魯永織 萬詩揚 韓真真 張 亮 孫 煒

1.青島市市立醫(yī)院腫瘤科，山東青島 266000；2.青島市膠州中心醫(yī)院放療科，山東青島 266000；3.青島市第八人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東青島 266000；4.青島市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東青島 266000

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，我國發(fā)生病例和死亡病例均居全球第三位[1]。膠質(zhì)瘤惡性程度高、侵襲能力強，長期預(yù)后較差，尋找膠質(zhì)瘤預(yù)后影響因素對改善患者預(yù)后非常重要[2]。研究表明，微核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）和脂質(zhì)代謝異常參與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展[3-4]。有研究報道，miR-525-5p 在乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，并與患者預(yù)后有關(guān)[5-6]。圍脂滴蛋白（perilipin，PLIN）3 是一種脂滴相關(guān)蛋白，能通過結(jié)合脂滴表面特異性位點參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)[7]。有研究報道，PLIN3 在肺腺癌、腎透明細(xì)胞癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，并與患者預(yù)后有關(guān)[8-9]。但目前關(guān)于膠質(zhì)瘤組織中miR-525-5p、PLIN3表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系尚未可知?；诖?，本研究報道如下，以期為改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年2 月至2020 年7 月青島市市立醫(yī)院收治的102 例膠質(zhì)瘤患者，收集術(shù)中部分瘤組織和瘤旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者或家屬提供書面知情同意；②年齡≥18 歲；③通過病理檢查確診；④研究資料完整；⑤患者為初次診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①沒有手術(shù)指征；②合并其他惡性腫瘤；③合并其他顱內(nèi)疾??；④合并急慢性感染；⑤入院前已接受過抗腫瘤治療。本研究經(jīng)青島市市立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2023 臨審字第169 號）。

1.2 試驗方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 部分組織于液氮下碾磨成末，Trizol 法提取組織總RNA，分光光度儀鑒定其合格（吸光度260/280 比值為1.8～2.0）后，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供的SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒說明書進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)體積：cDNA 5 μl、2×SYBR Green PCR Mix 12.5 μl、正反向引物各1.5 μl、ddH2O 加至總體積25 μl；反應(yīng)條件：95℃10 min 1 次，95℃10 s、64℃10 s、72℃30 s，40次。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計合成，miR-525-5p 正向引物5’-TCGGCAGGCTCCAGAGGGATGCA-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-525-5p 內(nèi)參U6 正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。PLIN3 正向引物5’-GCAACTGGCCGCTCTACTG-3’，反向引物5’-AGAAGACCTCCAACTTGACCA-3’；內(nèi)參GAPDH 正向引物5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，反向引物5’-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3’。反應(yīng)完成后通過2-ΔΔct法計算組織中miR-525-5p、PLIN3 mRNA 相對表達(dá)量。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法 部分組織收集后立即用超純水沖洗，然后福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、脫蠟后，磷酸鹽緩沖液洗滌切片以修復(fù)抗原，將內(nèi)源性過氧化物酶滴于載玻片，室溫避光孵育15 min。加入一抗PLIN3（1∶100）[三岸生物科技（上海）有限公司，編號：D194875]和磷酸鹽緩沖液（對照），次日加入二抗，37 ℃孵育1 h。DAB 染色劑顯色，蒸餾水沖洗停止顯色，再滴加蘇木精-伊紅染色劑染色組織細(xì)胞核，蒸餾水沖洗停止染色。最后梯度酒精脫水后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察染色。無陽性細(xì)胞、陽性細(xì)胞占比＜25%、25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別為0、1、2、3、4 分；染色強度：無著色、弱陽性、中等陽性、最強陽性分別為0、1、2、3 分；二者乘積≥2 分表示陽性[10]。

1.3 隨訪與分組

膠質(zhì)瘤患者出院后進行為期3 年的隨訪，包括電話或門診隨訪。在第1 年，隨訪頻率為每3 個月1 次，之后從第2 年開始，改為每6 個月1 次，一直進行到2023 年3 月或患者發(fā)生終點事件（如死亡）。統(tǒng)計3年總生存率，根據(jù)生存情況分為存活組和死亡組。根據(jù)膠質(zhì)瘤組織中PLIN3 mRNA 的表達(dá)均值，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t 檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，比較采用χ2檢驗；采用Pearson 進行相關(guān)性分析。生存曲線將通過Kaplan-Meier 法繪制，生存率差異通過log-rank χ2檢驗評估。影響因素通過多因素Cox 回歸模型進行分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織與瘤旁組織中miR-525-5p、PLIN3 mRNA 表達(dá)比較

膠質(zhì)瘤組織中miR-525-5p 表達(dá)（0.66±0.14）低于瘤旁組織（1.11±0.18），PLIN3 mRNA 表達(dá)（1.86±0.29）高于瘤旁組織（1.24±0.16）（t=21.785、17.947，均P＜0.001）。

2.2 膠質(zhì)瘤組織與瘤旁組織中PLIN3 蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，PLIN3 蛋白陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，膠質(zhì)瘤組織PLIN3 蛋白陽性表達(dá)率為61.76%（63/102），高于瘤旁組織的10.78%（11/102）（χ2=57.341，P＜0.001）。見圖1。

圖1 膠質(zhì)瘤組織與瘤旁組織PLIN3 免疫組織化學(xué)染色（100×）

圖2 miR-525-5p 與PLIN3 的結(jié)合位點圖

圖3 膠質(zhì)瘤組織中miR-525-5p 與PLIN3mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

