馬 慧，顧雪敏，梅 潔，李 芳，王佳利，王梓棚，孔令明,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，新疆 烏魯木齊 830021）

抗菌肽又稱抗生素肽、肽類抗生素，是來源于動(dòng)物、植物和微生物等生物體的一類疏水性陽離子多肽[1-2]。由于抗菌肽具有抗菌活性高、抗菌譜廣、分子質(zhì)量低等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)[3-5]，被廣泛應(yīng)用于食品防腐、動(dòng)物飼料和生物醫(yī)藥領(lǐng)域[6-8]。近年來，國內(nèi)外有大量學(xué)者研究了從鯽魚鱗[9]、辣椒籽蛋白[10]及牛乳酪蛋白[11]等動(dòng)植物體中分離出的具有抑菌活性的多肽類物質(zhì)。研究表明，核桃粕經(jīng)過酶解后具有抗氧化[12]、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制[13]等活性，但對(duì)于其抑菌特性，以及核桃粕谷蛋白經(jīng)過菌酶協(xié)同處理后制備抗菌肽的報(bào)道較少。

核桃粕是核桃榨油后的副產(chǎn)物，蛋白含量可達(dá)43.8%[14]，且氨基酸種類豐富，是一種可為人體提供豐富氨基酸的植物源蛋白原料[15]。但目前核桃粕整體利用率較低，常被用于動(dòng)物飼料或直接丟棄，導(dǎo)致蛋白資源的浪費(fèi)[16]。核桃粕蛋白主要由谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶谷蛋白構(gòu)成[17-18]。其中，清蛋白和球蛋白的溶解性最佳，目前相關(guān)研究較多[19-20]；而含量最多的谷蛋白（70%以上）的溶解性最差，針對(duì)谷蛋白的功能性質(zhì)與生理活性的研究也相對(duì)較少[21]。菌酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)綜合了微生物發(fā)酵和酶解技術(shù)兩大優(yōu)勢(shì)，通過酶解可以為微生物的發(fā)酵過程供給氮源和碳源等基本營養(yǎng)素，同時(shí)發(fā)酵技術(shù)還能夠克服單純酶解所帶來的功能元素缺失等問題。將二者有機(jī)融合不僅可以降低活性肽的生產(chǎn)成本，也可在生產(chǎn)中起到原料解毒和脫苦的作用[22]。

因此，為充分利用核桃粕，提高其資源利用率，以核桃粕谷蛋白為原料，采用菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵的方式制備抗菌肽。在前期實(shí)驗(yàn)中，已明確核桃谷蛋白抗菌肽菌酶協(xié)同最佳制備工藝。在此基礎(chǔ)上，為獲得具有更高活性的核桃粕谷蛋白抗菌肽段，以大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌圈直徑為指標(biāo)，采用超濾、凝膠過濾層析分離、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）進(jìn)一步分離純化谷蛋白抗菌肽，篩選出具有較強(qiáng)活性的多肽。并通過分子對(duì)接技術(shù)對(duì)谷蛋白抗菌肽與大腸桿菌進(jìn)行對(duì)接模擬，對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)并確定其分子機(jī)制。后通過研究谷蛋白抗菌肽在高溫?zé)崽幚?、紫外線、不同pH值和不同蛋白酶處理后的抑菌性保持率表征其穩(wěn)定性，這一研究不但能夠提高核桃粕的綜合利用價(jià)值，而且對(duì)核桃谷蛋白抗菌肽的開發(fā)利用具有意義，同時(shí)為研發(fā)一種新型抗生素的替代品及食品級(jí)抗菌劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃谷蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制；枯草芽孢桿菌CICC 10732、金黃色葡萄球菌CICC 10384、大腸桿菌CICC 10899 廣東微生物研究所；麥?zhǔn)媳葷峁?溫州康泰生物有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、酸性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、胰蛋白酶、胃蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Zorbax 300SB-C18多肽捕捉器 美國Agilent Technologie公司；CHRIST真空冷凍干燥機(jī) 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；xMark-10593酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；AL204電子天平（精度千分之一）瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；LHS-100CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；5817R低溫離心機(jī) 德國艾本德公司；ALPCL-40L高溫高壓滅菌鍋上海思默生物科技有限公司；V D-8 5 0 超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；凝膠層析系統(tǒng) 上海滬西分析儀器有限公司；GS-NF500實(shí)驗(yàn)室微型納濾系統(tǒng) 上海顧信生物科技有限公司；Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司；WD-9403B紫外儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 核桃粕谷蛋白的提取

