穆勝凱 崔晏君 郝連升 王騰騰 劉 君

1.山東省聊城市中醫(yī)醫(yī)院骨科，山東聊城 252000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院針灸科，上海 200030；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心，山東濟(jì)南 250000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種以絕經(jīng)后女性雌激素迅速降低引起的骨量和骨強(qiáng)度降低為主要特征的慢性病[1]。我國(guó)＞50 歲人群中骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）患病率為19.2%，其中女性為32.1%，明顯高于歐美國(guó)家[2]。40%～50%的OP 患者會(huì)并發(fā)病理性骨折，既影響其健康和生活質(zhì)量，又造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，故探明其發(fā)病機(jī)制并進(jìn)行有效干預(yù)非常重要[3-4]。

骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡由成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的骨形成、骨吸收作用共同維持，影響兩者分化、功能的因素都可破壞骨骼微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[5]。女性絕經(jīng)后雌激素水平下降會(huì)通過(guò)各種信號(hào)通路引起骨代謝失衡及骨量減少，導(dǎo)致PMOP，相關(guān)通路涉及核因子κB 受體活化因子配體通路、絲裂原活化蛋白激酶通路、Notch 信號(hào)通路等[6-10]。目前抗OP 藥物如雙膦酸鹽類等雖可有效抑制骨吸收，但長(zhǎng)期應(yīng)用可致骨小梁重塑不良、骨形成抑制，且費(fèi)用高昂[11]。因此，探索PMOP 新的發(fā)病機(jī)制非常必要，可為靶向新藥研發(fā)提供更精準(zhǔn)的靶點(diǎn)，以提高臨床療效。本研究擬通過(guò)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PMOP 的相關(guān)芯片數(shù)據(jù)，從中篩選出差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）后進(jìn)行富集分析，為進(jìn)一步研究PMOP 發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE56116[12]。該數(shù)據(jù)集截至2018 年2 月22 日包含13 例來(lái)自兩組不同人群（3 例來(lái)自絕經(jīng)后骨質(zhì)健康的女性，10 例來(lái)自PMOP 的女性）的樣本。

1.2 獲取DEGs

使用在線分析軟件GEO2R 對(duì)芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，并用微生信平臺(tái)繪制DEGs 火山圖；設(shè)P＜0.05、|logFC|≥1，獲得GSE56116 的DEGs，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行規(guī)范、驗(yàn)證后用微生信平臺(tái)繪制PMOP 的DEGs 熱圖[13]。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)與網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

把“1.2”所得DEGs 導(dǎo)入STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），借助Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建DEGs的PPI 網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jù)degree 值篩選出相互作用密切的核心基因，核心模塊通過(guò)MCODE 插件分析[14-15]。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析

將篩選后的DEGs 導(dǎo)入clusterProfiler，pathview等R 包，分別對(duì)GO 功能的“分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cell component，CC）”及KEGG 通路進(jìn)行富集分析[16-17]。使用微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 DEGs

GSE56116 基因表達(dá)譜芯片的DEGs 火山圖見(jiàn)圖1。共得到656 個(gè)差異基因，其中下調(diào)基因421 個(gè)，上調(diào)基因235 個(gè)。DEGs 的聚類熱圖見(jiàn)圖2，紅色、藍(lán)色分別表示基因表達(dá)量的增加、減少，其深淺代表增減的程度。

圖1 GSE56116 的差異表達(dá)基因火山圖

圖2 GSE56116 的差異表達(dá)基因聚類熱圖

2.2 PPI 構(gòu)建及分析

656 個(gè)DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3，包含了614 個(gè)節(jié)點(diǎn)及1 368 條邊，對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫?0 個(gè)核心基因，即VEGFA、KRAS、EP300、IL-2、IL-4、KIT、FOS、CCND1、HGF、CYCS，使用MCODE 插件分析PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心模塊，Score 值最大的核心模塊見(jiàn)圖4。

圖3 差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 MCODE 插件分析確認(rèn)的網(wǎng)絡(luò)核心模塊

