閆浩鑫，李明蔚，吳 洋，郭龍軍★，馮 力，★

（1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163000；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

線粒體ATP 合酶是一種位于線粒體膜內的多亞基酶復合物，是生理條件下氧化磷酸化所必需的。ATP 合酶由兩部分組成：F1 的水溶性蛋白質復合物和疏水部分F0。F1 由3 種α 亞基和3 種β亞基交替排列,組成六聚環(huán)狀定子。F0 部分由a、b2、c10～15 等3 種亞基組成。其中F1 部分的α 亞基由ATP5a(55kd)編碼，ATP5a 在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能，例如ATP5a 在結腸癌的細胞增殖中起促進作用，以及其與前列腺癌發(fā)展之間存在相互關聯(lián)。ATP5a 的表達失調在已在幾種惡性腫瘤中報道，但它在不同的癌癥類型中顯示出致癌或腫瘤抑制作用。但與病毒之間的關系尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)編碼的E 蛋白可以通過抑制ATP5a 誘導細胞凋亡，從而促進病毒的復制。另有研究表明，ATP5a 與輪狀病毒（Rotavirus,RV）的3'UTR 具有高親和力。ATP5a 的基因缺失減少了感染性病毒子代的產生，并在RV 基因組組裝和顆粒形成中起一定的作用。

雖然ATP5a 參與了許多癌變與病毒感染過程，但該蛋白的生物學功能尚不清楚。為進一步研究ATP5a 的功能，構建一個穩(wěn)定的、可表達ATP5a 的細胞系，將有助于相關研究領域的發(fā)展。本研究將ATP5a 克隆到修飾過的PLVX-IRES-ZsGreen1 載體上，建立了穩(wěn)定表達ATP5F1A 的細胞系。我們通過Western Blotting 驗證ATP5a 細胞系的穩(wěn)定表達。

1 材料與方法

1.1 細胞與質粒 293T 細胞和IPI-2I 細胞保存于本實驗室，DH5α 感受態(tài)和慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1 及相應的輔助質粒PSPAI2、PMG 2.0 保存于本實驗室。

1.2 試 劑 T4 連接酶、PCR 酶、限制性內切酶購自NEB 公司和Thermos Scientific 公司；KOD NEO高保真DNA 聚合酶購自TOYOBO 公司；PCR 清潔試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購于Axygen 有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購自Gibico 公司；胎牛血清購自內蒙古奧普賽生物科技有限公司；轉染試劑購自Roche 公司；anti-HA tag（1∶10000）以及anti-β-actin（1∶3000）購自Sigma 公司；羊抗鼠IgG（H&L）-Dy680（1∶10000）購自LI-COR 公司。

1.3 ATP5a 引物設計 根據GenBank 網站中的上huATP5aCDS 區(qū)序列（NG_041769.2），使用軟件SnapGene4.1.9 設計一對擴增ATP5a 的特異性引物，引物序列（見表1）。

表1 引物序列

1.4 慢病毒表達質粒的構建 以本實驗室保存的PCAGGS-ATP5a 質粒作為模板，以Ecor1-F 和Xbal-R 為引物。進行人ATP5a 基因的擴增。獲得PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，使用PCR 清潔試劑盒去除雜質，將ATP5a 片段與PLV-IRES-Zs-Green1 載體均使用Ecor1 和Xbal 雙酶切，條件為37 ℃，酶切1 h。酶切完畢后將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳并利用凝膠回收試劑盒回收酶切產物。使用T4 連接酶體系16 ℃過夜連接。次日連接產物用DH5α 感受態(tài)進行轉化，經由菌落PCR 鑒定后測序。將測序正確的質粒命名為PLV-IRES-Zs-Green1-ATP5a 并保存于-20 ℃冰箱中。

1.5 慢病毒的包裝 使用去除內毒素質粒提取試劑盒提取慢病毒表達質粒pLVX-IRES-Zs-Green1-ATP5a,并與輔助質粒PSPAI2 和輔助質粒PMG2.0 組成三質粒慢病毒包被體系pLVX-IRES-Z sGreen1-ATP5a、PSPAI2 和PMG2.0 質量比為3：2：1，用Roche 轉染試劑共轉HEK-293T 細胞中，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光情況，收取上清培養(yǎng)基，過0.45 μm 濾膜。收集病毒，測定重組慢病毒滴度，并分裝于-80 ℃保存。

將IPI-2I 細胞平鋪于100 mm 培養(yǎng)皿中，待細胞密度達至70%～90%時。接種重組慢病毒3 mL，并加入6 μL 的Polybrene，充分混勻后在37 ℃細胞箱敷育1 h。補充培養(yǎng)液至10 mL。36 h 后在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的熒光情況，利用流式細胞術篩選表達綠色熒光的IPI-2I 細胞，經由培養(yǎng)傳代后可得到穩(wěn)定表達ATP5a 的IPI-2I 細胞系。

