王 鵬, 王振亞, 汪 舜, 張 杰, 張 哲, 楊天航, 王弼陡1, *,羅剛銀1, *, 翁良飛, 張翀宇, 李 原

1. 中國科學技術(shù)大學生物醫(yī)學工程學院(蘇州), 生命科學與醫(yī)學部, 江蘇 蘇州 215163

2. 中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術(shù)研究所工程化研究中心, 江蘇 蘇州 215163

3. 重慶國科醫(yī)創(chuàng)科技發(fā)展有限公司分子診斷中心, 重慶 400700

引 言

聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是分子生物學常用的檢測手段, 能夠檢測生物特定DNA和RNA的濃度, 對疾病診斷、 法醫(yī)鑒定和食品安全檢測等應(yīng)用有重要的意義[1-5]。 其主要原理是在PCR過程中, 加入能夠與待測核酸反應(yīng)的特定熒光基團, 通過檢測熒光值的上升, 推算核酸量的增加過程。 理論上, 檢測到的熒光值大小, 能夠?qū)?yīng)已反應(yīng)熒光染料的濃度, 可以推算出核酸的量。

在實際操作中, 由于激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的重疊以及濾光片過濾帶寬限制帶來的熒光串擾, 使測得的信號無法真實反映被測目標的準確值。 研究中主要采取以下幾種解決方式來減少串擾帶來的影響, (一)通過系統(tǒng)設(shè)計, 如濾光片選擇或分時復用等方式, 最大限度地減少干擾的存在。 如Lewis等采用分時復用的方式將各波段的激光脈沖及對應(yīng)染料的熒光信號在時間上分離, 消除了傳統(tǒng)DNA測序技術(shù)的光譜串擾[6]。 該方法降低了對染料的要求, 但對所用熒光染料仍有所限制。 (二)根據(jù)系統(tǒng)采用的硬件參數(shù), 正向計算獲得熒光補償系數(shù)。 如Gei?ler等設(shè)計的FRET生物傳感器, 其補償矩陣中各元素通過熒光光譜直接計算獲得[7]。 Liu等同樣是通過熒光光譜獲得串擾數(shù)據(jù), 獲得了待測對象的精確測量結(jié)果[8]。 以上方法均是根據(jù)硬件的物理參數(shù)進行計算熒光補償矩陣中各個元素的具體值。 實際系統(tǒng)往往與理論值有些許偏差, 再加上激發(fā)光和發(fā)射光的疊加影響, 導致計算過程復雜。 還有一種比較常用的確定串擾的方式, 通過實驗反向求解串擾系數(shù)。 Yin、 Li和Huang等分別在各自的DNA測序研究中, 采用四維空間聚類方法, 通過迭代計算, 確定熒光強度分布和染料濃度之間的映射關(guān)系[9-11]。 Domnioru等提出利用信號的強度差異代替信號本身來進行計算, 使得無需基線調(diào)整, 即可實現(xiàn)串擾校正的目的[12]; 該算法主要是針對4種及以下不同的熒光的分離與分析, 對于4種以上染料組合討論較少。 對于4種以上熒光串擾的計算, Gothot等通過實驗獲得線性方程組的各個系數(shù), 從而得到熒光補償矩陣[13]。 在補償效果評估方面, Li等在研究中提出了一種定量方法來評價串擾校正的質(zhì)量[11]。 臧留琴等在標準迭代四維聚類分析的基礎(chǔ)上提出了一種對串擾矩陣進行估算的方法[14]。 以上方法實驗操作過程繁瑣, 或需要通過多次迭代才能獲得比較理想的補償矩陣。

主成分分析(principal component analysis, PCA)是一種常見的數(shù)據(jù)分析方式, 常用于高維數(shù)據(jù)的降維, 可用于提取數(shù)據(jù)的主要特征分量。 目前已有研究者將其應(yīng)用于微弱信號分離。 Hasegawa提出了利用主成分分析檢測混合光譜中微弱光譜變化的方法[15-16]。 有研究采用流式細胞術(shù)對藍細菌進行光譜流式檢測時, 提出利用主成分分析、 多元曲線分辨以及交替最小二乘法得到純組分光譜及其組分濃度。 該方法計算量小, 能夠快速定位獲得目標數(shù)據(jù)。

本研究將主成分分析方法應(yīng)用于熒光定量PCR測量過程中的熒光補償, 適用于4色及以上的多重熒光補償。 本方法不需經(jīng)過迭代, 即可獲得補償矩陣, 有效地減少計算量。 采用得到的熒光補償矩陣去除非目標通道的熒光串擾, 可實現(xiàn)熒光通道數(shù)據(jù)的解耦。

