王瀚 葉鵬 李婉寧 侯麗華

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.007

引文格式：王瀚，葉鵬，李婉寧，等.高產(chǎn)HEMF酵母對(duì)醬油品質(zhì)的提升[J].中國(guó)調(diào)味品，2024，49（3）：39-45，67.

WANG H， YE P， LI W N， et al. Improvement of soy sauce quality by yeast with high HEMF productivity[J].China Condiment，2024，49（3）：39-45，67.

摘要：醬油風(fēng)味物質(zhì)中的4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）-呋喃酮（HEMF）是醬香風(fēng)味貢獻(xiàn)的主要成分。假絲酵母（Candida versatilis）（以下簡(jiǎn)稱C酵母）是醬油發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)HEMF的重要微生物，文章使用能耐受高濃度HEMF的新菌株C-1、C-2、C-3。經(jīng)過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA實(shí)驗(yàn)（RAPD）驗(yàn)證了3株優(yōu)良菌株與出發(fā)菌株基因有所差異，證明基因重組成功。將其應(yīng)用于發(fā)酵并進(jìn)行對(duì)比分析，研究發(fā)現(xiàn)，C-1與出發(fā)菌株相比，氨氮和全氮含量分別增加3.20%和7.20%，HEMF含量增加29.40%。通過(guò)感官評(píng)價(jià)，醬香味有所提升。生物胺總含量低于1 000 mg/L，氨基甲酸乙酯含量低于20 μg/L，保證了醬油的安全性。綜上，高產(chǎn)HEMF酵母提高了醬油的品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：醬油；酵母菌；基因組重排；4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）呋喃（HEMF）；醬香

中圖分類號(hào)：TS264.21????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A????? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）03-0039-07

Improvement of Soy Sauce Quality by Yeast with High HEMF Productivity

WANG Han， YE Peng， LI Wan-ning， HOU Li-hua*

（School of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science and

Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： 4-Hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H）-furanone （HEMF） in soy sauce flavor substances is the main component contributing to the flavor of soy sauce. Candida versatilis （hereinafter referred to as C yeast） is an important microorganism producing HEMF during soy sauce fermentation. In this paper， the new strains C-1， C-2 and C-3 that can tolerate high concentration of HEMF are used. After random amplified polymorphic DNA （RAPD） experiments， it is confirmed that the genes of the three excellent strains are different from those of the starting strain， which proves that the gene recombination is successful. They are applied to fermentation and comparative analysis， and it is found that compared with the starting strain， the content of ammonia nitrogen and total nitrogen of C-1 increases by 3.20% and 7.20% respectively， and the content of HEMF of C-1 increases by 29.40%. Through sensory evaluation， it is found that the flavor of soy sauce is improved. The total biogenic amine content is less than 1 000 mg/L， and the ethyl carbamate content is less than 20 μg/L， which ensures the safety of soy sauce. In conclusion， the yeast with high HEMF productivity improves the quality of soy sauce.

Key words：soy sauce; yeast; genomic recombination; 4-hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H） furanone （HEMF）; soy sauce aroma

收稿日期：2023-09-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401678）；企業(yè)科技特派員項(xiàng)目（21YDTPJC00650）

作者簡(jiǎn)介：王瀚（1996—），男，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)。

*通信作者：侯麗華（1974—），女，教授，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向：食品科學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

醬油已有2 000多年的歷史[1]?，F(xiàn)今我國(guó)醬油產(chǎn)業(yè)規(guī)模巨大，李松[2]通過(guò)市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2014年我國(guó)醬油產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到938.8萬(wàn)噸，更加證明了醬油在我國(guó)調(diào)味品中的地位之高，但隨著人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的美好生活的需要，人們已經(jīng)不滿足于醬油的生產(chǎn)額達(dá)到日常生活所需要的量，普通醬油不再吸引人，大家逐漸開(kāi)始追求一些高質(zhì)量的醬油，如具有吸引人的香味（果香味、焦糖味等）。市面上一部分醬油無(wú)法滿足這樣的條件，這也間接導(dǎo)致醬油產(chǎn)業(yè)有所停滯。而HEMF是醬香型醬油主要的香味物質(zhì)，構(gòu)建能高產(chǎn)HEMF的菌株是解決該問(wèn)題的關(guān)鍵因素[3]。

