝包括糖酵解、乙醇合成、酸代謝等（圖6A），不同發(fā)酵時期的微生物群落組成結(jié)構(gòu)不同，解析不同發(fā)酵時期酒醅中微生物的潛在功能有利于了解發(fā)酵特性，通過PICRUSt標記基因序列預(yù)測不同發(fā)酵階段酒醅微生物群落的功能酶及其豐度信息，并繪制氣泡圖，如圖6B所示，隨Penicillium、Aspergillus相對豐度的增加，糖原磷酸化酶（EC2.4.1.1）、磷酸葡萄糖變位酶（EC5.4.2.2）、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（EC5.3.1.9）、果糖二磷酸酶（EC3.1.3.11）等表達水平開始上調(diào)，這些酶與淀粉代謝密切相關(guān)，這也解釋了淀粉含量在發(fā)酵10 d后迅速降低的原因，30 d后降低緩慢，淀粉會轉(zhuǎn)化為乙醇，可見前30 d是酒醅的主發(fā)酵期，發(fā)酵后期是微生物代謝產(chǎn)物的平衡。Lactobacillus在酒醅發(fā)酵過程中豐度不斷增加，與之相關(guān)的磷酸甘油酸激酶（EC2.7.2.3）、磷酸甘油酸變位酶（EC5.4.2.11、EC5.4.2.12）、磷酸烯醇式丙酮酸（EC4.2.1.11）、丙酮酸激酶（EC2.7.1.40）以及乳酸脫氫酶（EC1.1.1.27）多種酶的表達水平逐漸增高，表明可能是由于酒醅中乳酸脫氫酶的高表達積累了大量乳酸，使酒醅的酸度在發(fā)酵過程中不斷升高，Lactobacillus的存在可能影響糖酵解代謝過程中酶的表達。乙醛可以由乙醇脫氫生成，脫氫酶作為產(chǎn)乙醛途徑的關(guān)鍵酶，其在發(fā)酵中期的表達有利于乙醛的積累及濃香型白酒的酸代謝，該過程可能涉及Kazachstania、Sterigmatomyces的參與，這些菌屬能夠分泌淀粉酶及纖維素酶，也能夠在酒醅發(fā)酵前期為其他微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時與酵母之間的相互作用影響原料的出酒率[27]。

圖6 酒醅微生物參與的代謝（A）及其相關(guān)酶的豐度變化（B）Fig.6 Metabolism involving microorganisms in fermented grains (A) and changes in the abundance of associated enzymes (B)

乙酰輔酶A是酸代謝途徑中合成脂肪酸的關(guān)鍵前體物質(zhì)，醋酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶（EC2.8.3.8）是己酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，該酶在發(fā)酵中期的表達水平較高，有利于濃香型白酒主體風(fēng)味己酸乙酯前體物質(zhì)己酸的合成，該過程可能涉及Bacillus、Staphylococcus等菌屬的參與，Bacillus是酒醅中的重要功能菌，為白酒釀造過程提供豐富的淀粉酶或蛋白酶，對白酒風(fēng)味物質(zhì)具有重要影響[28]。黃治國等[29]將芽孢桿菌應(yīng)用于小曲酒發(fā)酵，降低了小曲酒的高級醇含量。Staphylococcus能夠豐富濃香型白酒的風(fēng)味，具有促進乙醇、醛類和酯類物質(zhì)合成的潛力。通過PICRUSt預(yù)測發(fā)現(xiàn)，糖酵解代謝相關(guān)的功能酶在發(fā)酵前期較活躍，酸代謝相關(guān)的功能酶在發(fā)酵中后期較活躍，并且這些酶與酒醅中的優(yōu)勢菌屬相關(guān)，可見在發(fā)酵過程中酒醅微生物的演替有利于濃香型白酒風(fēng)味的形成。

3 結(jié)論

本研究基于高通量測序技術(shù)研究濃香型酒醅微生物的群落演替規(guī)律及潛在的代謝功能，結(jié)果表明：在門水平，F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria、Actinobacteriota、Ascomycota、Basidiomycota是酒醅中的優(yōu)勢菌門，在屬水平，Lactobacillus是發(fā)酵15 d之后酒醅中的絕對優(yōu)勢細菌屬，Kazachstania、Wickerhamomyces是整個發(fā)酵過程中酒醅的優(yōu)勢真菌屬，細菌多樣性隨著發(fā)酵的進行不斷降低，真菌多樣性在發(fā)酵過程中較為穩(wěn)定，理化指標與細菌群落的相關(guān)性更強；通過功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Penicillium、Aspergillus主要參與糖酵解代謝，該過程葡萄糖被降解為丙酮酸，隨后在厭氧條件下被Lactobacillus還原成乳酸，Bacillus、Staphylococcus等涉及乙酸、丁酸、己酸的代謝，Kazachstania、Sterigmatomyces等涉及乙醇的合成，酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化影響糖酵解、酸代謝、乙醇合成相關(guān)的酶，說明濃香型酒醅微生物的演替規(guī)律與風(fēng)味物質(zhì)代謝密切相關(guān)，目前關(guān)于濃香型酒醅微生物與風(fēng)味物質(zhì)代謝的機制尚不清晰，這將是后期研究的重點。綜上所述，本研究解析了濃香型白酒酒醅微生物的演替規(guī)律及其功能預(yù)測，為深入研究酒醅微生物在釀造過程中的作用提供了研究基礎(chǔ)。