1 理 論

在多重熒光定量PCR設(shè)備的設(shè)定中, 各染料理論發(fā)射熒光值記為“染料向量”F, 各通道的檢測值記為“檢測向量”R, 理想情況下F等于R, 但在實際操作中, 由于濾光片的選擇、 光譜重疊等因素影響, 導致測得的“檢測向量”R無法直接用于表示各染料的實際濃度值。 向量F與向量R之間關(guān)系如式(1)。

R=MF

(1)

式(1)中, 轉(zhuǎn)換矩陣M為n×n的方陣,n為熒光染料/檢測通道數(shù)量, 該矩陣即為熒光串擾矩陣。M的列向量表示某染料在各個檢測波長下的熒光強度。 計算的目標是針對特定系統(tǒng)得到矩陣M, 但在實際檢測中, 由于無法直接獲得“染料向量”F中各元素的理論值, 因此無法通過方程線性求解系數(shù)的方式進行計算。

為了方便描述, 考慮二維數(shù)據(jù)情形, 假設(shè)有兩種熒光染料dye1和dye2及其對應(yīng)檢測通道channel1和channel2, 當取不同濃度的dye1進行實驗時, 由于熒光光譜的重疊, 會有部分熒光進入到channel2中, 實驗得到的數(shù)據(jù)將如圖1所示, 其中X軸為channel1數(shù)據(jù),Y軸為channel2數(shù)據(jù)。 在系統(tǒng)硬件一定的情況下, 可以看出dye1在channel1和channel2中的比例相對固定, 其中的數(shù)據(jù)波動來源于測量誤差。 計算熒光串擾, 就是要確定dye1在各通道中的讀數(shù)比例。

圖1 兩通道數(shù)據(jù)分布和其降維后的投影向量

主成分分析是數(shù)據(jù)分析中常用的降維方法, 其原理是通過尋找一組新的坐標系, 將原始數(shù)據(jù)投影至該坐標系下, 同時最大限度地保留原始信息。 將其原理應(yīng)用于串擾補償, 對于二維坐標系的情形, 若想進行降維, 很容易觀察到, 圖1中e所指的方向即為將來降維后新坐標系的基。 因此通過主成分分析方法, 找到其第一主成分, 其所代表的方向即指出了染料在各個通道的分布情況。 以上是在兩個通道的情形下進行計算, 當通道數(shù)增多時, 該計算方法的優(yōu)勢將更加明顯。

將上述方法拓展到n個染料的情況, 當采用某個單一染料進行實驗時, 將會得到不同濃度的該染料在各個檢測通道熒光分布情況, 測得的數(shù)據(jù)組成一個n×i的矩陣, 其中n為通道數(shù),i為實驗次數(shù)。 對該矩陣中的數(shù)據(jù)進行主成分分析, 得到第一主成分。 新得到的“主成分”所表示的并不是某一通道的熒光值, 而是一種抽象的混合熒光; 雖然如此, 但是該主成分所表示的向量, 明確地給出各熒光通道所占比例。 通過將該主成分旋轉(zhuǎn), 即可反向計算得到該染料真正的熒光值或者相對熒光值, 同時其對其他通道的串擾也得到了量化, 通過計算將該部分串擾從其他通道中剔除。 對其他通道染料進行同樣的單一染料實驗和分析, 可以獲得其他染料的主成分向量。 將得到的n個主成分向量分別作為矩陣的n個列向量, 即可獲得矩陣M。

2 實驗部分

2.1 測試平臺

設(shè)計了如圖2所示檢測光路, 激發(fā)光路由LED光源、 準直透鏡、 激發(fā)濾光片、 二向色鏡及熒光收集透鏡組成, 激發(fā)光激發(fā)樣品管內(nèi)熒光物質(zhì), 發(fā)射的熒光經(jīng)過熒光收集透鏡、 二向色鏡、 發(fā)射濾光片、 熒光聚焦透鏡, 由探測器接收。

圖2 光學原理圖

在系統(tǒng)設(shè)計時, 選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾光片對, 以優(yōu)化激發(fā)光收集, 同時最小化熒光團之間的串擾。 由于很多熒光物質(zhì)的斯托克斯位移只約30 nm, 因此要求激發(fā)和發(fā)射濾光片必須有矩形化的通帶波形和較高的截止深度。 各通道選用LED激發(fā)光源均具有特定的光譜曲線, 在保證充分激發(fā)功率的同時, 還需要考慮熒光基團之間的串擾和其他通道激發(fā)光之間的串色問題。 其主要矛盾為: FAM、 HEX、 ROX、 Cy5的發(fā)射波長分別與HEX、 ROX、 Cy5、 Cy5.5的激發(fā)波長有一定程度的疊加, 因此在考慮較高的檢測效率和信噪比的同時, 應(yīng)盡可能減少光譜重疊。 基于上述原理, 所選擇的5通道濾光片組合及二向色鏡參數(shù)見表1。