微生物育種是一種新的人工選擇技術(shù)，旨在改變微生物的遺傳組成，以造福植物或動(dòng)物宿主[4-7]，基因組重排技術(shù)結(jié)合了傳統(tǒng)誘變技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)，是一項(xiàng)對(duì)整個(gè)微生物基因組重排的新型育種技術(shù)。基因組重排技術(shù)通過(guò)多親本原生質(zhì)體遞歸融合，可以使工程菌快速獲得多樣復(fù)雜的優(yōu)良表型，是一種常用的微生物育種方法[8-11]。

本研究將基因重組后能耐受高濃度HEMF的菌株應(yīng)用于醬油發(fā)酵，提升醬油的品質(zhì)，為工業(yè)微生物的構(gòu)建提供了有效途徑。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

已構(gòu)建的耐受高濃度HEMF的3株優(yōu)良菌株C-1、C-2、C-3。天津市利民公司供應(yīng)的優(yōu)質(zhì)大豆、炒小麥。HEMF、磷酸緩沖液（pH 7.0）、硫代硫酸鈉、山梨醇、甲醛、溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑、磷酸二氫鉀、乙醇、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸（均為分析純）、酵母基因組提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2? 培養(yǎng)基及溶液

YPD培養(yǎng)基[12]：由酵母提取物、無(wú)水葡萄糖、蛋白胨和瓊脂粉組成，其中酵母提取物的比例為1%，蛋白胨的比例為2%，固體另加1.5%瓊脂粉；生理鹽水：將0.90 g氯化鈉溶解于99.1 mL蒸餾水中；EDTA·2Na：將0.05 mol/L EDTA（18.60 g EDTA·2Na）加入到蒸餾水中，使其達(dá)到1 000 mL，然后使用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5；ST溶液：由1 mol/L山梨醇和0.01 mol/L Tris-HCl組成，pH調(diào)至7.4；STC溶液：將0.01 mol/L CaCl2加入到ST溶液中；PTC溶液：35% PEG-6000、0.01 mol/L CaCl2、0.01 mol/L Tris-HCl（pH調(diào)至7.4）；TE溶液（pH 8.0）：200 mL 50 mmol/L Tris·HCl（pH 8.0），2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）。混合后，定容至1 000 mL。

1.3? 儀器與設(shè)備

PB-10型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)? 美國(guó)Sartorius公司；立式壓力蒸汽滅菌器? 日本雅馬拓科技有限公司；SQP型分析天平? 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SH220N型石墨消解儀? 濟(jì)南海能儀器有限公司；ZDDN-11型自動(dòng)凱氏定氮儀? 浙江托普儀器有限公司；超高速冷凍離心機(jī)? 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；T5型自動(dòng)電位滴定儀? 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超凈工作臺(tái)? 蘇凈集團(tuán)安泰公司；PCR儀? 美國(guó)Bio-Rad公司；QP-Ultra 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀? 日本島津公司。

1.4? 方法

1.4.1? 優(yōu)良菌株基本性能的測(cè)定

1.4.1.1? 遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定

在含1.75% HEMF的YPD固體培養(yǎng)基中，對(duì)獲得的優(yōu)良菌株進(jìn)行多次傳代，篩選出能穩(wěn)定遺傳HEMF耐受性的菌株。

1.4.1.2? RAPD驗(yàn)證

使用酵母基因組提取試劑盒提取基因，使用表1中的7個(gè)隨機(jī)引物，在表3的PCR條件下驗(yàn)證篩選菌株和原始菌株之間的DNA差異。發(fā)現(xiàn)只有隨機(jī)引物5可以擴(kuò)增原始菌株和第三輪基因組重排獲得的酵母菌株之間的不同RAPD條帶。因此，選擇使用隨機(jī)引物5進(jìn)行RAPD擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。將原始菌株和新構(gòu)建的菌株的全基因組DNA作為模板，并使用隨機(jī)引物5進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)系統(tǒng)見(jiàn)表2。

1.4.1.3? 優(yōu)良菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

從固體培養(yǎng)基中選擇單個(gè)菌落保存優(yōu)良的酵母菌株，然后接種到20 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min的條件下，搖瓶過(guò)夜。為了比較出發(fā)酵母和優(yōu)良菌株在不同濃度的HEMF液體培養(yǎng)基中的耐受性和生長(zhǎng)差異，將兩種液體培養(yǎng)基分別添加5%的接種物，并在30 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)一夜，每4 h測(cè)量一次OD660 nm。

