王健敏, 李雪梅, 馬士超, 李志勇, 唐華東, 馬鳳森*

1. 浙江工業(yè)大學(xué)前沿交叉科學(xué)研究院, 浙江 杭州 310014

2. 浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 德清 313216

引 言

經(jīng)鼻遞送對于流感或新冠疫苗等的針對呼吸系統(tǒng)病毒感染的預(yù)防具有重要應(yīng)用價值[1-2], 鼻腔給藥時高度血管化和相對容易滲透的表面, 可繞過胃腸道的酸和酶降解以及肝臟首過代謝, 鼻黏膜的良好血液循環(huán)使藥物吸收迅速, 可產(chǎn)生快速的局部作用或全身作用[3], 使得鼻腔途徑給藥成為注射和口服等傳統(tǒng)給藥方式的很好補充和備選, 近年來已越來越受到人們的關(guān)注。

藥物經(jīng)鼻給藥時, 必須面臨黏膜上皮存在的復(fù)雜的黏液屏障。 黏液是復(fù)雜的生物聚合物屏障, 其主要功能包括潤滑上皮, 維持水合層, 與底層上皮交換氣體和營養(yǎng)物質(zhì), 以及作為病原體和異物的屏障。 粘蛋白是該屏障的主要功能成分, 可通過二硫鍵形成高密度粘蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu), 平均孔徑在200～300 nm, 允許水、 氣體、 營養(yǎng)物質(zhì)等小分子通過, 但同時也可減少分子和顆粒的滲透以及擴散速率, 因此當(dāng)藥物制劑大于網(wǎng)孔時易發(fā)生空間位阻效應(yīng)[4]。 此外, 藥物制劑與粘蛋白的分子間相互作用也是影響藥物在黏液中擴散的因素, 該作用受多種因素影響, 如制劑所帶電荷、 親疏水性等。 鑒于黏液的保護與清除異物功能, 研究外物分子在其中的擴散具有生理病理學(xué)和生物藥劑學(xué)意義, 是藥物制劑設(shè)計時需要考量的藥物能否有效進入黏膜的重要因素。 然而, 在體方法研究藥物在鼻黏液中的滲透與轉(zhuǎn)運過程較為繁瑣, 受干擾因素多[5], 難以對其進行量化分析, 迫切需要建立有效的體外評價方法對鼻黏膜制劑進行處方工藝優(yōu)化與生物藥劑學(xué)評價。

非破壞性的、 無需標(biāo)記、 可實時提供與藥物結(jié)構(gòu)相關(guān)數(shù)據(jù)的衰減全反射傅里葉變換紅外光譜(attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy, ATR-FTIR)技術(shù), 早已成功應(yīng)用于物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析研究[6], 但尚未見以此作為物質(zhì)在黏液中的滲透性評價的報導(dǎo)。 為在體外探究藥物制劑的不同表面性質(zhì)對其黏液滲透性的影響, 本工作探索采用該技術(shù)對所制備的不同性質(zhì)(即粒徑與電荷)的脂質(zhì)體的黏液滲透性進行檢測, 并通過分析粘蛋白酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)所包含的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、 β折疊、 β-轉(zhuǎn)角、 無規(guī)則卷曲)信息, 對不同性質(zhì)脂質(zhì)體與粘蛋白的相互作用進行研究, 分析建立適用于藥物制劑黏液滲透性評價的非在體方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

78HW-1恒溫數(shù)顯磁力攪拌器(杭州儀表電機廠), LDB-M 微量注射泵(定山儀器廠), JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司), Nano ZS90納米粒徑電位分析儀(馬爾文儀器有限公司), LE-1膜擠出器(楚業(yè)生物科技有限公司), ZF-Ⅰ紫外分光光度計(上海顧村光電儀器廠), NicoletTMiS50傅里葉變換紅外光譜儀(Thermo Fisher 公司), Transwell小室(NEST 公司)。

大豆卵磷脂(湖北健文生物有限公司), 膽固醇(上海伯奧生物科技有限公司), 牛血清白蛋白(北京索萊寶科技有限公司), 粘蛋白(北京謹明生物科技有限公司), 聚乙二醇10000(polyethylene glycol 10000, PEG10000, 上海展云化工有限公司), 殼聚糖(上海藍季生物), 海藻酸鈉(溫州吉象化學(xué)股份有限公司), 無水乙醇(杭州雙林化工試劑廠)。

