謝海宇 秦靜 張艷妮 劉俊杰 何小維 王羽

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510641；2.廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510670；3.生物島實(shí)驗(yàn)室（廣州再生醫(yī)學(xué)與健康廣東省實(shí)驗(yàn)室），廣州 510005）

人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）由胎盤絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌，是一種由α和β兩個不同亞基通過非共價鍵結(jié)合而成的高度糖基化異二聚體糖蛋白。胎盤絨毛滋養(yǎng)層包括單個核細(xì)胞絨毛滋養(yǎng)層內(nèi)層和多核合體細(xì)胞滋養(yǎng)層外層。妊娠早期（4～5周）主要由內(nèi)層細(xì)胞滋養(yǎng)層分泌產(chǎn)生HCG，妊娠6周后主要由外層合體細(xì)胞滋養(yǎng)層分泌產(chǎn)生［1-3］。幾乎所有滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和多數(shù)生殖細(xì)胞腫瘤均會分泌HCG及其亞基，因此HCG及其亞基可作為診斷早孕和監(jiān)測妊娠及相關(guān)疾病的可靠標(biāo)志物［4-7］。臨床檢測通常將HCG的β亞基（β-HCG）作為檢測靶標(biāo)，對β-HCG檢測方法的性能要求主要體現(xiàn)在兩方面：①靈敏度：妊娠早期血清β-HCG含量很低，一般僅有5～25 mU/ml，需高靈敏度的檢測方法［8-9］；②線性范圍：β-HCG水平在妊娠期間呈指數(shù)級增長，約每2～3 d增加1倍，第8～10周可達(dá)到3×104～2×105mU/ml，濃度超出檢測方法線性范圍可能由于鉤狀效應(yīng)出現(xiàn)假低濃度，嚴(yán)重影響臨床醫(yī)生對病情的預(yù)判［10-12］。因此，發(fā)展一種靈敏度高、檢測范圍寬的β-HCG即時檢測（POCT）法對基層社區(qū)診斷早孕、監(jiān)測妊娠及相關(guān)疾病等具有重要意義。

目前已發(fā)展了多種β-HCG檢測法，其中化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是一種將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫化學(xué)反應(yīng)相結(jié)合的分析方法，因其靈敏度高、動態(tài)范圍寬、反應(yīng)快速，且易于自動化廣泛用于臨床診斷［13-18］。傳統(tǒng)的全自動CLIA通常配備大型儀器且需要專業(yè)技術(shù)人員操作，限制了CLIA在基層社區(qū)醫(yī)療單位的推廣使用［19］?；鶎由鐓^(qū)的大規(guī)模篩查不僅需要微型、自動化的分析儀，還需要智能、簡單的操作系統(tǒng)。因此，妊娠及相關(guān)疾病的快速篩查迫切需要快速、簡便的全自動化學(xué)發(fā)光POC分析儀配套的檢測試劑［20-21］。本研究基于小型化學(xué)發(fā)光儀建立β-HCG快速高靈敏化學(xué)發(fā)光即時檢測方法（POC-CLIA），并對其檢測性能及臨床應(yīng)用進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 材料 β-HCG單克隆抗體購自中國南京金斯瑞生物科技有限公司；β-HCG抗原購自中國南京艾得普生物科技有限公司；堿性磷酸酶（Alp）和牛血清白蛋白購自美國Roche公司；磁顆粒（Mps）購自日本JSR公司；化學(xué)發(fā)光底物（AMPPD）和其他化學(xué)發(fā)光試劑均由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司提供；脫鹽柱購自上海Thermo Fisher Science；所有緩沖試劑和其他無機(jī)化學(xué)品均購自Sigma-Aldrich；商業(yè)試劑盒購自美國Abbott公司；臨床血清和血漿標(biāo)本由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司臨床實(shí)驗(yàn)室提供；化學(xué)發(fā)光全自動小型化系統(tǒng)（Shine i2900）由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司提供；對照試劑及儀器由美國Abbott公司提供（ARCHITECT i2000 SR化學(xué)發(fā)光檢測儀及配套β-HCG化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒）。