參考Sze-Tao[23]、毛曉英[24]等關(guān)于核桃蛋白組分分離提取谷蛋白的方法，并稍作修改。以脫脂核桃粕為原料，依次使用去離子水、1 mol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、0.1 mol/L NaOH溶液提取清蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白。為確保每種蛋白組分充分提取，每項(xiàng)步驟重復(fù)3 次，將制備的谷蛋白真空冷凍干燥后于-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.3.2 菌種活化及種子液制備

枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為抑菌性實(shí)驗(yàn)指示菌。將這3 種菌分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24 h，用接種環(huán)挑取2 環(huán)菌體接入100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)12 h。之后取活化完成的液體培養(yǎng)基1 mL接入100 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到發(fā)酵種子液，使用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)節(jié)菌液濃度至107CFU/mL[25]。

1.3.3 菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵谷蛋白及樣品處理

核桃谷蛋白經(jīng)粉碎后過40 目篩，在若干50 mL燒杯中準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.01 g）于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)所得菌酶協(xié)同最佳制備條件，以接種量5%（V/V）、料液比1∶1.5（g/mL）、發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時(shí)間3 d、堿性蛋白酶加酶量400 U/g進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵。發(fā)酵完畢后95 ℃條件下滅酶15 min，于55 ℃烘箱干燥48 h，粉碎過篩備用。

按照武萬興[26]的方法，略微修改。取2 g發(fā)酵樣品（精確至0.000 1 g），加入40 mL蒸餾水，磁力攪拌30 min，取一定體積上清液，加入等體積10 g/100 mL三氯乙酸溶液，4 000 r/min離心15 min得上清液，過0.45 μm微孔濾膜除去大分子蛋白和細(xì)菌后真空冷凍干燥，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 抑菌活性測定

發(fā)酵樣品加入2.5 倍體積無菌水稀釋，4 000 r/min下離心15 min。向培養(yǎng)皿中倒入LB固體培養(yǎng)基15 mL，等培養(yǎng)基凝固后分別取150 μL不同菌液用涂布器在LB固體培養(yǎng)基表面均勻涂布，放置3 個(gè)牛津杯（內(nèi)徑6 mm）在每個(gè)培養(yǎng)皿上，分別向其中加入發(fā)酵樣液100 μL，同時(shí)加入等體積無菌生理鹽水作空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，培養(yǎng)結(jié)束后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，取平均值。

1.3.5 超濾分離

將核桃抗菌肽配制成10 mg/mL的多肽溶液，過0.45 μm微孔濾膜后依次通過截留分子質(zhì)量為30、10、3 kDa的超濾膜進(jìn)行分級(jí)超濾，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速60 r/min，超濾膜出口壓力2～5 bar，收集超濾后的各組分溶液，將其冷凍干燥后，以其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)篩選抑菌能力最強(qiáng)的超濾組分[27]，選擇抑菌活性最好的組分進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化

將溶脹好的葡聚糖凝膠G-25裝載到1.6 cm×60 cm的玻璃層析柱，用超純水平衡凝膠層析柱。參考趙俠等[28]的方法略作修改，將超濾所得的抑菌效果好的組分溶于超純水（20 mg/mL）中，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后，加載到層析柱中。每次上樣量為1 mL，使用超純水洗脫樣品，恒流泵轉(zhuǎn)速15 r/min。用核酸蛋白檢測儀在280 nm波長處測定吸光度，每2 min收集一次洗脫峰組分。將不同組分冷凍干燥后以其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)篩選抑菌能力最強(qiáng)的洗脫組分[29]，選擇抑菌活性最好的組分進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.3.7 核桃谷蛋白抗菌肽的質(zhì)譜鑒定

