張小雨 譚海波 黃敏儀 貝偉劍 楊祎琦 （廣東藥科大學中醫(yī)藥研究院，廣州 510006）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的主要病因［1］。近年來，糖尿病在我國的發(fā)病率急劇增加，這就導致了DKD的發(fā)病率也持續(xù)攀升［2］。2021年國際糖尿病聯盟（IDF）公布全球糖尿病患者已突破5.73億，而中國已破1.4億成為世界之最，其中10%～40%的糖尿病患者會進展為DKD，給我國國民健康帶來了巨大的威脅和挑戰(zhàn)［3］。DKD發(fā)生過程中會伴隨大量的CD4+T細胞水平升高和IL-17促炎因子的釋放，并刺激和趨化巨噬細胞、樹突狀細胞和單核細胞向腎臟組織遷移，導致足細胞病變、腎小球硬化和蛋白尿的增加，最終導致DKD［4］。越來越多證據表明，T淋巴細胞激活和細胞因子誘導的炎癥反應和2型糖尿病及DKD密切相關［5］。機體內T淋巴細胞是重要的免疫細胞群，外周血成熟T細胞主要有CD4+T和CD8+T兩個亞群，其中CD4+T細胞識別主要是組織相容性復合物（MHC）Ⅱ遞呈的抗原肽，經激活分泌細胞因子，調節(jié)或協助免疫反應［6］。然而CD4+T細胞在DKD中是如何被激活的還有待進一步研究［7］。由于DKD患者常伴隨脂代謝異常，因此本研究從細胞分選與非靶向脂質組學相結合的角度初步探討了db/db小鼠CD4+T細胞在脂代謝中的差異，明確了差異代謝產物的數量和種類，分析其可能的代謝途徑，以期揭示DKD的免疫細胞脂質代謝特征，為以CD4+T細胞為靶標的DKD臨床藥物研發(fā)提供新思路和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本研究采用SPF級BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/J自發(fā)性DKD雄性小鼠為研究對象，設置正常組（m/m，25～30 g，10～12周齡）和DKD模型組（db/db，45～50 g，10～12周齡），飼養(yǎng)至12周，取小鼠脾臟備檢。小鼠均購自中國常州卡文斯實驗動物有限公司［SCXK（蘇）2016-0010］，合格證號：NO.202006494。本實驗經廣東藥科大學實驗動物倫理委員會批準（gdpulac2019180）。

1.1.2 試劑及耗材 耦聯大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體的磁珠（德國美天旎生物技術有限公司，140-005-121）；BSA（威佳科技，Y170720，批號：180728）；LS柱（5190923106）、MS柱（5191015024）、MidiMACSTMSeparator（5190814151）、MiniMACSTMSeparator（5190807507）、MACS MultiStand磁力架（50495） 均購自德國美天旎生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 BT125D精密電子天平（Sartorius）；Mithras LB940微孔板式多功能酶標儀（Berthold technologies）；多光譜顯微鏡（Olympus）；CytoFLEX流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特）；Centrifuge 5810R高速離心機（Eppendorf）；OPTION-S 7超純水儀（ELGA Lab Water）；8000直熱氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）；血糖儀（羅氏-卓越金采型）；LC-MS/MS（ExionLC AD UPLC-QTRAP，SCIEX）；離心機（5424R， Eppendorf）；電子天平（AS 60/220.R2，RADWAG）；球磨儀（MM400，Retsch）；離心濃縮儀（CentriVap，LABCONCO）；渦旋混合器（VORTEX-5，Kyllin-Bell）；超聲清洗儀（KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 db/db小鼠DKD特征檢測 檢測小鼠體質量及空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）情況，當FBG＞11.1 mmol/L時認為糖尿病模型成功；通過試劑盒檢測尿白蛋白/肌酐比值（UACR），模型組UACR顯著高于正常組，則認為DKD模型成功［7-8］。通過HE染色法檢測腎臟組織病理改變情況，當腎小球體積變大，并呈現明顯的系膜擴張，腎間質出現炎癥細胞浸潤，即可認為DKD小鼠達到備檢要求［9-10］。