1.4.2? 新菌株應(yīng)用于醬油發(fā)酵

在進(jìn)行發(fā)酵前1 d用開(kāi)水浸泡大豆，待大豆浸泡吸水后，過(guò)濾掉水分，按照大豆∶炒小麥為6∶4的比例混入炒小麥，再于121 ℃滅菌30 min并蒸熟，于30 ℃恒溫發(fā)酵120 d。

鹽水的配制：配制鹽分濃度為18%的鹽水，鹽水體積為總物料質(zhì)量的2.2倍。將172.8 g食用鹽放入660 g自來(lái)水中，使其混合并完全融合。待溫度達(dá)到室溫后，再將300 g物質(zhì)和鹽水混合，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。

將曲料與鹽水混合均勻后，用搟面杖將其攪拌均勻，然后用保鮮膜、牛皮紙和棉線將發(fā)酵罐密封，定期攪拌，以確保曲料與鹽水完全混合，并添加1.0×106 CFU/g的C酵母和3輪基因重排構(gòu)建的酵母。每隔5 d攪拌醬醪，使微生物和醬醪充分接觸混勻，提高發(fā)酵效果（注：發(fā)酵全程盡可能保證無(wú)菌操作，防止環(huán)境中微生物混入而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]）。

在發(fā)酵完成后，將其置于8 500 r/min的離心機(jī)中，經(jīng)過(guò)20 min的離心處理，再用6層紗布過(guò)濾，即可獲得頭油（即本實(shí)驗(yàn)中的成品醬油）。

共設(shè)置了8個(gè)發(fā)酵組，見(jiàn)表4。

1.4.3? 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮含量根據(jù)GB 5009.235—2016[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4? 全氮含量的測(cè)定

全氮含量根據(jù)GB 5009.235—2016的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5? 還原糖含量的測(cè)定

還原糖含量根據(jù)DNS法測(cè)定。

1.4.6? 風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

使用SPME-GC-MS技術(shù)[15]，采用固相微萃取和氣質(zhì)結(jié)合的方式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)軟件進(jìn)行手動(dòng)積峰并進(jìn)行整合和對(duì)比質(zhì)譜儀記載的質(zhì)譜圖與檢索數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)給出的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，檢測(cè)出相似度超過(guò)80%的化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)定性分析方法，并使用面積歸一化法測(cè)算出其相應(yīng)濃度，以此來(lái)鑒定風(fēng)味化學(xué)物質(zhì)。

1.4.7? 生物胺含量的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.208—2016[16]的規(guī)定，醬油中8種生物胺的數(shù)量可以通過(guò)流動(dòng)相A（乙腈）和流動(dòng)相B（超純水）的比較來(lái)確定。

1.4.8? 氨基甲酸乙酯的測(cè)定

醬油中氨基甲酸乙酯按照GB 5009.223—2014[17]的方法測(cè)定。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 優(yōu)良菌株基本性能的測(cè)定

2.1.1? 優(yōu)良菌株的RAPD驗(yàn)證

對(duì)本研究3輪基因組重排構(gòu)建的3株酵母菌和出發(fā)菌株C酵母進(jìn)行RAPD驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：泳道1代表Marker，泳道2代表出發(fā)菌株，泳道3代表C-1，泳道4代表C-2，泳道5代表C-3。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）可以有效地檢測(cè)微生物中基因突變所導(dǎo)致的DNA多樣性[18]，其原理是通過(guò)將不同長(zhǎng)度的DNA片段隨機(jī)分配到10 bp的靶模板上，然后根據(jù)DNA片段的長(zhǎng)度和數(shù)量來(lái)評(píng)估DNA的多態(tài)性，并且可以檢測(cè)出相似菌株基因組DNA序列之間的微小差異，從而更好地進(jìn)行分析。由圖1可知，所構(gòu)建的菌株與出發(fā)菌株有明顯的差異性擴(kuò)增條帶，可以證明基因組重排的有效性。