使用LC-MS/MS測定核桃谷蛋白抗菌肽的氨基酸序列。色譜條件：流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)84%乙腈溶液（含0.1%甲酸）；RP-C18液相色譜柱（0.15 mm×150 mm，5 μm）以95%的流動(dòng)相A進(jìn)行平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Zorbax 300SB-C18多肽捕捉器，再經(jīng)過液相色譜柱分離。質(zhì)譜鑒定：產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析時(shí)長60 min，檢測方式：正離子，每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜（MS2scan）。

1.3.8 核桃谷蛋白抗菌肽的虛擬篩選

在抗菌肽數(shù)據(jù)庫（antimicrobial peptide database，APD）中輸入鑒定得到的多肽序列，篩選有機(jī)會(huì)成為抗菌肽的肽段[30]。將有潛在抗菌活性的肽段通過NovoPro在線工具預(yù)測疏水性和凈電荷數(shù)。由于抗菌肽中高比例的疏水性和帶正電荷的氨基酸殘基對(duì)其抗菌活性至關(guān)重要[31-32]，因此選擇疏水性和凈電荷數(shù)均較高的肽段進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）中篩選大腸桿菌原始株來源且分辨率較高的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6SPP）作為分子對(duì)接受體，6SPP的分辨率為1.49 ?。使用Pymol軟件去除受體蛋白結(jié)晶水、原始配體等；使用Discovery Studio 2019軟件預(yù)測6SPP結(jié)合位點(diǎn)。多肽的3D結(jié)構(gòu)采用ChemDraw 21.0和Chem3D構(gòu)建。采用AutoDock Tools1.5.6軟件模擬谷蛋白抗菌肽與6SPP結(jié)構(gòu)相互作用的氨基酸及作用力模式。靶點(diǎn)相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：center_x＝8.824，center_y＝0.886，center_z＝37.808；格點(diǎn)盒子設(shè)置為：size_x＝80，size_y＝60，size_z＝100（每個(gè)格點(diǎn)的間距為0.375 ?）。其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。將對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入Pymol和Discovery Studio 2019軟件進(jìn)行可視化分析。

1.3.10 抗菌肽的穩(wěn)定性分析

1.3.10.1 熱穩(wěn)定性

參考肖建輝[33]的方法作一定修改。將1.3.5節(jié)超濾得到的抑菌活性最好的組分冷凍干燥后配制成終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抗菌肽溶液。取6 份抗菌肽溶液分別于-20、4、30、60、90、121 ℃處理30 min，分別取50 μL抗菌肽溶液、190 μL LB肉湯培養(yǎng)基和10 μL稀釋好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試液加入96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)儀測定OD600nm。以無菌水作為空白組，未處理抗菌肽溶液作為對(duì)照組，測定加熱溫度對(duì)抗菌肽活性的影響[34]。按照上述步驟，將抗菌肽于90 ℃沸水浴中分別加熱5、10、15、20、25 min，測定加熱時(shí)間對(duì)抗菌肽活性的影響。按下式計(jì)算谷蛋白抗菌肽抑菌性保持率。

式中：OD空白、OD實(shí)驗(yàn)、OD對(duì)照分別表示空白組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的OD600nm。

1.3.10.2 酸堿穩(wěn)定性

參考徐曉裕等[35]的方法，用無菌水配制終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抗菌肽溶液，使用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH配制pH值分別為2、4、6、8、10的溶液，將抗菌肽溶液與不同pH值的溶液等體積混合，取50 μL抗菌肽溶液、190 μL LB肉湯培養(yǎng)基和10 μL稀釋好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試液加入96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h后測定OD600nm。以無菌水作為空白組，抗菌肽在正常生理環(huán)境下（pH 7.4）的OD600nm作為對(duì)照組。按照1.3.10.1節(jié)公式計(jì)算抑菌性保持率。