1.2.2 脾臟淋巴細胞懸液的制備 研磨脾臟，用70 μm細胞濾網過濾，并收集單細胞懸液置于15 ml離心管中，將裝有細胞懸液的15 ml離心管置于離心機（4 ℃、300 g離心5 min），棄上清；加1 ml紅細胞裂解液，室溫避光孵育10 min，400 g離心5 min，去上清，加1 ml PBS，400 g離心5 min，棄上清；然后重懸進行細胞計數；并取適量懸浮液進行CD4流式抗體標記30 min，采用PBS洗滌2次，200 μl PBS重懸，采用流式細胞儀鑒定CD4+T細胞在分選前的比例。

1.2.3 脾臟CD4+T細胞磁珠分選及純度鑒定 根據CD4+T細胞磁珠分選試劑盒進行操作，首先將含1×107個脾臟單細胞懸液離心后棄上清，再加入90 μl緩沖液及10 μl CD4（L3T4）Microbeads（磁珠），充分混合，置于4 ℃冰箱中孵育10 min，進行后續(xù)的磁性細胞分離。將LS柱置于適當的MACS分離器磁場中，用適量緩沖液沖洗柱（MS：500 μl，LS：3 ml），將細胞懸液涂在色譜柱上，收集含有未標記細胞的流出物，即為CD4+T細胞部分。用適量的緩沖液洗滌色譜柱，收集流出的未標記細胞，并與以上未標記細胞的流出物混勻（MS：2×500 μl，LS：1×3 ml）。從分離器中取出色譜柱并將其放在合適的收集管中，用移液管將適量的緩沖液移到柱上，通過將柱塞牢牢地推入柱中，立即沖洗出磁性標記的CD4+T細胞，最后用流式細胞儀進行純度鑒定［11］。

1.2.4 脾臟CD4+T細胞非靶向脂質組學檢測前處理 取分選的細胞（8×106個），加入400 μl 80%甲醇溶液，放入預冷的-80 ℃凍干機中凍干；將凍干好的樣本取出，加入1 ml脂質提取劑，渦旋5 min，4 ℃靜置15 min；加入200 μl超純水，渦旋3 min，4 ℃靜置分層；12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取200 μl上清液濃縮；向濃縮干的樣本中加入200 μl復溶劑，振蕩5 min，離心5 min；取150 μl上清液到進樣瓶，并上機檢測。

1.2.5 脾臟CD4+T細胞非靶向脂質組學檢測色譜質譜采集條件 色譜采用超高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)［12］。色譜條件為：Thermo AccucoreTMC30 色譜柱（2.1×100 mm，2.6 μm），流動相A為乙腈/水（60/40，V/V）（含0.1%甲酸，10 mmol/L甲酸銨）；流動相B為乙腈/異丙醇（10/90，V/V）（含0.1%甲酸，10 mmol/L甲酸銨）；梯度系統(tǒng)：0～2 min，80%～70% A；2～4 min，70%～40% A；4～9 min，40%～15% A；9～14 min，15%～10% A；14～15.5 min，10%～5% A；15.5～17.3 min，5% A；17.3～17.5 min，5%～80%A；17.5～20 min，80% A；流速0.35 ml/min；柱溫45 ℃，進樣量 2 μl。

質譜采用串聯質譜（MS/MS）系統(tǒng)［13］。質譜條件為：電噴霧離子源（ESI）500 ℃，正離子模式下質譜電壓5 500 V，負離子模式下質譜電壓-4 500 V，離子源gas 1（GS1）45 psi，gas 2（GS2）55 psi，簾氣（CUR）35 psi，碰撞誘導電離（CAD）參數設置為Medium。在三重四極桿中，每個離子對是根據優(yōu)化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進行掃描檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Analyst 1.6.3處理質譜數據，進行峰識別、峰過濾等預處理，得到保留時間、離子檢測的離子流強度及峰面積。采用R軟件進行多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）多元統(tǒng)計分析。根據VIP值，結合t檢驗，篩選出“VIP≥1，P＜0.05”的差異代謝物?；谧越ò邢驑似窋祿霱WDB，根據檢測物質的保留時間RT、子母離子對信息及二級譜數據進行定性分析。利用KEGG數據庫對差異代謝物進行通路富集分析，預測脂質代謝信號通路。

2 結果

2.1 db/db小鼠DKD特征檢測結果 與正常組（m/m）相比，模型組（db/db）的體質量和血糖顯著升高（P＜0.05），UACR、低密度脂蛋白（LDL-C）顯著增加（P＜0.01），高密度脂蛋白（HDL-C）顯著降低（P＜0.01），總膽固醇（TC）顯著增加（P＜0.01），且模型組小鼠腎臟腎小球體積變大、呈現明顯的系膜擴張，并伴隨炎癥細胞浸潤，見圖1。提示該db/db小鼠具有DKD表型。