1.2 方法

1.2.1 ATR-FTIR光譜法定量測定方法學(xué)的建立

(1)光譜采集

在ZnSe的液體衰減全反射樣品池中分別加入PEG10000、 殼聚糖、 海藻酸鈉溶液, 使用配備有水平ATR晶體(ZnSe, 45°)的NicoletTMiS50 FTIR掃除背景后, 在波數(shù)4 000～400 cm-1內(nèi)掃描并采集紅外光譜數(shù)據(jù), 掃描次數(shù)為32次, 儀器的分辨率是4 cm-1。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取PEG配制成1%～20%, 殼聚糖配制成0.1%～1.0%, 海藻酸鈉配制成0.1%～1.0%(均為w/v)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)液, 按光譜采集方法測定其吸光度。

(3)重復(fù)性考察

取同一批溶液6份, 按上述方法測定含量, 計算指定峰面積, 得到其RSD值。

(4)精密度考察

吸取同一供試品溶液, 重復(fù)掃描5次, 測定指定峰面積, 計算其RSD值。

(5)脂質(zhì)體的制備

包載牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的脂質(zhì)體納米粒采用乙醇注入法[7]制備, 將其以恒定流速分別注入 4%(w/v)PEG10000、 0.4%(w/v)殼聚糖、 0.4%(w/v)海藻酸鈉溶液中, 孵育30 min實現(xiàn)后修飾。 不同粒徑PEG脂質(zhì)體通過改變膽固醇與大豆卵磷脂質(zhì)量之比、 超聲時間、 PEG濃度以及水相與有機相體積之比來制備。

(6)脂質(zhì)體表征

用納米粒度分析儀測定不同電荷與粒徑脂質(zhì)體的粒徑分布及Zeta電位; 采用超速離心結(jié)合考馬斯亮藍法測定脂質(zhì)體包封率。

(7)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0.01、 0.02、 0.03、 0.04、 0.05、 0.06 mg·mL-1系列BSA溶液, 準(zhǔn)確吸取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)液, 加入5 mL考馬斯亮藍溶液, 在595 nm波長處測定吸光值, 以蛋白濃度對吸光度進行回歸分析。

1.2.2 不同粒徑與電荷脂質(zhì)體滲透性測定

(1)ATR-FTIR法

以粘蛋白配制的模擬鼻黏液[8]為背景掃描后, 加入150 μL供試品溶液, 在一定時間點下對樣品進行掃描, 收集其FTIR譜圖, 計算不同粒徑PEG脂質(zhì)體和不同電荷脂質(zhì)體的黏液滲透性。 以表觀滲透系數(shù)(Papp, cm·s-1)衡量, 計算公式如式(1)

(1)

式(1)中, dQ/dt是脂質(zhì)體的擴散速率;c0為脂質(zhì)體的初始濃度;A為滲透面積(cm2)。

(2)Transwell法

在12-Transwell板的受體室各添加1.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1, pH 7.4), 將 50 μL模擬鼻黏液均勻鋪在聚碳酸酯膜上, 分別添加測試樣品到各自供體室后, 35 ℃孵育, 定時從受體室中取出等分試樣, 并用等體積的緩沖液替換, 對每個收集的樣品進行測定, 計算其表觀滲透系數(shù)[9], 判斷脂質(zhì)體的跨黏液層運輸。

(3)不同電荷脂質(zhì)體與粘蛋白溶液相互作用

將粘蛋白溶液添加到ATR-FTIR光譜儀的ZnSe晶體池, 而后將等體積的不同處方脂質(zhì)體添加至粘蛋白溶液中。 孵育30 min后, 記錄ATR-FTIR光譜。 未處理的粘蛋白作為陰性對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 特征峰選擇

如圖1所示, PEG10000、 殼聚糖和海藻酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的ATR-FTIR光譜圖中, 分別在1 080、 1 048和1 049 cm-1出現(xiàn)一個明顯的單峰, 并且隨濃度變化最為明顯, 故選擇這三個單峰作為特征峰。

圖1 (a)不同濃度PEG10000紅外光譜圖; (b)不同濃度殼聚糖紅外光譜圖; (c)不同濃度海藻酸鈉紅外光譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

如圖2所示, 分別以PEG10000、 殼聚糖、 海藻酸鈉濃度為橫坐標(biāo)(X), 所對應(yīng)的紅外特征峰吸收峰面積為縱坐標(biāo)(Y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 得到回歸方程分別為:Y=2.386 6X+2.154,R2=0.991 6;Y=1.130 14X+0.060 9,R2=0.997 4;Y=1.870 3X+0.278 9,R2=0.992 7。 表明PEG10000、 殼聚糖、 海藻酸鈉分別在2%～20%(w/v), 0.1%～1.0%(w/v), 0.1%～1.0%(w/v)的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2.2 重復(fù)性考察