1.3.10.3 紫外輻射穩(wěn)定性

參考柳梅[36]的方法作一定修改，將質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抗菌肽在紫外儀下分別照射10、20、30、40、50 min，測定紫外輻射時(shí)間對(duì)抗菌肽活性的影響。分別取50 μL抗菌肽溶液、190 μL LB肉湯培養(yǎng)基和10 μL稀釋好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試液加入96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h后測定OD600nm。以無菌水作空白組，未處理抗菌肽溶液作為對(duì)照組。按1.3.10.1節(jié)公式計(jì)算抑菌性保持率。

1.3.10.4 不同蛋白酶水解能力穩(wěn)定性

參考趙萍[37]、李心丹[38]等的方法并作一定修改，用無菌水溶解肽樣品，配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的抗菌肽溶液。等體積的抗菌肽溶液與1 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶于37 ℃水浴處理1 h，與酸性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶于45 ℃水浴處理1 h后，沸水浴滅酶。取50 μL抗菌肽溶液、190 μL LB肉湯培養(yǎng)基和10 μL稀釋好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌測試液加入96 孔板中測定OD600nm。無菌水作空白組，未經(jīng)過蛋白酶處理的抗菌肽溶液作為對(duì)照組，按1.3.10.1節(jié)公式計(jì)算抑菌性保持率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021軟件進(jìn)行制圖，利用SPSS Statistics 20軟件采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。每個(gè)樣品均作3 個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾各組分抑菌活性

如圖1所示，核桃谷蛋白抗菌肽超濾后分離出4 種不同分子質(zhì)量的多肽組分：WGP-I（Mw＜3 kDa）、WGP-II（3 kDa＜Mw＜10 kDa）、WGP-III（10 kDa＜Mw＜30 kDa）、WGP-IV（Mw＞30 kDa）。這4 種組分對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。WGP-III組分的抑菌圈直徑顯著大于其他3 種組分（P＜0.05），對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為19.53 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為18.51 mm，抑菌活性最強(qiáng)；WGP-II有較強(qiáng)的抑菌活性；WGP-I和WGP-IV抑菌活性相對(duì)較弱，但抑菌圈平均直徑也大于13 mm。

圖1 各超濾組分抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of ultrafiltration fractions

2.2 Sephadex G-25層析分離純化

進(jìn)一步對(duì)WGP-III組分進(jìn)行凝膠過濾層析分離。由圖2可知，共得到3 個(gè)組分。經(jīng)過抑菌性測定，組分A和C對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較優(yōu)（表1），對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均達(dá)到15 mm以上，且與B組分對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑有顯著差異（P＜0.05）。因此，本研究選擇WGP-IIIA、WGP-IIIC組分做進(jìn)一步抗菌肽鑒定。

表1 WGP-III組分經(jīng)Sephadex G-25層析組分抑菌圈直徑Table 1 Diameters of inhibition zones of WGP-III fractions separated by Sephadex G-25 chromatography

圖2 WGP-III組分經(jīng)Sephadex G-25層析分離純化色譜圖Fig.2 Sephadex G-25 chromatogram of WGP-III

2.3 核桃谷蛋白抗菌肽的質(zhì)譜鑒定

用LC-MS/MS對(duì)WGP-IIIA和WGP-IIIC組分中抗菌肽進(jìn)行鑒定，得到的肽段通過APD篩選有可能成為抗菌肽的肽序列，將篩選得到的序列通過NovoPro在線工具預(yù)測，選擇疏水性和凈電荷數(shù)均較高的肽段。