1.2 方法

1.2.1 β-HCG抗體包被Mps 10 mg Tosyl Mps用0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH=9.5）洗滌3次進(jìn)行活化，活化后將50 μl β-HCG抗體（4.4 mg/ml）加入333 μl硫酸銨緩沖液（3 mol/L，pH=9.5）和617 μl硼酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=9.5）進(jìn)行偶聯(lián)。37 ℃振蕩孵育16 h后分離上清，加入1 ml 0.5%BSA溶液（0.02 mol/L，pH=7.2）封閉Mps，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后去上清，洗滌3次，獲得免疫磁珠（Mps-Ab）。將Mps-Ab重懸于含0.1%BSA的磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH=7.2），4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 β-HCG抗體標(biāo)記堿性磷酸酶（Alp） 將Alp和β-HCG抗體用超純水分別稀釋至2 mg/ml和4 mg/ml。600 μl Alp溶液與200 μl β-HCG抗體溶液輕輕混合，加入含1%戊二醛的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4） 37 ℃避光孵育4 h，加入100 μl單乙醇胺溶液（1 mol/L） 37 ℃孵育2 h，用脫鹽柱除去混合物中多余的顆粒。將得到的Alp標(biāo)記的β-HCG抗體（Alp-Ab）轉(zhuǎn)移至試管，與等量甘油混合，-20 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫檢測程序 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀使用過程：①樣品裝載：將血清或血漿樣品放入樣本位置；②試劑裝載：將裝有Alp-Ab、Mps-Ab、樣本處理液的試劑船放置到相應(yīng)位置；③打開儀器并運(yùn)行，啟動自動檢測程序。POCT-CLIA免疫反應(yīng)采用一步夾心法：5 μl臨床樣品或校準(zhǔn)品、50 μl Alp-Ab和50 μl Mps-Ab混合，37 ℃振蕩孵育5 min，形成夾心Mps-Ab-β-HCG-Alp-Ab免疫復(fù)合物，磁分離系統(tǒng)洗滌4 min去除游離組分，加入200 μl發(fā)光底物（AMPPD）反應(yīng)4 min后檢測發(fā)光值。

1.2.4 β-HCG標(biāo)準(zhǔn)品配制及孵育時間和上樣體積確定 量取不同量β-HCG抗原溶于含0.5%BSA的Tris-HCl溶液，制成標(biāo)準(zhǔn)品S0～S9（0、8、28、80、224、379、650、1 950、5 500、10 924 mU/ml）。測試S1～S9標(biāo)準(zhǔn)品信噪比以及62例臨床血清樣本信號與濃度的相關(guān)性，確定孵育時間及上樣體積。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 對標(biāo)美國Abbott公司化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，按照溯源程序，由美國Abbott公司的ARCHITECT i2000 SR化學(xué)發(fā)光檢測儀標(biāo)定出100例血清樣本濃度，血清樣本繼續(xù)校準(zhǔn)廣州萬孚Shine i2900后即可標(biāo)定出10個標(biāo)準(zhǔn)樣本濃度。檢測后將濃度與發(fā)光值進(jìn)行四參數(shù)擬合獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 最低檢測限 采用空白樣本S0重復(fù)測定20次，計(jì)算其發(fā)光值平均值CM1和標(biāo)準(zhǔn)差SD；測定S1樣本3次，計(jì)算發(fā)光值平均值CM2，對S0與S1的濃度-發(fā)光值結(jié)果進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合，得出擬合方程，將CM1+2SD結(jié)果代入擬合方程得出最低檢測限［22］。

1.2.7 精密度試驗(yàn) 使用兩種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（25.3 mU/ml和920.6 mU/ml）進(jìn)行批內(nèi)和批間分析。1 d內(nèi)測試各濃度樣本6次計(jì)算批內(nèi)精密度，連續(xù)6 d對各樣品進(jìn)行2次測試獲得批間精密度。