PEG脂質(zhì)體、 殼聚糖脂質(zhì)體、 海藻酸鈉脂質(zhì)體的供試品溶液的峰面積RSD值分別為0.83%、 0.97%、 0.88%, 表明該方法的重復(fù)性較好。

2.2.3 精密度考察

結(jié)果表明, 6次測定的PEG脂質(zhì)體、 殼聚糖脂質(zhì)體、 海藻酸鈉脂質(zhì)體的特征峰峰面積RSD 值分別為0.62%、 0.73%、 0.95%, 表明該方法的精密性很好。

2.3 脂質(zhì)體的表征

2.3.1 不同粒徑與電荷脂質(zhì)體的表征

不同粒徑脂質(zhì)體的表征結(jié)果見表1。

表1 不同粒徑 PEG 脂質(zhì)體的表征(n=3)

不同電荷脂質(zhì)體表征結(jié)果見表2。

表2 不同電荷脂質(zhì)體的表征(n=3)

由表1和表2可知, 不同電荷與粒徑脂質(zhì)體大多粒徑分布較為均勻[多分散系數(shù)(polydiseperse Index, PDI)<0.3], 電荷的變化、 脂質(zhì)體滲透的FTIR譜圖(見下文)與不同脂質(zhì)體特征峰的對應(yīng)說明了不同脂質(zhì)體表面的成功修飾[10-11]。

2.4 包封率

2.4.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以BSA濃度c為橫坐標(biāo), 吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到標(biāo)準(zhǔn)線方程:Y=6.177 1X-0.002 2,R2=0.997 6, 結(jié)果表明, BSA在0.01～0.06 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 脂質(zhì)體包封率

不同粒徑和電荷脂質(zhì)體包封率見圖3。

圖3 (a) 不同粒徑PEG脂質(zhì)體的包封率; (b) 不同電荷脂質(zhì)體的包封率

由圖3(a)知, 不同粒徑脂質(zhì)體中69 nm的PEG脂質(zhì)體包封率最低, 是由于較小的粒徑顯著限制了其藥物有效載荷承載能力; 由圖3(b)知殼聚糖脂質(zhì)體包封率高于PEG脂質(zhì)體和海藻酸鈉脂質(zhì)體, 可能的原因是由于脂質(zhì)體表面電荷的影響, 殼聚糖和BSA之間的靜電吸引力, 使得藥物滲漏減小, 而海藻酸鈉與BSA所帶電荷相反, 由于靜電排斥, 使得藥物從脂質(zhì)體中滲漏, 故其包封率低于殼聚糖和PEG 脂質(zhì)體[11-12]。

2.5 不同粒徑與電荷脂質(zhì)體黏液滲透性測定

2.5.1 ATR-FTIR法

2.5.1.1 不同粒徑PEG脂質(zhì)體黏液滲透性測定

如圖4所示為不同粒徑脂質(zhì)體添加到黏液層后, 獲得的不同時間點下PEG脂質(zhì)體的ATR-FTIR光譜。

圖4 不同粒徑PEG脂質(zhì)體在黏液中不同時間點的ATR-FTIR圖譜

如圖4所示, 當(dāng)與黏液接觸時, 隨著脂質(zhì)體滲透并到達ZnSe界面, FTIR 光譜出現(xiàn)強度逐漸增加的樣品吸收帶。 可以初步看出, 隨著粒徑的增大, PEG 脂質(zhì)體的ATR-FTIR在1 080 cm-1處吸收強度逐漸減小, 說明PEG脂質(zhì)體滲透至ATR的ZnSe表面的量逐漸減少, 可能是由于黏液的孔徑對大粒徑脂質(zhì)體的排阻作用。 不同粒徑PEG脂質(zhì)體的滲透系數(shù)見圖8(a)。

2.5.1.2 不同電荷脂質(zhì)體黏液滲透性測定

由圖5可知, 不同電荷脂質(zhì)體中, 近中性電荷脂質(zhì)體黏液滲透性最高, 正電荷脂質(zhì)體黏液滲透性最低。 由于PEG脂質(zhì)體為電中性, 其與黏液的相互作用最小, 而海藻酸鈉脂質(zhì)體與殼聚糖脂質(zhì)體會由于其所帶的—COOH基團(前者)及與粘蛋白中帶負電荷的唾液酸殘基發(fā)生靜電相互作用(后者)[13], 因而二者黏液滲透性低于PEG化脂質(zhì)體。 不同電荷脂質(zhì)體的滲透系數(shù)見圖8(b)。