如表2 所示，從WGP-IIIA 組分中得到1 條疏水性和凈電荷均較高的肽段，為Leu-Ala-Glu-Ala-Tyr-Asn-Ile-Pro-Asp-Thr-Ile-Ala-Arg-Arg-Leu（LAEAYNIPDTIARRL）；從WGP-IIIC組分中得到5 條疏水性和凈電荷數(shù)均較高的抗菌肽，分別為Ala-Pro-Gln-Leu-Val-Tyr-Ile-Ala-Arg（APQLVYIAR）、Ser-His-Ser-Val-Ile-Tyr-Val-Ile-Arg（SHSVIYVIR）、Ala-Pro-Gln-Leu-Leu-Tyr-Ile-Val-Lys（APQLLYIVK）、Asp-Val-Leu-Ile-Asn-Ala-Tyr-Arg（DVLINAYR）、Ser-Val-Ile-Tyr-Val-Ile-Arg-Gly-Asn（SVIYVIRGN），這5 條肽段肽鏈長度均為8～9 個(gè)氨基酸，且以九肽為主，分子質(zhì)量為962.518 5～1 072.602 9 Da，肽段鑒定得分都在100 分以上。6 條多肽質(zhì)譜圖如圖3所示。

表2 谷蛋白抗菌肽虛擬篩選Table 2 Virtual screening of antimicrobial peptides from walnut glutenin

圖3 6 條多肽質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of six peptides

抗菌肽抑菌活性強(qiáng)弱與多肽序列中某些特殊氨基酸殘基密切相關(guān)，如富含Arg和Val的抗菌肽由于和細(xì)胞膜脂質(zhì)層有較強(qiáng)的靜電吸附力而發(fā)揮良好抗菌活性[39]；富含Pro和Gly對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)與抗菌活性發(fā)揮有重要作用[40]。而鑒定得到的6 條抗菌肽中WGP-IIIC組分中的APQLVYIAR含有Val和Arg；SHSVIYVIR富含Val和Arg；APQLLYIVK中含有Pro和Val；DVLINAYR中含有Val和Arg；SVIYVIRGN中含有Val、Arg、Gly。WGPIIIA組分中的LAEAYNIPDTIARRL含有Ala、Pro和Arg。說明鑒定得到的6 條多肽序列具有較強(qiáng)的抑菌活性。

2.4 分子對(duì)接模擬

分子對(duì)接是預(yù)測配體結(jié)合模式及其與靶蛋白受體結(jié)合能的首選方法[41]。對(duì)接分子間能是配體與受體結(jié)合時(shí)活性口袋復(fù)合物分子本身所具有的內(nèi)張力，它決定著分子結(jié)合的穩(wěn)定程度，內(nèi)能越小，結(jié)合越穩(wěn)定[42]。而分子對(duì)接中結(jié)合能越低，多肽與配體的結(jié)合作用力越強(qiáng)[43]。因此，以結(jié)合能和分子間能為指標(biāo)，將6 條抗菌肽與大腸桿菌來源結(jié)晶體6SPP進(jìn)行分子對(duì)接模擬。

分子對(duì)接結(jié)果表明，多肽與6SPP之間至少有1 種相互作用，這些相互作用（氫鍵作用、疏水相互作用、范德華力）可以穩(wěn)定多肽-受體結(jié)構(gòu)。如表3所示，在篩選得出的6 條多肽中，WGP-IIIC組分的SHSVIYVIR和APQLLYIVK結(jié)合能和分子間能都較低，結(jié)合能分別為0.78、1.64 kcal/mol，分子間能分別為-9.07、-9.10 kcal/mol。WGP-IIIA組分的LAEAYNIPDTIARRL結(jié)合能為9.20 kcal/mol，分子間能為-4.52 kcal/mol。即WGP-IIIC組分的SHSVIYVIR和APQLLYIVK與大腸桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力。而WGP-IIIA組分的LAEAYNIPDTIARRL與大腸桿菌分子間結(jié)合能力較差。

表3 多肽與6SPP的結(jié)合能及分子間能Table 3 Binding energy and intermolecular energy between polypeptides and 6SPP