1.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別測試低濃度質(zhì)控品（AL：25.3 mU/ml）和高濃度質(zhì)控品（AH：463.6 mU/ml），各樣本測試3次，利用相對偏差評價POC-CLIA體系測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.9 線性稀釋試驗(yàn) 高濃度β-HCG血清樣本（1.092×104mU/ml）采用牛血清稀釋，按高濃度樣本∶血清=0∶1、1∶99、1∶9、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、1∶0稀釋，稀釋后濃度分別為0、109、1 092、2 184、4 368、6 551、8 736、10 920 mU/ml。將混合稀釋樣本實(shí)際測定的平均值與理論值進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.10 抗干擾試驗(yàn) 血清樣本中添加一定量可在免疫檢測中引起干擾的常見組分（如膽紅素、三酰甘油、血紅蛋白），與未添加干擾物質(zhì)的血清樣本進(jìn)行對照測試。干擾表現(xiàn)為偏差值，偏差（%）=（實(shí)驗(yàn)組濃度-對照組濃度）/對照組濃度×100%。

1.2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［23-25］，將Alp-Ab、Mps-Ab和樣本處理液各分為3份，37 ℃保存0 d、7 d和10 d，保存前后均測試血清樣本3次，計(jì)算測試結(jié)果與原始值偏差，偏差（%）=（熱加速后濃度-原始濃度）/原始濃度×100%。

1.2.12 鉤狀效應(yīng)試驗(yàn) 用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將已知高濃度β-HCG陽性臨床樣本（2.6×105mU/ml）按臨床樣本∶稀釋液=11∶9、11∶5、12∶5、13∶5、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256進(jìn)行系列稀釋。每個樣本分別測定3次，擬合其濃度和發(fā)光值曲線。

1.2.13 臨床應(yīng)用評估 采用建立的POC-CLIA方法與商業(yè)試劑盒對照檢測100例臨床血清樣本，對兩種方法的結(jié)果進(jìn)行Passings-Bablok相關(guān)性分析、Bland-Altman一致性分析以及配對t檢驗(yàn)。采用EDTA-K2、肝素鋰和常規(guī)采血管收集20例不同人血液樣本，POC-CLIA進(jìn)行β-HCG檢測，比較EDTA-K2血漿樣本、肝素鋰血漿樣本與血清樣本β-HCG檢測結(jié)果差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 四參數(shù)和線性擬合采用Origin Pro 2021軟件進(jìn)行；性能評價按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)EP文件進(jìn)行，數(shù)據(jù)采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；Bland-Altman一致性分析和Passing-Bablok相關(guān)性分析采用Med Calc軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 孵育時間與上樣體積確定 選擇抗原抗體反應(yīng)時間為5 min、上樣量為5 μl。低段信噪比（S1/S0）為3.45，隨著濃度升高，信噪比逐步增大，中段信噪比（S5/S0）達(dá)到182.43，高段信噪比（S9/S0）高達(dá)7 086（圖1A）。不同β-HCG濃度臨床血清樣本與其對應(yīng)信號值具有高度相關(guān)性（R2=0.989 8，圖1B）。因此，抗原抗體反應(yīng)時間為5 min和樣本量5 μl滿足方法學(xué)要求。

圖1 孵育時間與上樣體積確定Fig.1 Incubation time and sample volume determination

2.2 β-HCG標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 檢測β-HCG系列標(biāo)準(zhǔn)品，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=30 431 860+（4 743-30 431 860）/［1+（x/11 789）1.179］，R2=0.999 9。

圖2 POC-CLIA檢測β-HCG的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of POC-CLIA for β-HCG detection

2.3 最低檢測限 建立的POC-CLIA最低β-HCG檢測限為0.71 mU/ml，滿足妊娠早期血清β-HCG檢測（5～25 mU/ml）要求。

2.4 精密度 批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）分別≤3.11%和≤5.58%（表2），優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求（≤8%和≤15%），表明該方法的重現(xiàn)性和精密度良好。