表1 實驗平臺所用光學元件參數(shù)表

5種染料的熒光發(fā)射光譜及本實驗平臺所選擇的檢測通道如圖3所示。 由圖3可以看出, 選擇的硬件可以將大部分非目標通道熒光過濾掉, 但在各目標通道內(nèi), 仍或多或少的混入了其他熒光染料的發(fā)射光。

圖3 染料的熒光光譜及對應(yīng)檢測通道

2.2 試劑

研究了FAM、 HEX、 ROX、 Cy5和Cy5.5五種染料的光譜串擾。 染料采購自ThermoFisher, 相關(guān)信息見表2。 采用凱基生物的磷酸鹽緩沖液(PBS, 貨號: KGB5001)作為稀釋劑進行染料稀釋。

表2 測試所用試劑信息

2.3 補償矩陣的確定

補償矩陣的測試需進行單一染料實驗。 在實驗開始前, 需先確定系統(tǒng)熒光染料濃度線性范圍。 將5種染料分別稀釋8個梯度, 為了減少實驗誤差, 每個梯度進行3重復, 10 min內(nèi)連續(xù)讀取, 對讀取的熒光檢測數(shù)據(jù)進行分析, 確定染料的線性范圍, 同時確定各染料的熒光背景。

分別在各染料濃度線性范圍內(nèi), 再選取16個濃度梯度, 加入PBS稀釋劑, 配制成單一染料溶液, 分別將單一染料放入搭建的實驗平臺, 每隔30 s讀取一次, 重復讀取20次。 對于任一單一染料, 每次讀數(shù)均可得到所有通道熒光檢測數(shù)據(jù)。 采用前述提出的方法, 處理實驗得到的各通道數(shù)據(jù), 可得到熒光補償矩陣。

2.4 多重顏色分辨實驗

由于無法得到不同濃度染料的理論熒光值, 因此在多種染料混合測試時, 評價染料的串擾程度比較困難。 設(shè)計了一組顏色分辨實驗來驗證前述算法結(jié)果的準確性。 為了保證每各染料濃度都有相同機會接受測試, 而不受試驗人員主觀傾向的影響, 采用隨機方式將不同濃度的多種染料進行組合測試, 將得到的數(shù)據(jù)進行熒光補償后, 評價各染料熒光的線性度。 在PCR管中以盲法分析5種染料的混合物, 5種染料分別取各自線性范圍內(nèi)的6個濃度, 濃度從大到小依次編號1—6, 隨機混合12組混合染料, 染料溶液混合方式由Matlab隨機數(shù)發(fā)生器確定, 具體混合見表3, 每種混合方式對測試平臺是未知的。

表3 染料隨機組合表

3 結(jié)果與討論

3.1 補償矩陣的計算結(jié)果

檢測結(jié)果如圖4(a—e)所示, 分別表示用FAM、 HEX、 ROX、 Cy5和Cy5.5單一染料進行測試時, 各通道測得的熒光數(shù)據(jù), 其中橫坐標為相對應(yīng)染料的熒光值, 縱坐標為其余通道的熒光值, 圖中數(shù)據(jù)已被去除熒光背景。

圖4 不同濃度染料在各個通道的測試結(jié)果

從圖4(b)中可以看出, HEX染料對FAM通道、 ROX染料對HEX通道、 Cy5染料對Cy5.5通道、 Cy5.5通道對Cy5通道分別有明顯的干擾, FAM染料對HEX通道有輕微的串擾, 其余通道無明顯的串擾。 另外, 從圖中可以看出隨著染料濃度的降低, 受干擾通道的線性度降低, 這是由于低濃度時, 受干擾通道接受到的光信號較弱, 超出了系統(tǒng)可檢測的線性范圍。 這種非線性對于熒光補償來說是不利的, 但由于熒光值本身較小, 對檢測影響不大。 個別濃度熒光值橫軸間距不一致, 此外, 在低濃度時, 檢測結(jié)果聚集成團, 推測是由于手動配制染料及實驗誤差所導致。

利用主成分分析方法, 獲得熒光補償矩陣見式(2)。

(2)