圖4所示為6SPP活性結(jié)合區(qū)域，結(jié)合圖5～7可知，SHSVIYVIR與Asn507（2.42 ?）和Asn525（2.37 ?）形成了2 個(gè)常規(guī)氫鍵，與Glu509、Glu500、Glu503、Thr508、Ala504形成了范德華力。APQLLYIVK與Asp156（2.31 ?）、Asp138（2.21 ?）、Gln227（2.10 ?）、Thr168（3.00 ?）、Ser125（2.98 ?）形成了5 個(gè)常規(guī)氫鍵，與Phe191（4.98 ?）和Ile124（5.08 ?）形成疏水相互作用，與Trp229、Pro167、Gln228、Gln126、Ser166、Met184和Glu169形成了范德華力。LAEAYNIPDTIARRL與Gly398（2.37?）和Ser394（2.22 ?）形成2 個(gè)氫鍵，與Lys465、Pro460、Arg395、Phe399形成范德華力[44]。綜合分析，LAEAYNIPDTIARRL與大腸桿菌分子間的作用力較SHSVIYVIR和APQLLYIVK少，所形成的多肽-受體結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定。結(jié)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，WGP-IIIC組分的抑菌活性比WGP-IIIA組分強(qiáng)。

圖4 6SPP結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 6SPP binding site

圖5 SHSVIYVIR分子對(duì)接Fig.5 Molecular docking of SHSVIYVIR

圖6 APQLLYIVK分子對(duì)接Fig.6 Molecular docking of APQLLYIVK

圖7 LAEAYNIPDTIARRL分子對(duì)接Fig.7 Molecular docking of LAEAYNIPDTIARRL

2.5 谷蛋白抗菌肽抑菌穩(wěn)定性分析

2.5.1 熱穩(wěn)定性分析

由圖8A可知，谷蛋白抗菌肽在-20 ℃條件下對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性保持率分別為85.16%和87.45%，隨溫度升高，抑菌活性也相對(duì)下降。當(dāng)溫度到達(dá)90 ℃時(shí)，抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌性保持率下降至56.8%，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌性保持率下降至33.98%。當(dāng)抗菌肽在121 ℃下處理30 min后，對(duì)大腸桿菌的抑菌性保持率為31.62%，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌性保持率為16.11%，表明在高溫處理下，核桃谷蛋白抗菌肽對(duì)大腸桿菌仍具有一定的抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌性保持率較差。

圖8 谷蛋白抗菌肽熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of antimicrobial peptides

由圖8B可知，在90 ℃沸水中，隨加熱時(shí)間延長，抗菌肽對(duì)2 種菌的抑菌活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，加熱到25 min時(shí)，谷蛋白抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌性保持率為47.49%，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌性保持率僅為24.79%。結(jié)合加熱溫度的影響結(jié)果，核桃谷蛋白抗菌肽具有一定的耐熱性，這與張琦等[45]研究結(jié)果一致。但過度的高溫也會(huì)造成抗菌肽抑菌活性下降，原因可能是高溫破壞了抗菌肽的結(jié)構(gòu)，使其活力消失[46]。因此，為消除因受熱導(dǎo)致的抗菌活性降低問題，抗菌肽應(yīng)注意低溫保存。

2.5.2 紫外照射時(shí)間對(duì)谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響

如圖9所示，紫外照射時(shí)間對(duì)谷蛋白抗菌肽的抑菌活性影響較小。在10～50 min，抑菌性保持率緩慢下降直至趨于平緩。對(duì)大腸桿菌平均抑菌性保持率為88.9%，對(duì)金黃色葡萄球菌平均抑菌性保持率為84.78%，說明谷蛋白抗菌肽在50 min內(nèi)對(duì)紫外線具有較高的穩(wěn)定性，這可能是由于抗菌肽經(jīng)紫外線照射后結(jié)構(gòu)與性質(zhì)并未發(fā)生改變，因此對(duì)抑菌活性的影響也較小[47]。

圖9 紫外照射時(shí)間對(duì)谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響Fig.9 Effect of ultraviolet irradiation time on the activity of antibacterial peptides