表2 批內(nèi)和批間變異系數(shù)Tab.2 Intra and inter CV

2.5 準(zhǔn)確度 實(shí)際結(jié)果與標(biāo)示值相對偏差均在±10%之內(nèi)，表明所開發(fā)的POC-CLIA方法具有較高的準(zhǔn)確性，具有臨床應(yīng)用價值（表3）。

表3 準(zhǔn)確度測試結(jié)果Tab.3 Results of accuracy tests

2.6 線性稀釋 稀釋后的β-HCG測定濃度與其理論濃度呈高度線性關(guān)系（r=0.999 0，k=0.974 5，圖3），證明該方法在0.710～1.092×104mU/ml工作范圍內(nèi)具有較好的檢測準(zhǔn)確性。

圖3 β-HCG線性范圍Fig.3 Linear range of β-HCG detection

2.7 抗干擾性 添加膽紅素（0.02 g/dl）、三酰甘油（4 g/dl）、血紅蛋白（0.8 g/dl）的臨床血清標(biāo)本與未添加干擾物質(zhì)的樣本檢測結(jié)果偏差在±10%之內(nèi)，具有較好的抗干擾能力，特異性較好（表4）。

表4 β-HCG抗干擾能力評價Tab.4 Evaluation of resistant interference capability of β-HCG detection

2.8 穩(wěn)定性 將Alp-Ab、Mps-Ab和樣本處理液熱加速處理7 d和10 d后檢測高、中、低3個樣本（表5），測試結(jié)果與原始值偏差在±10%之內(nèi)，說明試劑具有良好的穩(wěn)定性。

表5 試劑熱加速穩(wěn)定性Tab.5 Reagents stability by accelerated testing

2.9 鉤狀效應(yīng) 對鉤狀效應(yīng)進(jìn)行評價（圖4），信號在1.7×105mU/ml進(jìn)入平臺期，而2.6×105mU/ml時仍未出現(xiàn)明顯下降，表明本試劑盒檢測高濃度樣本時具有很好的抗鉤狀效應(yīng)能力。

圖4 鉤狀效應(yīng)評估Fig.4 Evaluation of hook effect

2.10 臨床應(yīng)用評估 使用本方法與商業(yè)試劑盒平行測試批量臨床樣本，Passing-Bablok相關(guān)性分析顯示兩種方法的相關(guān)系數(shù)為0.997 0（圖5A）；Bland-Altman一致性分析發(fā)現(xiàn)兩種方法的平均相對差值僅為4%（95%CI，圖5B）；配對t檢驗(yàn)P值為0.327，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明建立的POC-CLIA法與對照試劑盒檢測結(jié)果高度相關(guān)，檢測一致性良好，可用于臨床血清β-HCG定量檢測。同步檢測肝素鋰血漿樣本、EDTA-K2血漿樣本與血清樣本β-HCG發(fā)現(xiàn)，血漿樣本與血清樣本的檢測結(jié)果R2分別為0.999 0（圖6A）和0.998 7（圖6B），斜率k分別為0.918 0和0.998 7，表明血漿樣本與血清樣本檢測結(jié)果高度相關(guān)，可通用于血清及血漿β-HCG檢測。

圖5 商品化直接化學(xué)發(fā)光方法與POC-CLIA的Passing-Bablok（A）和Bland-Altman（B）分析Fig.5 Passing-Bablok （A） and Bland-Altman （B） analysis of commercial direct chemiluminescence and proposed method

圖6 肝素鋰血漿樣本（A）、EDTA-K2血漿樣本（B）與血清樣本的Passing-Bablok分析Fig.6 Passing-Bablok analysis of serum samples with lithium heparin plasma samples（A） and EDTA-K2 plasma samples （B）