實驗過程中, 由于系統(tǒng)誤差帶來的數(shù)據(jù)波動, 導致串擾矩陣中部分元素出現(xiàn)負數(shù), 但理論上, 不應(yīng)產(chǎn)生負串擾, 因此, 將負值設(shè)為0, 并對矩陣的每一列重新歸一化, 得到新的串擾矩陣見式(3)。

(3)

觀察串擾矩陣發(fā)現(xiàn), Cy5通道對Cy5.5通道串擾較大, 串擾比例為8.76%, 意味著當僅采用Cy5染料進行實驗時, Cy5.5通道也可檢測到Cy5通道數(shù)值約8.76%的熒光值; 同樣, Cy5.5通道對Cy5通道串擾影響也相對較大, 比例約為6.2%; 其次是ROX通道對HEX通道串擾, 比例約為2.68%; HEX通道對FAM通道串擾, 比例約為1.58%; FAM通道對HEX通道串擾相對較小, 比例約為0.25%, 其余通道無明顯串擾。 與圖4顯示結(jié)果一致。

3.2 單一染料熒光補償結(jié)果

將圖4中測試數(shù)據(jù)R, 代入式(1), 進行熒光補償計算, 得到染料的理論熒光值F, 以同樣的方式繪制各通道數(shù)據(jù), 如圖5(a—e)所示。

圖5 經(jīng)過串擾補償后不同濃度染料在各個通道的分布情況

由圖5(a—e)中可以看出, 經(jīng)過補償之后, 非目標通道的數(shù)據(jù)基本呈水平狀態(tài), 對各個通道分別進行線性擬合, 斜率最大為10-8, 趨近于零, 即非目標通道數(shù)值不隨目標通道染料熒光值的上升而變化, 實現(xiàn)了熒光通道間串擾的解耦。

3.3 多重顏色分辨實驗結(jié)果

熒光補償矩陣與測試平臺硬件及染料特性具有密切相關(guān)性, 當測試平臺和染料熒光特性不變, 通過單一染料實驗獲得的補償矩陣, 同樣適用于多重染料的情況。 將不同濃度混合的染料放入搭建的實驗平臺, 分別進行實驗, 將得到的測試結(jié)果代入前述補償矩陣, 測得各染料濃度柱狀圖見圖6。

圖6 混合染料的測試數(shù)據(jù)

對比觀察表3和圖6發(fā)現(xiàn), 同一濃度的同一染料, 在不同的混合組合中, 熒光值相差不大, 沒有受到其他通道的明顯干擾。 從圖4(d)中可知, Cy5染料對Cy5.5通道有明顯的串擾, 表3中組合5和組合9里Cy5染料的濃度相差較大, 而兩組中Cy5.5染料濃度較低且為同一值, 由圖6看出, 經(jīng)過補償補償后, 無論Cy5的染料濃度多大, Cy5.5的熒光值基本不受影響。 另外, ROX對HEX有明顯串擾, 在組合5和組合12中, HEX濃度均為同一低值, 但ROX濃度相差較大, 但從圖6可以看出, 兩個組合中, HEX染料的熒光值基本一致, 未受到明顯的干擾。 補償算法有效地去除了染料間的干擾。

對各混合物中測得的不同濃度染料按照濃度大小進行了排序, 并取對數(shù)。 由圖7看出, 對同一染料的不同濃度梯度進行擬合, 最大線性相關(guān)系數(shù)為0.999 3, 采用該算法, 能夠很好地對染料的原始熒光進行區(qū)分。

圖7 各染料梯度的線性擬合

4 結(jié) 論

光譜重疊現(xiàn)象廣泛存在于熒光定量PCR等多種熒光檢測領(lǐng)域, 對檢測結(jié)果帶來不利影響。 本工作提出將主成分分析中求解主成分向量的計算方法, 應(yīng)用到熒光定量PCR系統(tǒng)中, 該方法無需經(jīng)過迭代計算, 即可獲得系統(tǒng)的熒光補償矩陣。 經(jīng)過該矩陣的轉(zhuǎn)換, 能夠非常有效地分離各個熒光通道數(shù)據(jù)。 設(shè)計了染料分辨實驗, 通過對隨機組合的6個不同濃度的5種染料混合物進行實驗測試和分析, 從中高效地分離了各個染料成分及其濃度, 進一步驗證了方法的有效性。 本方法不受通道數(shù)量限制, 不僅可用于熒光定量PCR系統(tǒng)的熒光補償校正, 也可用于其他具有串擾問題的光譜分析, 具有較高的使用拓展性。