2.2 CD4+T細胞分選及純度鑒定結果 與正常組（m/m）相比，db/db小鼠CD4+T細胞比例顯著升高（P＜0.05），db/db小鼠分選后CD4+T細胞比分選前顯著升高（P＜0.01），m/m小鼠分選后CD4+T細胞比分選前顯著升高（P＜0.01），且CD4+T細胞在分選前后純度由10%提高至80%，見圖2。

圖2 CD4+T細胞分選流式結果Fig.2 Flow cytometry results of CD4+T cell sorting

2.3 非靶向脂質組學結果

2.3.1 代謝物定性定量分析結果 代謝物定量采用三重四極桿質譜的多反應監(jiān)測模式（MRM）分析完成。并采用軟件Analyst 1.6.3進行質譜數據分析。經過LC-MS法共檢測出463個代謝產物。見附圖1（www.immune99.com）。

2.3.2 主成分分析（PCA）結果 利用PCA了解各組樣本之間的代謝物差異大小。正常組（m/m）和模型組（db/db）在PCA二維結果，見圖3A。橫坐標PC1表示第一主成分，占樣品差異的58.43%。縱坐標PC2表示第二主成分，占樣品差異的16.42%，而在兩組PCA三維結果，見圖3B。橫坐標PC3表示第三主成分，占樣品差異的8.87%。說明縱向分布顯著分開，但橫向仍有部分交叉，代謝組分能夠在兩組間實現有效分離。

圖3 主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis

2.3.3 正交偏最小二乘法判別（OPLS-DA）分析結果 為了更好地識別正常組和DKD組CD4+T細胞差異脂質的變化，進一步進行兩組間OPLS-DA分析。為防止模型過擬合，進一步采用200次置換檢驗驗證模型。OPLS-DA模型中R2X=0.808；R2Y=0.999，Q2=0.882，表明模型擬合度和預測能力良好。對463個代謝產物按照物質一級分類，分別是甘油磷脂類、甘油脂類、鞘脂類、脂肪酰類以及異戊烯醇酯類。其中甘油磷脂類在代謝產物中的分類占比最大，有301個物質，其中大部分是磷脂酰膽堿、其次是磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸以及磷脂酰肌醇等物質。證明了磷脂酰膽堿是DKD組CD4+T細胞改變的關鍵差異脂質，見圖4。

圖4 OPLS-DA分析圖及脂質代謝物占比圖Fig.4 OPLS-DA analysis diagram and lipid metabolite proportion diagram

2.3.4 差異代謝物篩選結果 以差異倍數值（fold change）≥2和差異倍數值（fold change）≤0.5以及VIP≥1為條件篩選差異代謝物。差異代謝物火山圖顯示（圖5）：兩組共有439種代謝物無顯著性差異，一共有24個代謝物有顯著性，且上調和下調的差異代謝物的定量差異倍數較大。db/db小鼠中，有15個差異代謝物下調，分別是磷脂酰膽堿_PC（18：2_18：2）、磷脂酰甘油_PG（18：1_22：5）、肉堿C12-OH、甘油二酯_DG（18：2_18：2）、甘油二酯_DG（18：2_20：4）、溶血磷脂酰膽堿_LPC（0：0/20：0）、溶血磷脂酰膽堿_LPC（20：0/0：0）、溶血磷脂酰膽堿_LPC（20：2/0：0）、磷脂酰膽堿_PC（17：1_18：1）、磷脂酰膽堿_PC（19：0_18：2）、磷脂酰膽堿_PC（17：0_20：3）、磷脂酰膽堿_PC（19：0_20：4）、磷脂酰乙醇胺_PE（17：1_18：1）、磷脂酰乙醇胺_PE（18：1_18：1）、磷脂酰乙醇胺_PE（19：0_18：2）等物質；有9個差異代謝物上調，分別是磷脂酰乙醇胺_PE（18：1_22：5）、磷脂酰甘油_PG（18：0_20：4）、磷脂酰甘油_PG（18：1_20：4）、磷脂酰甘油_PG（18：1_20：5）、糖鞘脂_HexCer（d18：1/24：0）、溶血磷脂酰乙醇胺_LPE（P-18：1）、磷脂酰絲氨酸_PS（18：0_20：5）、磷脂酰絲氨酸_PS（18：1_22：6）、三酰甘油_TG（16：1_18：1_18：1）等物質。見表1。