2.5.3 pH值對(duì)谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響

由圖10可知，隨pH值升高，抗菌肽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性保持率呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢(shì)。pH 2～10平均抑菌性保持率大于30%，其中，pH值為2和10時(shí)抑菌活力較低，pH 6～8時(shí)抑菌性保持率較高，pH 8時(shí)，谷蛋白抗菌肽對(duì)大腸桿菌抑菌性保持率達(dá)到87.58%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性保持率達(dá)到85.33%。綜上，谷蛋白抗菌肽具有一定的耐酸堿能力。

圖10 pH值對(duì)谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響Fig.10 Effect of pH on the activity of antimicrobial peptides

2.5.4 不同種類酶對(duì)谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響

由圖11可知，谷蛋白抗菌肽對(duì)中性蛋白酶最耐受，受酸性蛋白酶影響最大。在酸性蛋白酶作用下，抗菌肽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌性保持率僅為24.17%和19.01%。除中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胃蛋白酶外，抗菌肽在其他酶作用下對(duì)2 種致病菌的抑菌性保持率均在35%以下。表明谷蛋白抗菌肽易受蛋白酶影響，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意酶解對(duì)抗菌肽的影響。

圖11 不同種類酶對(duì)谷蛋白抗菌肽抑菌效果的影響Fig.11 Effects of different proteases on the activity of antibacterial peptides

3 結(jié)論

通過菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵法（枯草芽孢桿菌和堿性蛋白酶協(xié)同）制備核桃粕谷蛋白抗菌肽，經(jīng)超濾、凝膠層析過濾分離、LC-MS/MS鑒定后，篩選高活性肽段，結(jié)合分子對(duì)接手段分析高活性肽段對(duì)大腸桿菌原始株來源的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6SPP）相互作用的氨基酸殘基及作用力模式。進(jìn)一步對(duì)制備的谷蛋白抗菌肽進(jìn)行熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外照射穩(wěn)定性及不同蛋白酶處理下的穩(wěn)定性分析，為谷蛋白抑菌肽的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

具體結(jié)果如下：WGP超濾分離結(jié)果表明分子質(zhì)量3～10 kDa的組分WGP-III抑菌效果最好；WGP-III組分經(jīng)過SephadexG-25層析純化后，共分離出3 個(gè)組分，選擇抑菌效果較好的WGP-IIIA和WGP-IIIC進(jìn)行LC-MS/MS鑒定；LC-MS/MS鑒定結(jié)合分子對(duì)接篩選得到3 個(gè)多肽序列，包括WGP-IIIA組分的LAEAYNIPDTIARRL和WGPIIIC組分的SHSVIYVIR、APQLLYIVK，以上3 個(gè)多肽與6SPP之間至少有1 種相互作用（氫鍵作用、疏水相互作用、范德華力），這些作用力可能是谷蛋白抗菌肽對(duì)大腸桿菌具有良好抑制作用的原因，分子對(duì)接結(jié)合抑菌結(jié)果顯示，WGP-IIIC組分的抑菌活性比WGP-IIIA組分強(qiáng)；谷蛋白抗菌肽具有良好的穩(wěn)定性，經(jīng)不同加熱時(shí)間、不同溫度、紫外線照射和不同蛋白酶處理后依舊具有較好的抑菌性保持率，具有一定的耐高溫、耐低溫能力，-20 ℃貯藏條件下對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌性保持率分別為85.16%和87.45%，90 ℃時(shí)，抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌活性最好，121 ℃下對(duì)大腸桿菌的抑菌性保持率為31.62%。這一特性可應(yīng)用于冷熱加工食品的防腐保鮮劑領(lǐng)域。未來的研究方向應(yīng)聚焦于谷蛋白抗菌肽的生物抑菌特性以及在體內(nèi)的安全性機(jī)制分析，為抗菌肽作為新型抗生素的替代品以及在食品級(jí)抗菌劑領(lǐng)域的具體應(yīng)用提供新思路。