2.1.2? 優(yōu)良菌株遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證

使用YPD固體平板和含有1.75% HEMF的YPD固體平板，對(duì)出發(fā)菌株、3輪基因重排構(gòu)建的菌株C-1、C-2、C-3進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，將4種菌株同時(shí)劃線培養(yǎng)在普通YPD培養(yǎng)基和含有1.75% HEMF的YPD培養(yǎng)基中，出發(fā)菌株C酵母只能在YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，不能在含有1.75% HEMF的YPD培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。而進(jìn)行了3輪基因組重排的菌株均能在YPD平板和含有1.75% HEMF的YPD培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，說(shuō)明構(gòu)建的菌株可以比較穩(wěn)定地遺傳對(duì)HEMF耐受的優(yōu)良性狀。

2.1.3? 優(yōu)良菌株的生長(zhǎng)特性分析

取1.0×106 CFU細(xì)胞量接種到含有1.75% HEMF的液體YPD培養(yǎng)基中，放入30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床培育，每隔4 h測(cè)量一次660 nm波長(zhǎng)下各菌液的吸光度值，最終得到的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。

C-2、C-3酵母的生長(zhǎng)曲線

genome recombination

由圖3可知，出發(fā)菌株C酵母在含有1.75% HEMF的YPD液體培養(yǎng)基中始終無(wú)法生長(zhǎng)，而3輪基因組重排獲得的菌株C-1、C-2、C-3均可以經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期，3株酵母在16 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，28 h增加速度變慢進(jìn)入穩(wěn)定期，分析生長(zhǎng)曲線可知，在含有1.75% HEMF的YPD培養(yǎng)基中，3輪基因組重排后的3株酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間雖然晚了近4 h，但是與出發(fā)菌株相比，對(duì)HEMF的耐受性均有所提高，其底物也會(huì)更多地被轉(zhuǎn)化成HEMF。

2.2? 優(yōu)良菌株應(yīng)用于醬油發(fā)酵

2.2.1? 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

酵母發(fā)酵所得醬油中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，氨基酸態(tài)氮含量在前期迅速增長(zhǎng)，而后期整體呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)。這是因?yàn)獒u油醪在發(fā)酵初期，其中的酶系統(tǒng)，特別是蛋白酶肽酶活性極強(qiáng)，大部分蛋白質(zhì)大分子都被有效降解，從而使得氨基酸態(tài)氮含量迅速增長(zhǎng)。在發(fā)酵釀造初期，鹽水濃度高達(dá)18%，這使得可溶性氮在滲透壓的影響下被曲霉溶解，從而導(dǎo)致醬油醪中氨基酸態(tài)氮含量迅速提高。然而，伴隨著發(fā)酵釀造進(jìn)入后期，整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的蛋白酶活性逐漸減弱，氨基酸態(tài)氮含量變化不大。

在120 d的發(fā)酵釀造工藝中，加入優(yōu)良酵母菌C-1的醬油的2-1發(fā)酵組中氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到0.959 6 g/dL，相比出發(fā)菌株提高了3.20%。而且與工藝一相比，工藝二的氨基酸態(tài)氮含量更高，但是兩種發(fā)酵工藝的氨基酸態(tài)氮總體水平相差不大。經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理，各個(gè)發(fā)酵組中氨基酸態(tài)氮含量均超過(guò)0.80 g/dL，滿足國(guó)標(biāo)GB 18186—2000中特級(jí)醬油的質(zhì)量要求。

2.2.2? 全氮含量的測(cè)定

酵母發(fā)酵所得醬油中全氮含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在整個(gè)發(fā)酵釀造過(guò)程中，所有發(fā)酵釀造組的全氮含量變化大致相同：前期穩(wěn)步增加，中期快速增加，后期增長(zhǎng)緩慢甚至停滯。在發(fā)酵初期，蛋白酶活性較強(qiáng)，大豆中的蛋白質(zhì)被溶解，導(dǎo)致全氮含量迅速增加。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，酵母等細(xì)胞的增殖會(huì)消耗大量氮源，而美拉德反應(yīng)則會(huì)使發(fā)酵系統(tǒng)中的一些含氮物質(zhì)被用于反應(yīng)，從而導(dǎo)致后期出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

發(fā)酵所得的醬油中，工藝二的2-1發(fā)酵組中全氮含量最高，為1.695 g/dL，高于添加了出發(fā)菌株C酵母的發(fā)酵組（7.20%），并且工藝二醬油的全氮含量整體高于工藝一醬油。

