張紅艷,鄭良建,肖慈然,楊婷,丁少川,張劍波

解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum,UU)也稱為溶脲脲原體,隸屬于細菌域、柔膜菌門、柔膜菌綱、支原體目、支原體科下的脲原體屬,分為2個生物群,共14個血清型。解脲脲原體主要存在于人體的泌尿生殖道,在男性可導(dǎo)致非淋菌性尿道炎、前列腺炎、附睪炎、不育等［1-2］;在女性導(dǎo)致陰道炎、宮頸炎、盆腔炎、不孕不育、早產(chǎn)、圍產(chǎn)期感染、合并陰道加德納菌感染等［3-5］;還可以導(dǎo)致新生兒腦室出血、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等不良妊娠結(jié)局［6］。

氟喹諾酮類藥物具有廣譜抗菌活性、口服吸收好、在泌尿生殖道中極易達到抗菌濃度等優(yōu)點,成為臨床上治療支原體感染的一線藥物。然而,由于抗生素濫用、反復(fù)感染及遷延不愈等多種因素,解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的敏感性下降,出現(xiàn)耐藥并日趨嚴重,給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn),嚴重威脅人類的身體健康和生活質(zhì)量。盡管目前已有研究報道解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥率和耐藥機制,但不同地區(qū)的研究結(jié)果之間存在地域差異。因此,研究本地區(qū)解脲脲原體臨床株的拓撲異構(gòu)酶基因突變特點對于掌握本地區(qū)耐藥株的流行病學(xué)資料、減少耐藥株的產(chǎn)生、指導(dǎo)臨床用藥以及提高患者治愈率具有重要現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1菌株來源 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院東院區(qū)2021年9月—2022年2月分離的對氟喹諾酮類藥物不同程度耐藥的解脲脲原體臨床菌株。男性患者取尿道分泌物,禁尿2 h以上用無菌細小棉拭子緩慢插入尿道2～4 cm處,捻轉(zhuǎn)1周并停留30 s后取柱狀上皮細胞;女性患者取宮頸分泌物,無菌棉拭子插入宮頸1～2 cm旋轉(zhuǎn)360°后停留30 s取柱狀上皮細胞。標本采集后立即送檢。

1.2標準菌株 解脲脲原體標準菌株ATCC27815由眾愛生河北生物科技有限公司惠贈。

1.3主要試劑 支原體肉湯基礎(chǔ)(英國OXOID公司),A7固體培養(yǎng)基(廣東江門凱琳貿(mào)易有限公司),最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)藥敏板(溫州康泰生物科技有限公司),支原體鑒定及藥敏試劑盒(眾愛生河北生物科技有限公司),DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司),PCR試劑(成都擎科生物科技有限公司)。

1.4支原體鑒定及藥敏試驗 支原體鑒定及藥敏試劑盒購自眾愛生河北生物科技有限公司,液體培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榉奂t色且固體培養(yǎng)基上有典型的支原體菌落生長判讀為陽性,低倍鏡下觀察解脲脲原體呈棕褐色“海膽”樣菌落。具體操作及結(jié)果判定均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.516SrRNA分子鑒定 通過商品化試劑盒篩選出對氟喹諾酮類藥物不同耐藥表型的解脲脲原體共58株,其中有2株敏感株。將菌落在固體平板(A7瓊脂)上純化后, 按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取DNA模板,并用16SrRNA測序技術(shù)對其進行分子鑒定。

1.6藥物MIC值測定 經(jīng)16SrRNA分子鑒定確認的陽性菌株,參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會CLSI M43-A(2011版)指南［7］,將4種氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、莫西沙星(MXF)和加替沙星(GAT)倍比稀釋成12個不同的濃度,每次實驗均設(shè)計2個空白,1個陰性對照和1個陽性對照。以解脲脲原體標準菌株ATCC27815為整個實驗的對照組和質(zhì)控株。采用微量肉湯稀釋法測定MIC,LEV和MXF的MIC≥4 μg/mL判讀為耐藥。