圖4 不同PLIN3 mRNA 表達(dá)膠質(zhì)瘤患者Kaplan-Meier 生存曲線

2.3 膠質(zhì)瘤組織中miR-525-5p 與PLIN3 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-525-5p 與PLIN3的3’非翻譯端49～55 處存在結(jié)合位點，見圖2；Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果見圖3，miR-525-5p 與PLIN3 mRNA 在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.664，P＜0.001）。

2.4 膠質(zhì)瘤組織中PLIN3 mRNA 表達(dá)與總生存率的關(guān)系

隨訪3 年，中位隨訪時間22 個月，102 例膠質(zhì)瘤患者失訪4 例，死亡50 例，3 年總生存率為50.98%（52/102）。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，PLIN3 mRNA 高表達(dá)組（53 例，≥1.86）3 年總生存率為41.51%（22/53），低于低表達(dá)組（49 例，＜1.86）的61.22%（30/49）（log-rank χ2=7.247，P=0.007）。見圖4。

2.5 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素和多因素Cox 回歸分析

以膠質(zhì)瘤患者預(yù)后為因變量（賦值：死亡/ 存活=1/0，剔除失訪4 例），隨訪時間為時間變量，性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、分化程度、WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級、PLIN3 mRNA 為自變量，將單因素Cox 回歸分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入多因素Cox 回歸模型。結(jié)果顯示：低分化、WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級Ⅲ～Ⅳ級、PLIN3 mRNA≥1.86 為膠質(zhì)瘤患者死亡的獨立危險因素（HR＞1，P＜0.05）。見表1～2。

表1 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的結(jié)果的一般情況比較[例（%）]

表2 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素和多因素Cox 回歸分析

3 討論

膠質(zhì)瘤是起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤，具有高致殘率和高復(fù)發(fā)率特點[11]。研究膠質(zhì)瘤相關(guān)病理分子機制和評估患者預(yù)后，對指導(dǎo)治療措施制訂和促進患者預(yù)后改善意義重大。

miRNA 是來源于獨特發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一類單鏈RNA，能通過與靶基因互補配對降解或抑制mRNA翻譯，進而參與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展[12]。miR-525-5p 定位于人染色體19q13.42，多項研究報道了其在不同惡性腫瘤中的作用，如上調(diào)miR-525-5p 能靶向Rho GTP 酶活化蛋白11A 抑制非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]；上調(diào)miR-525-5p 能靶向含E1 冷休克結(jié)構(gòu)域抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。同時有學(xué)者指出，miR-525-5p 低表達(dá)與肺腺癌、胸腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)[15]。Xie 等[16]研究報道，miR-525-5p 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。代謝重編程是包括膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的突出特征之一，可通過改變脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、乳酸代謝等代謝過程為腫瘤細(xì)胞提供其生長和生存所需的能量，進而促進腫瘤細(xì)胞惡性進展[17]。PLIN3 是特異性表達(dá)于脂滴表面的一種高磷酸化蛋白，能通過與其他分子相互作用介導(dǎo)脂質(zhì)合成和分解，在脂質(zhì)代謝調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18]。既往研究多報道PLIN3 與脂類疾病的關(guān)系，近年研究發(fā)現(xiàn)PLIN3 也參與惡性腫瘤過程，如抑制PLIN3 表達(dá)能抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[19]；抑制PLIN3 表達(dá)能控制肺癌細(xì)胞中的脂滴形成和甘油三酯儲存，進而抑制肺癌惡性進展[20]。有研究指出，人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中可檢測到PLIN3 高表達(dá)[21]。因此推測miR-525-5p、PLIN3 可能影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后，故本研究進一步探討了miR-525-5p、PLIN3 表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中miR-525-5p 低表達(dá)，PLIN3mRNA 和PLIN3 高表達(dá)，提示miR-525-5p、PLIN3 可能參與膠質(zhì)瘤發(fā)生過程。其機制可能是miR-525-5p 低表達(dá)可上調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1，激活叉頭盒蛋白M1、核因子κB 信號通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進膠質(zhì)瘤惡性進展[16]。而PLIN3 高表達(dá)能改變脂質(zhì)代謝，促進腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)儲存和利用，為膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、浸潤提供更有利的條件，進而促進膠質(zhì)瘤惡性進展[18]。本研究通過在線數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-525-5p 與PLIN3 存在結(jié)合位點，隨后的相關(guān)性分析顯示在膠質(zhì)瘤組織中，miR-525-5p 與PLIN3 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示它們可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中共同參與。最近的研究也支持這一發(fā)現(xiàn)，升高miR-525-5p 水平可以通過靶向下調(diào)PLIN3 的表達(dá)來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖[22]。這加強了本研究結(jié)果的可靠性。通過隨訪分析，本研究發(fā)現(xiàn)PLIN3 mRNA 高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者3 年總生存率下降相關(guān)，是患者死亡的獨立危險因素。這顯示在膠質(zhì)瘤組織中，PLIN3 mRNA 的表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān)，可能成為新的生物標(biāo)志物用于評估膠質(zhì)瘤的預(yù)后。

綜上所述，膠質(zhì)瘤組織中miR-525-5p 低表達(dá)和PLIN3 mRNA 高表達(dá)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，PLIN3 mRNA 高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良有關(guān)，可能成為膠質(zhì)瘤預(yù)后評估新的生物標(biāo)志物。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。