2.2.3? 還原糖含量的測(cè)定

酵母發(fā)酵所得醬油中還原糖含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，還原糖含量迅速下降。工藝二的情況是由于酵母的加入時(shí)間較晚，導(dǎo)致原料在發(fā)酵初期受到葡萄糖淀粉酶的作用，迅速分解，從而使還原糖含量迅速升高。后期還原糖含量迅速下降是由于在高濃度鹽水的作用下，酶活性逐漸降低，原料分解變慢。當(dāng)酵母菌加入時(shí)，它們可以利用還原糖作為底物，產(chǎn)生一系列獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)，從而迅速降低還原糖含量。而且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，整個(gè)環(huán)境的pH值也有所降低，酵母菌等微生物的活動(dòng)受到抑制，最終還原糖含量降低緩慢。

兩種發(fā)酵工藝的醬油中，添加了優(yōu)良酵母菌株的發(fā)酵組中還原糖含量均低于添加了出發(fā)菌株C酵母的發(fā)酵組。其中工藝二的2-1發(fā)酵組還原糖含量最低，為1.523 5 g/dL，工藝一醬油的還原糖含量整體低于工藝二醬油。

2.2.4? 銨鹽含量的測(cè)定

酵母發(fā)酵所得醬油中銨鹽含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。

蛋白質(zhì)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的異味使得醬油產(chǎn)品中的銨鹽含量容易超出GB 18186—2000《釀造醬油》的要求，并且最高濃度不能達(dá)到氨基酸態(tài)氮的30%。由圖7可知，所有發(fā)酵產(chǎn)品均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求，因此必須嚴(yán)格執(zhí)行這一規(guī)定。

2.2.5? 風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

在醬油發(fā)酵釀造工藝中，最主要的香味成分是醇類物質(zhì)，而α-酮酸則是形成高級(jí)醇的關(guān)鍵中間體，它們可以與異丁醇、異戊醇、甲硫醇和2-苯基乙醇等物質(zhì)相互作用，從而產(chǎn)生獨(dú)特的香味。

邢爽等[19]的研究結(jié)果表明在pH適中的前提下，假絲酵母可以產(chǎn)生更多的酯類物質(zhì)，而這些物質(zhì)不會(huì)進(jìn)一步參加反應(yīng)或者分解，可以使醬油中酯類物質(zhì)穩(wěn)定存在并提高醬香的風(fēng)味[20]。

由表5可知，醇類、酸類、醛類、酯類、酮類含量較多，相對(duì)總含量達(dá)到90%左右。雜環(huán)類、呋喃類、酚類含量較少。在兩組發(fā)酵醬油中，3株優(yōu)良酵母菌株發(fā)酵組的酸類和酯類含量高于出發(fā)菌株C酵母發(fā)酵組。兩種發(fā)酵工藝相比，添加優(yōu)良菌株相比對(duì)照組增加了許多風(fēng)味物質(zhì)，其中發(fā)酵組2-1相比2-4增加了15種不同的風(fēng)味物質(zhì)。2-1發(fā)酵組的酯類含量也顯著增加，達(dá)到26種，這表明45 d的酵母添加對(duì)醬油發(fā)酵中酯類的產(chǎn)生具有重要影響。同時(shí)證明了添加構(gòu)建菌株可以改善醬油的風(fēng)味（工藝二發(fā)酵組中的4組醬油風(fēng)味物質(zhì)種類最多）。

2.2.6? HEMF的測(cè)定

酵母發(fā)酵所得醬油中HEMF含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，添加構(gòu)建酵母的發(fā)酵組在相同原料比例的條件下HEMF含量高于添加出發(fā)菌株C酵母的發(fā)酵組，證明構(gòu)建酵母在相同原料下可以產(chǎn)生更多的HEMF。最高為工藝二添加酵母C-1菌株的2-1發(fā)酵組，HEMF含量從0.17%提高到0.23%，增幅達(dá)到29.40%，表明原料中更多的戊糖與磷酸鹽發(fā)生非酶促反應(yīng)并形成HEMF。

2.2.7? 生物胺含量的測(cè)定

本研究對(duì)醬油中可能存在的有害物質(zhì)生物胺進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)酵組醬油樣品中8種生物胺的含量和總含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9。

by different yeasts

我國(guó)尚未對(duì)醬油中生物胺的含量作出明確規(guī)定，但歐洲食品安全局（EFSA）則嚴(yán)格規(guī)定醬油中生物胺總含量不得高于1 000 mg/L，以確保消費(fèi)者的安全。