1.6 Western Blotting 選取培養(yǎng)傳代后得到得IPI-FX/ATP5F1A 細胞，收集細胞沉淀，加入含有PMSF 的RIPA 細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心收集上清加入5×上樣緩沖液，沸水浴10 min，上樣（濃縮膠80 V，分離膠120 V）,將凝膠轉移至NC膜,冰浴恒流200 mA 90 min，提前配制封閉液（一直用的4% TBST 配制的脫脂奶粉），將膜放入含有5%脫脂乳的封閉液中室溫孵育1 h，棄去封閉液，PBST 洗2 次，加入5%BSA 稀釋的一抗4 ℃過夜孵育，次日，PBST 洗膜3 次×5 min，加入稀釋好的二抗，室溫孵育45 min，利用顯色。

2 結果

2.1 ATP5a 擴增產物的鑒定以及雙酶切鑒定 目的基因經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1528bp 的特異性目的條帶，與預期結果一致，見圖1a。重組慢病毒表達質粒經ECORI 和Xbal 雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1528bp 的特異性目的條帶，與預期結果一致，見圖1b，表明ATP5a 基因成功插入慢病毒基因組內。

圖1 PCR 擴增產物及酶切鑒定

2.2 重組慢病毒表達質粒的表達 將感染慢病毒的293T 細胞在顯微鏡下觀察熒光，收集沉淀通過Western blotting 檢測ATP5a 的表達，與對照相比，轉染細胞組在55KD 出現(xiàn)特異性目的條帶，重組質粒成功表達（見圖2）。

圖2 293T 細胞Western Blot 分析

2.3 ATP5a 過表達IPI-2I 細胞中ATP5a 熒光觀察 將感染重組慢病毒的IPI-2I 細胞顯微鏡下觀察熒光，結果顯示，與對照IPI-2I 細胞相比，IPI-2I-ATP5a 細胞中的綠色熒光明顯增多（見圖3），表明IPI-2I-ATP5a 細胞系構建成功。

圖3 IPI-2I 細胞的熒光圖像

2.4 流式細胞術鑒定IPI-2I-ATP5a 細胞系 將感染重組慢病毒的IPI-2I 細胞和對照細胞通過流式分選，結果顯示，與對照IPI-2I 細胞相比，獲得更多的IPI-2I-ATP5a 細胞（見圖4），表明IPI-2I-ATP5a細胞系構建成功。

圖4 IPI-2I 細胞流式細胞術篩選

2.5 IPI-2I-ATP5a 細胞中ATP5a 的檢測結果 收集IPI-2I-ATP5a 和IPI-2I-PLVX 細胞沉淀，通過western blotting 檢測ATP5a 的表達，與對照相比，IPI-2I-ATP5a 細胞組在55KD 出現(xiàn)特異性目的條帶，表明IPI-2I-ATP5a 細胞系構建成功（見圖5）。

圖5 IPI-FX/ATP5F1A western blot 分析

3 討論

慢病毒最早可追溯至1989 年開發(fā)的一種可攜帶外源目的基因的復制型慢病毒，由于初代慢病毒來自于HIV 病毒因而具有高突變率具有安全隱患。因此為了提高慢病毒的安全性開發(fā)了第一代至第四代慢病毒載體系統(tǒng)，第一代系統(tǒng)采取三質粒系統(tǒng)包含包裝質粒、包膜蛋白質粒、穿梭質粒組成。以后的三代都是在一代的載體系統(tǒng)上優(yōu)化而來。其中我們選取的PLVX-IRES-ZsGreen1 也安全的應用在其他的慢病毒包裝體系。

ATP 合酶是幾乎所有真核生物和原核生物中主要的能量生產酶，近年來對ATP 合酶的不斷研究。其中ATP5a 是ATP 合酶重要的組成部分，ATP5a 與PRRSV 病毒的Gp5 蛋白之間存在相互作用，Gp5 可能與PSSRV E 蛋白共同作用ATP5a 來感染宿主。在細胞系研究中，科學家通常會使用基因編輯技術如CRISPR/Cas9 來改變ATP5a 基因的表達水平，以觀察細胞內能量代謝的變化。這樣的研究有助于揭示ATP5a 基因的功能和調控機制，在細胞生物學和醫(yī)學研究領域具有重要意義。此外，ATP5a 細胞系還可以應用于藥物篩選和治療方法的研究。通過研究ATP5a 基因的功能和與之相關的信號通路，科學家可以發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點，為相關疾病的治療提供新途徑。

穩(wěn)定表達ATP5a 細胞系是一種用于研究細胞能量合成和與之相關疾病的重要工具。通過對該細胞系的研究，我們可以更好地理解細胞內能量代謝的機制，并為相關疾病的治療提供科學依據。