1.7PCR擴增測序 針對UU拓撲異構(gòu)酶基因(gyrA、gyrB、parC、parE)的氟喹諾酮耐藥決定區(qū)域(quinoloneresistancedeterminingregions, QRDRs)設(shè)計引物［8］。gyrA-F:TTGCTGCTTTCGAAAACGG,gyrA-R:CTGATGGTAAAACACTTGG;gyrB-F:CCTGGTAAAT TAGCTGACTG,gyrB-R:TTCGAATATGACTGCCATC;parC-F:ACGCAATGAGTGAATTAGG,parC-R: CACTATCATCAAAGTTTGGAC;parE-F:ATGGGCGGAA AATTAACGC,parE-R:CTTGGATGTGACTACCATCG。挑取A7固體培養(yǎng)基上的單顆菌落,按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取DNA模板。PCR擴增采用50 μL的反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:98 ℃預(yù)變性3 min; 98 ℃變性10 s、54 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s,共循環(huán)40次;最后72 ℃進一步延伸5 min。PCR反應(yīng)完畢后,將產(chǎn)物點樣于溴乙錠預(yù)染色的1.25%的瓊脂糖凝膠上電泳35 min,同時用DL5000 DNA Marker做對照。目的條帶回收純化后,由成都擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.8數(shù)據(jù)分析 測序結(jié)果用DNAMAN軟件和BLAST將測定序列與標準菌株ATCC27815(GenBank CP000942.1)的序列進行比對,找出拓撲異構(gòu)酶基因的堿基突變位點及相應(yīng)的氨基酸改變。分析gyrA、gyrB、parC、parE基因QRDR區(qū)域的基因突變與氟喹諾酮類藥物MIC值的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥率 2021年9月—2022年2月本院區(qū)微生物實驗室共收到支原體培養(yǎng)標本1 387例,其中解脲脲原體單獨陽性感染的有635例,解脲脲原體陽性率為45.78%(635/1 387)。從解脲脲原體陽性的標本中隨機選取58例經(jīng)16SrRNA基因測序證實為解脲脲原體的菌株進行微量肉湯稀釋法藥敏試驗。藥敏結(jié)果顯示,解脲脲原體對左氧氟沙星和莫西沙星的耐藥率分別為79.31%(46/58)和5.17%(3/58),結(jié)果見表1。

表1 解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥率

2.2解脲脲原體拓撲異構(gòu)酶QRDR區(qū)堿基與對應(yīng)的氨基酸變異 在58株拓撲異構(gòu)酶基因測序的UU中,有46株發(fā)生了parC基因248位堿基C到T的突變,導(dǎo)致ParC 83位絲氨酸變異為亮氨酸(TCA→TTA),ParC S83L的變異率為79.31%(46/58); 9株發(fā)生了parC基因373位堿基A到G的突變,導(dǎo)致ParC 125位蘇氨酸變異為丙氨酸(ACA→GCA),ParC T125A的變異率為15.52%(9/58); 3株發(fā)生了gyrB基因1 384位堿基C到T的突變,導(dǎo)致GyrB 462位脯氨酸變異為絲氨酸(CCA→TCA),GyrB P462S的變異率為5.17%(3/58)。具體結(jié)果見表2,圖1。

The arrow indicates a mutation in the 248 base C of the parC gene to T, resulting in ParC S83L; The arrow indicates a mutation at base C of gyrB gene 1 384 to T, resulting in GyrB P462S

表2 解脲脲原體拓撲異構(gòu)酶QRDR區(qū)堿基與對應(yīng)的氨基酸變異

2.3解脲脲原體QRDR氨基酸變異與氟喹諾酮類藥物MIC值的相關(guān)性 對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星同時耐藥的解脲脲原體株發(fā)生了ParC S83L的氨基酸變異,ParC S83L的氨基酸變異使解脲脲原體對環(huán)丙沙星的MIC值從4 μg/mL升高至8～32 μg/mL,對左氧氟沙星的MIC值從2 μg/mL升高至4～16 μg/mL。對莫西沙星和加替沙星同時耐藥的解脲脲原體株發(fā)生了GyrB P462S的氨基酸變異,GyrB P462S的氨基酸變異使解脲脲原體對莫西沙星和加替沙星的MIC值從2 μg/mL升高至4～8 μg/mL。ParC S83L合并GyrB P462S氨基酸變異時,解脲脲原體對環(huán)丙沙星的MIC值則可進一步升高至64～128 μg/mL,對左氧氟沙星的MIC值可進一步升高至32 μg/mL。7株耐藥株和2株敏感株中發(fā)現(xiàn)了ParC T125A的氨基酸變異,ParC T125A變異株相較于未產(chǎn)生該變異的菌株,其與4種氟喹諾酮類藥物MIC值的變化相關(guān)性差。標準菌株ATCC27815無任何氨基酸變異發(fā)生,所有菌株均未發(fā)現(xiàn)gyrA基因和parE基因?qū)?yīng)的氨基酸改變,見表3。

表3 解脲脲原體 QRDR氨基酸變異與氟喹諾酮類藥物MIC值的相關(guān)性

3 討論

泌尿生殖道支原體感染是臨床上關(guān)注的熱點問題。解脲脲原體感染占據(jù)支原體感染的首位,與泌尿生殖道炎癥、不孕不育等疾病密切相關(guān)。目前,大多數(shù)醫(yī)療單位均采用單純的液體培養(yǎng)法對支原體進行鑒定和藥敏試驗,容易受到細菌和真菌的污染導(dǎo)致假陽性。本研究通過引入固體培養(yǎng)法來確認支原體的菌落形態(tài),并進一步利用16SrRNA基因序列分析技術(shù)對解脲脲原體進行分子水平的鑒定,顯著提高了泌尿生殖道支原體感染診斷的準確性。本研究綜合美國臨床實驗室標準化協(xié)會CLSI M43-A文件和生殖道支原體感染診治專家共識,采用微量肉湯稀釋法檢測解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的敏感性。結(jié)果顯示,解脲脲原體對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MIC50分別為16、4、1、1 μg/mL,MIC90分別為32、8、2、2 μg/mL,說明新一代氟喹諾酮類藥物莫西沙星和加替沙星較老一代環(huán)丙沙星和左氧氟沙星具有較強的抗解脲脲原體活性。本研究顯示,解脲脲原體對左氧氟沙星的耐藥率高達79.31%,這與中國杭州地區(qū)和上海地區(qū)的研究相一致［9-10］。而在突尼斯、法國等地區(qū),解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥率則較低［11-12］。德國的研究發(fā)現(xiàn),解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥率為7.1%［13］。不同國家和地區(qū)的解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥性報道不一致,可能與研究的人群構(gòu)成不同、樣本量不同、抗生素使用習慣以及各地區(qū)流行率差異和檢測方法不同等因素有關(guān)。