在發(fā)酵組中，色胺的含量為4.29～10.66 mg/L，苯乙胺的含量為1.53～10.39 mg/L，腐胺的含量為1.74～28.12 mg/L，尸胺的含量為22.26～42.78 mg/L，酪胺的含量為65.06～188.14 mg/L，亞精胺的含量為7.77～9.54 mg/L，精胺的含量為3.74～13.30 mg/L。

由圖9可知，經(jīng)過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，所有醬油的生物胺總量低于250 mg/L[21-22]，表明構(gòu)建的優(yōu)良酵母菌株不會(huì)對(duì)人體健康造成潛在的危害。

2.2.8? 氨基甲酸乙酯含量的測(cè)定

本研究還對(duì)醬油中可能存在的有害物質(zhì)氨基甲酸乙酯進(jìn)行了測(cè)定，醬油中氨基甲酸乙酯含量見(jiàn)表6。

由表6可知，所有發(fā)酵組均檢測(cè)出了微量的氨基甲酸乙酯，但是它們的含量均小于20 μg/L（由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的最大可檢出量）。但是添加了構(gòu)建優(yōu)良菌株的發(fā)酵組略高于添加了C酵母的發(fā)酵組。原因可能是精氨酸、尿素等作為氨基甲酸乙酯合成的前體物質(zhì)被轉(zhuǎn)化率更高[23-24]。

2.2.9? 感官評(píng)價(jià)

在相同的滅菌條件（121 ℃蒸汽滅菌，時(shí)間10 min）下處理所得的醬油，感官評(píng)價(jià)人員從醬油的焦糖味、果香味、煙熏味、酒香味、碳烤味5個(gè)方面對(duì)這兩種工藝的醬油進(jìn)行風(fēng)味感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖10。

通過(guò)對(duì)添加不同酵母菌發(fā)酵醬油的風(fēng)味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，由圖10可知，添加優(yōu)良酵母菌株C-1、C-2、C-3的發(fā)酵組果香味和焦糖味得分高于對(duì)照組，其中發(fā)酵組2-1的果香味得分最高，證實(shí)了隨著HEMF含量的增加，醬油的風(fēng)味得到了有效的改善。從焦糖味來(lái)看，2-1發(fā)酵組的焦糖味最高，而構(gòu)建菌株發(fā)酵組整體上高于對(duì)照組。從葡萄酒風(fēng)味和煙熏指數(shù)來(lái)看，所有發(fā)酵組的得分普遍不高。

上述研究結(jié)果表明，添加優(yōu)良酵母菌株能夠有效提高醬油的焦糖味與果香味，與HEMF含量呈正相關(guān)，有助于提高醬油的醬香風(fēng)味。其中優(yōu)良菌株C-1在各項(xiàng)指標(biāo)上均優(yōu)于其他菌株，為最優(yōu)菌株。

3? 結(jié)論

將出發(fā)菌株C酵母和優(yōu)良菌株應(yīng)用于醬油發(fā)酵。研究表明，添加構(gòu)建的菌株可使醬油發(fā)酵中酸酯種類豐富度高于C酵母醬油，發(fā)酵組2-1的HEMF含量比對(duì)照組提高29.40%。根據(jù)醬油發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量、全氮含量、感官評(píng)分等指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，所構(gòu)建的優(yōu)良菌株能夠提高醬油的整體品質(zhì)。同時(shí)對(duì)醬油中的有害物質(zhì)生物胺和氨基甲酸乙酯進(jìn)行了測(cè)定，其含量均在允許范圍內(nèi)，表明用優(yōu)良菌株發(fā)酵醬油是安全的。此外，發(fā)現(xiàn)工藝二在第45天添加酵母更有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成，有助于增加具有水果味和焦糖味的HEMF的含量，并能進(jìn)一步增強(qiáng)醬油的整體風(fēng)味。總的來(lái)說(shuō)，C-1為最優(yōu)醬油發(fā)酵菌株。

參考文獻(xiàn)：

[1]ZHU Y， TRAMPER J. Koji—where East meets West in fermentation[J].Biotechnology Advances，2013，31（8）：1448-1457.