2.11 方法學(xué)比較 比較建立的POC-CLIA與已報(bào)道的β-HCG檢測方法，目前定量檢測β-HCG的技術(shù)主要為免疫分析技術(shù)，包括膠體金免疫層析法（GICT）、ELISA、時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析法（dCLIA）等，本研究的POC-CLIA方法靈敏度更高，線性范圍更寬，檢測速度快，且可實(shí)現(xiàn)全自動POC檢測，具有較高臨床應(yīng)用價值（表6）。

表6 已報(bào)道的β-HCG檢測方法與本研究建立方法比較Tab.6 Comparison of reported assay for β-HCG detection and established method in this study

3 討論

HCG是包含237個氨基酸的異二聚體，由α亞基（α-HCG）和β亞基（β-HCG）組成，通過電荷非共價連接，共包含8個糖基側(cè)鏈［29］。其中，β-HCG是HCG的特有結(jié)構(gòu)，決定了其分子生物學(xué)和免疫學(xué)特性，其含量測定在臨床中應(yīng)用廣泛，常用于診斷妊娠、監(jiān)測妊娠過程、估計(jì)妊娠時間；在異位妊娠、唐氏綜合征、滋養(yǎng)層腫瘤、非妊娠性惡性瘤等疾病中也有顯著變化，如正常宮內(nèi)妊娠時血清β-HCG倍增時間為1.7～2.4 d，異位妊娠則需3～8 d。因此，建立簡單、快速的β-HCG檢測方法具有重要臨床意義。

本研究將免疫反應(yīng)、磁分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相結(jié)合，建立了一種靈敏度高、線性范圍寬、檢測速度快、特異性強(qiáng)的POC-CLIA檢測方法。由于磁微粒表面積大，增加了抗體承載能力，且Alp-AMPPD發(fā)光系統(tǒng)穩(wěn)定性好，可持續(xù)發(fā)光，因此本試劑盒具有高靈敏度，最低檢測限僅為0.71 mU/ml。本研究使用了一步程序，比通常使用的兩步程序更快，孵育時間僅為5 min，僅需14.5 min即可獲得準(zhǔn)確結(jié)果，線性范圍為0.710～1.092×104mU/ml，且在1.7×105mU/ml高濃度時無鉤狀效應(yīng)影響?？稍?7 ℃穩(wěn)定保存10 d，相當(dāng)于4 ℃下18個月。準(zhǔn)確度相對偏差在±10%之內(nèi)，批內(nèi)、批間精密度良好（CV＜10%），干擾物質(zhì)與β-HCG均無交叉反應(yīng)。將該方法用于臨床血清標(biāo)本β-HCG檢測，結(jié)果與對照廠家美國Abbott公司的試劑盒結(jié)果具有較高一致性（R2=0.997 0），且可用于血漿β-HCG檢測。

β-HCG檢測最早使用的放射免疫技術(shù)由于其放射性污染等逐漸淘汰。膠體金免疫層析法雖不需要特殊儀器設(shè)備，易于操作，但僅適用于β-HCG定性檢測，不能用于定量檢測，且靈敏度有限。目前定量檢測β-HCG的技術(shù)主要包括ELISA、TRFIA、dCLIA，其中ELISA存在酶穩(wěn)定性差、光度測量范圍窄、靈敏度較低等問題，易造成假陽性或漏診。TRFIA具有較高的特異度和靈敏度，但易受自然存在的稀土類物質(zhì)（主要來源于空氣中的灰塵、實(shí)驗(yàn)用蒸餾水、反應(yīng)容器等）影響，需在實(shí)驗(yàn)室干凈環(huán)境下進(jìn)行。dCLIA靈敏度高，檢測速度較快，但需配備較大儀器設(shè)備，不能用于POCT檢測。本研究的POC-CLIA方法靈敏度更高、線性范圍更寬、檢測速度快，且可實(shí)現(xiàn)全自動POC檢測。此外，配套儀器體積小，可連續(xù)裝載樣本，可實(shí)現(xiàn)β-HCG的POC檢測，利于在社區(qū)醫(yī)院推廣，實(shí)現(xiàn)早期妊娠和妊娠相關(guān)疾病篩查和監(jiān)測。