氟喹諾酮類藥物作用靶酶是Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶,包括DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ。氟喹諾酮類藥物通過與拓撲異構(gòu)酶形成復(fù)合物來阻斷DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等功能,進而抑制DNA的合成,發(fā)揮抑菌或殺菌作用。DNA旋轉(zhuǎn)酶又稱拓撲異構(gòu)酶Ⅱ,由兩個亞單位A和B以A2B2的形式組成四聚體,其中A亞單位由染色體基因gyrA編碼,B亞單位由染色體基因gyrB編碼。拓撲異構(gòu)酶Ⅳ也是A2B2形式的四聚體, 其中A亞單位由染色體基因parC編碼,B亞單位由染色體基因parE編碼。拓撲異構(gòu)酶基因(gyrA、gyrB、parC、parE)的突變會導(dǎo)致細菌或支原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥,這些區(qū)域稱為QRDRs［14-15］。解脲脲原體對氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率逐年上升,其最重要的耐藥機制是由DNA旋轉(zhuǎn)酶基因 (gyrA、gyrB)與拓樸異構(gòu)酶Ⅳ基因 (parC、parE)在QRDRs發(fā)生點突變導(dǎo)致。

在本次納入研究的解脲脲原體中,有46株發(fā)生了parC基因248位堿基C到T的突變,導(dǎo)致ParC 83位絲氨酸變異為亮氨酸(TCA→TTA); 9株發(fā)生了parC基因373位堿基A到G的突變,導(dǎo)致ParC 125位蘇氨酸變異為丙氨酸(ACA→GCA); 3株發(fā)生了gyrB基因1 384位堿基C到T的突變,導(dǎo)致GyrB 462位脯氨酸變異為絲氨酸(CCA→TCA)。結(jié)果顯示ParC S83L為本地區(qū)最常見的變異,變異率為79.31%。因此,ParC S83L變異為成都地區(qū)解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機制,與國內(nèi)外的研究報道一致［8-9,16-17］。

ParC S83L的氨基酸變異導(dǎo)致解脲脲原體對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的MIC值升高了2～16倍,GyrB P462S的氨基酸變異使解脲脲原體對莫西沙星和加替沙星的MIC值從2 μg/mL升高至4～8 μg/mL,因此,gyrB基因的突變使解脲脲原體對莫西沙星和加替沙星從敏感變成了耐藥。有3個樣本同時發(fā)生了parC和gyrB基因的雙突變,這3個樣本對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的MIC值進一步增加到64～128 μg/mL和32 μg/mL,提示當DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ均發(fā)生變化, 則耐藥程度大于單個酶改變,表明解脲脲原體對氟喹諾酮類耐藥性相關(guān)的多個基因突變對于耐藥性的表型有累加效應(yīng)。7株耐藥株和2株敏感株中發(fā)現(xiàn)了ParC T125A的氨基酸變異,ParC T125A變異株相較于未產(chǎn)生該變異的菌株,其與4種氟喹諾酮類藥物MIC值的變化相關(guān)性差,表明ParC T125A變異與解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥沒有相關(guān)性,只是非耐藥相關(guān)的種屬特異的多態(tài)性表現(xiàn)。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了1株GyrA D112H變異［8］,但并沒有足夠證據(jù)表明gyrA基因突變與解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥有關(guān)。重慶地區(qū)的報道發(fā)現(xiàn)了1個新突變ParE L408I［18］,但該突變也沒有引起解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥,可能為無義突變。表明拓撲異構(gòu)酶gyrA和parE基因即使存在突變,也有可能是無義突變,在解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥中作用不大。本次研究所有菌株均未發(fā)現(xiàn)gyrA和parE基因?qū)?yīng)的氨基酸改變,提示gyrA和parE基因在本地區(qū)解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制中不占主要作用。

綜上所述,拓撲異構(gòu)酶基因parC248位堿基C突變?yōu)門導(dǎo)致的ParC S83L變異為解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機制,parC和gyrB基因的雙突變可導(dǎo)致耐藥性的進一步增加。此外,在解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥株中并非全部都能檢出突變基因,這說明除了拓撲異構(gòu)酶基因介導(dǎo)的耐藥外,還可能存在其他的耐藥機制,例如過度表達外排泵以及生物膜的形成［19-20］等因素。因此,解脲脲原體對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制有待進一步深入研究。