[2]李松.市售發(fā)酵醬油品質(zhì)分析及模式識(shí)別研究[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[3]WANG X J， GUO M Y， SONG H L， et al. Characterization of key aroma compounds in traditional Chinese soy sauce through the molecular sensory science technique[J].LWT-Food Science and Technology，2020，128：109413.

[4]FENG J， ZHAN X B， ZHENG Z Y， et al. New model for flavour quality evaluation of soy sauce[J].Czech Journal of Food Sciences，2013，31（3）：292-305.

[5]WAN S P， WANG C L， HOU L H， et al. Effect of adding salt-tolerant microorganisms on the flavor of soy-sauce mash[C]//2011 International Conference on Remote Sensing， Environment and Transportation Engineering，2011：7500-7502.

[6]MACHIDA M， ASAI K， SANO M， et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae[J].Nature，2005，438（7071）：1157-1161.

[7]KAEWKROD A， NIAMSIRI N， LIKITWATTANASADE T， et al. Activities of macerating enzymes are useful for selection of soy sauce koji[J].LWT-Food Science and Technology，2018，89：735-739.

[8]UEHARA K， WATANABE J， MOGI Y， et al. Identification and characterization of an enzyme involved in the biosynthesis of the 4-hydroxy-2（or 5）-ethyl-5（or 2）-methyl-3（2H）-furanone in yeast[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2017，123（3）：333-341.

[9]SUGAWARA E， OHATA M， KANAZAWA T， et al. Effects of the amino-carbonyl reaction of ribose and glycine on the formation of the 2（or 5）-ethyl-5（or 2）-methyl-4-hydroxy-3（2H）-furanone aroma component specific to miso by halo-tolerant yeast[J].Bioscience Biotechnology & Biochemistry，2007，71（7）：1761-1763.

[10]GUO J， LUO W， WU X M， et al. Improving RNA content of salt-tolerant Zygosaccharomyces rouxii by atmospheric and room temperature plasma （ARTP） mutagenesis and its application in soy sauce brewing[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2019，35（12）：180.

[11]QI W， ZHANG W T， LU F P. Carbon metabolism and transcriptional variation in response to salt stress in the genome shuffled Candida versatilis and a wild-type salt tolerant yeast strain[J].RSC Advances，2017，7（3）：1646-1653.

[12]ORDONEZ J L， TRONCOSO A M， GARCIA P， et al. Recent trends in the determination of biogenic amines in fermented beverages－a review[J].Analytica Chimica Acta，2016，939（7）：10-25.

[13]張珊.耐鹽酵母的添加對(duì)高鹽稀態(tài)醬油的影響[D].天津：天津科技大學(xué)，2018.

[14]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：GB 5009.235—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[15]鄭海燕.醬油中紅色指數(shù)的測(cè)定方法[J].中國(guó)調(diào)味品，1999（1）：27-30.

[16]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺含量的測(cè)定：GB 5009.208—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[17]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定：GB 5009.223—2014[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[18]ATIENZAR F A， JHA A N. The random amplified polymorphic DNA （RAPD） assay and related techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies： a critical review[J].Mutation Research，2006，613（23）：76-102.

[19]邢爽，王亞平，郭學(xué)武，等.發(fā)酵條件對(duì)5種產(chǎn)酯酵母酒精發(fā)酵和產(chǎn)酯的影響[J].中國(guó)釀造，2018，37（2）：24-28.

[20]周鈺涵，崔丹瑤，閆昕，等.釀酒酵母與球擬酵母混合發(fā)酵對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2021，42（17）：169-175.

[21]LU Y M， CHEN X H， JIANG M， et al. Biogenic amines in Chinese soy sauce[J].Food Control，2009，20（6）：593-597.

[22]LI J， ZHOU L N， FENG W， et al. Comparison of biogenic amines in Chinese commercial soy sauces[J].Molecules，2019，24（8）：1522.

[23]SHEN M Y， ZHANG F， HONG T， et al. Comparative study of the effects of antioxidants on furan formation during thermal processing in model systems[J].LWT-Food Science and Technology，2017，75：286-292.

[24]WUNDERLICHOVA L， BUNKOVA L， KOUTNY M， et al. Formation， degradation， and detoxification of putrescine by foodborne bacteria： a review[J].Comprehensive Review in Food Science and Food Safety，2014，13：1012-1030.