表1 差異代謝物篩選結果Tab.1 Screening results of differential metabolites

圖5 差異代謝物火山圖Fig.5 Volcano map of differential metabolites

差異代謝物小提琴圖利用violin plot分析比較單個脂質差異代謝物在兩組中的表達情況，結果顯示：在正常組（m/m）和模型組（db/db）中磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿等脂質差異代謝物的表達量差異較大（圖6）。說明了磷脂類代謝與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關。

圖6 差異代謝物小提琴圖Fig.6 Violin chart of differential metabolites

2.3.5 差異代謝物KEGG分類以及富集分析圖7A結果顯示：差異代謝物KEGG分類主要分為有機系統(tǒng)類、代謝類、人類疾病相關類、環(huán)境信息處理類以及細胞進程類。其中差異代謝物屬于甘油磷脂代謝通路以及代謝途徑通路占比最大，分別占84.21%和78.96%。該結果證明了正常組（m/m）和模型組（db/db）的CD4+T細胞的脂質差異代謝物在甘油磷脂代謝通路和代謝途徑通路上有顯著差異。對KEGG通路進行富集分析，結果表明正常組（m/m）和模型組（db/db）的CD4+T細胞的脂質差異代謝物主要涉及甘油磷脂代謝、癌癥中的膽堿代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、甘油脂代謝、磷酸肌醇代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等代謝途徑。其中甘油磷脂代謝的點顏色最紅，表示參與其中的代謝物或代謝通路發(fā)生的變化越明顯。其次是癌癥中的膽堿代謝也較為顯著，見圖7B。說明了DKD CD4+T細胞甘油磷脂類代謝通路的紊亂與DKD發(fā)生發(fā)展密切相關。

圖7 差異代謝物KEGG分類以及富集分析Fig.7 KEGG classification and enrichment analysis of differential metabolites

3 討論

DKD是慢性腎臟疾病進展為終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）的主要原因［14］。大量研究顯示CD4+T細胞與ESRD的發(fā)生發(fā)展密切相關［15-16］。CD4+T淋巴細胞的募集和浸潤可能參與了DKD進展過程中免疫發(fā)病機制的啟動和進展［17-18］。近年來，越來越多的研究發(fā)現DKD患者常伴有脂代謝紊亂，然而具體機制及內在聯系仍未十分明確［19-20］。本文主要通過對DKD小鼠脾臟CD4+T細胞脂質代謝差異進行研究，發(fā)現正常組（m/m）和模型組（db/db）小鼠內源性脂質代謝產物差異主要為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺等物質的改變。有研究表明，甘油磷脂代謝通路與機體脂代謝和糖代謝紊亂密切相關，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺都是甘油磷脂的代謝產物，糖尿病與慢性腎病等代謝性疾病的患者血清中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量均有異常改變，且這兩類脂質中間產物與糖尿病并發(fā)的炎癥、氧化應激和動脈硬化等密切相關［21］。溶血磷脂酰膽堿是磷脂酰膽堿合成的中間產物，同時也是細胞膜與介導信號轉導的基本組成部分，而磷脂酰膽堿是細胞膜脂質雙分子層的主要成分［22］。在細胞膜融合、胞飲作用、膜運轉作用及膜中酶的催化活性等方面起重要的作用。能使血漿中膽固醇水平降低20%［23-24］。本研究結果顯示溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿在db/db脾臟CD4+T細胞中顯著下調，且主要涉及甘油磷脂代謝通路紊亂，可能是DKD進展的潛在新機制。

綜上所述，脂質代謝組學是脂代謝疾病生物標志物發(fā)現的新方法［25］。由于DKD患者常伴隨脂代謝異常［26］。因此本研究從細胞分選及脂代謝組學相結合的角度初步探討了DKD小鼠CD4+T脂代謝中的差異，通過PCA、OPLS-DA分析、差異代謝物篩選、KEGG功能注釋及富集分析，完成了組間的區(qū)分和對差異代謝物的篩選，明確了差異代謝產物的數量和種類［27］。篩選得到的差異代謝物主要參與甘油磷脂代謝途徑，提示磷脂類代謝與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究結果為以CD4+T細胞為靶標的DKD臨床藥物研發(fā)提供新思路和實驗基礎。