2.3 DEGs 富集分析

GO 中MF、BP、CC 富集結(jié)果分別為771、4 648、499 個(gè)；KEGG 通路富集結(jié)果299 條。MF 主要富集在脂肽結(jié)合、磷脂結(jié)合、蛋白激酶B 結(jié)合等，BP 主要富集在肽酶活性調(diào)節(jié)、蛋白水解作用負(fù)性調(diào)節(jié)、內(nèi)肽酶活性調(diào)節(jié)等，CC 主要富集在內(nèi)質(zhì)囊泡，等離子膜外側(cè)等（圖5）。KEGG 通路分析主要涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路等（圖6）。其中PI3K-Akt 信號(hào)通路（圖7）為核心基因顯著富集的信號(hào)通路。

圖5 基因本體功能富集分析

圖6 京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)通路富集分析

圖7 PI3K-Akt 信號(hào)通路

3 討論

目前，PMOP 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究表明其發(fā)病與特定基因的表達(dá)有關(guān)[18]。本研究篩選出的核心基因有VEGFA、KRAS、EP300、IL-2、IL-4 等。VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）與OP 發(fā)病關(guān)系密切[19]。VEGF 既可增加成骨細(xì)胞的成骨作用又能降低破骨細(xì)胞的骨吸收作用，加速骨的形成與重建，在OP 的病理生理過(guò)程中起著非常重要的作用[20]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨與成脂穩(wěn)態(tài)失衡在OP 的發(fā)病中起關(guān)鍵作用[21]；KRAS 的表達(dá)有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化[22]。TGF-β1/Smad4 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境平衡中起著非常重要的作用，是PMOP 發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一[23]。EP300 是Smad4 的轉(zhuǎn)錄共激活因子，在該信號(hào)通路的正常傳導(dǎo)與功能發(fā)揮中起到重要作用[24]。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2 是與骨代謝密切相關(guān)的細(xì)胞因子，其水平與成骨細(xì)胞的活性呈正相關(guān)[25-28]。IL-4 能抑制破骨細(xì)胞形成并減弱其骨吸收作用[29-30]。

在本研究中，KEGG 富集通路中含核心基因最多的通路是PI3K-Akt 信號(hào)通路，包含了23 個(gè)DEGs，其中VEGFA、KRAS、IL-2、IL-4、KIT、CCND1、HGF 為核心基因，說(shuō)明PI3K-Akt 通路可能與PMOP 關(guān)系密切。PI3K-Akt 通路被激活可引起成骨分化標(biāo)志物——促堿性磷酸酶、BMP-2 等很多與骨組織有關(guān)的分子表達(dá)發(fā)生變化，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與增殖[31]。PI3K-Akt通路被抑制可減弱破骨細(xì)胞骨吸收能力，因此，PI3KAkt 通路對(duì)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能具有雙重作用[32]。有研究證實(shí)，PI3K-Akt 通路在調(diào)控成骨與破骨細(xì)胞增殖與功能中極為重要，對(duì)骨代謝及其平衡的維持作用巨大[33]。雌激素在PI3K-Akt 通路信號(hào)傳導(dǎo)中起積極作用，絕經(jīng)后女性雌激素水平急劇降低，PI3K-Akt 通路激活受限，可能是PMOP 的發(fā)病機(jī)制之一[34]。此外，KEGG 富集通路多與免疫有關(guān)，如B 細(xì)胞受體信號(hào)通路等，B 淋巴細(xì)胞是在雌激素缺乏條件下形成破骨細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子，且成骨和破骨細(xì)胞可與各種免疫細(xì)胞通過(guò)旁分泌機(jī)制或直接接觸產(chǎn)生相互作用，說(shuō)明絕經(jīng)后女性免疫狀態(tài)的變化與PMOP 的發(fā)生息息相關(guān)[35]。

綜上所述，本研究分析所得到的核心基因和信號(hào)通路可為PMOP 的靶點(diǎn)與機(jī)制研究、新藥研發(fā)提供新的思路與方法。但是，本研究所得到的結(jié)論尚處于理論階段且樣本量偏小，尚需基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其科學(xué)性。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。