圖5 不同電荷脂質(zhì)體在黏液中不同時間點的ATR-FTIR圖譜

2.5.1.3 不同電荷脂質(zhì)體與粘蛋白相互作用測定

圖6 (a) 不同電荷脂質(zhì)體處理的粘蛋白的ATR-FTIR的Y偏移堆積線圖; (b) 不同電荷脂質(zhì)體處理后的粘蛋白的酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶面積之比

ATR-FTIR已被證明對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)尤其敏感, 是獲取有關(guān)蛋白質(zhì)構(gòu)象信息的強大技術(shù)之一。 酰胺Ⅰ帶對于研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)最有價值, 該振動頻率受α-螺旋、 β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的影響[19]。 利用Origin 2022b對粘蛋白與不同脂質(zhì)體作用前后的酰胺Ⅰ帶進行二階求導(dǎo)和Gaussian去卷積化處理, 其結(jié)果如圖7所示, 根據(jù)積分面積計算粘蛋白二級結(jié)構(gòu)各組分的相對百分含量, 見表3。

表3 不同電荷脂質(zhì)體處理粘蛋白后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量

圖7 不同電荷脂質(zhì)體處理后的粘蛋白的酰胺Ⅰ帶的高斯曲線擬合譜圖

2.5.2 ATR與Transwell方法比較

如圖8所示, ATR-FTIR和Transwell均可對不同粒徑與電荷脂質(zhì)體的黏液滲透性進行測定, 不同的是, 后者所得出的信息較為局限, 而前者可實時進行測定, 操作簡便, 并且能夠檢測出脂質(zhì)體與粘蛋白之間相互作用的微小變化, 進而對納米粒滲透黏液的機制進行闡述。

圖8 (a) 一系列不同粒徑PEG脂質(zhì)體分別用ATR-FTIR和Transwell法測得的Papp比較;(b) 不同電荷脂質(zhì)體分別用ATR-FTIR和Transwell法測得的Papp比較

2.6 討論

脂質(zhì)納米粒在藥物和疫苗的體內(nèi)遞送中具有重要應(yīng)用價值。 經(jīng)表面修飾的脂質(zhì)體在藥物體內(nèi)遞送中具有延長半衰期、 增加靶向性、 提高藥效等作用, 因而受到廣泛重視[22]。 建立了一種針對不同性質(zhì)脂質(zhì)體的鼻黏液滲透性的體外評價方法, 即利用ATR-FTIR 在不同時間點對生物基質(zhì)(即粘蛋白)進行掃描, 得到基質(zhì)內(nèi)藥物制劑的一系列譜圖, 根據(jù)藥物制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、 譜圖中藥物特征紅外吸收峰的強弱判斷藥物制劑在粘蛋白中的滲透性。 為進一步評估該方法的有效性, 將ATR-FTIR光譜分析與基于Transwell 室的檢測分析對同一納米藥物的跨黏液轉(zhuǎn)運進行對比, 證明了ATR-FTIR在體外評價藥物在黏液中滲透性的可行性。 同時, 利用ATR-FTIR初步探索了藥物滲透黏液的原理: 通過粘蛋白的微小結(jié)構(gòu)變化, 即其二級結(jié)構(gòu)變化, 檢測并分析藥物制劑與生物基質(zhì)所發(fā)生的相互作用, 闡明了不同性質(zhì)脂質(zhì)體黏液滲透性強弱的機制。

鼻黏液的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能阻礙了顆粒和分子在粘膜中的運輸, 是藥物通過鼻黏膜上皮進行治療遞送的關(guān)鍵瓶頸。 目前, 用于體外評價鼻黏膜制劑的黏液滲透性有多種方法。 分別為Transwell法[9]、 細胞模型法[22]、 多粒子示蹤技術(shù)(multiple particle tracking, MPT)[23]等, Transwell法優(yōu)點在于操作簡便, 普適性強, 但是獲得的信息較為單一, 對進一步的研究具有局限性; 細胞模型法可用于評價不同藥物的黏液滲透性, 但操作繁瑣、 細胞培養(yǎng)周期長, 目前體外細胞模型有: Caco-2、 EpiAirway、 犬腎細胞(madin-darby canine kidney cells, MDCK)、 人類原代鼻上皮細胞等。 但是并非所有細胞模型都適用于經(jīng)鼻給藥的滲透性研究, 如MDCK細胞模型與Caco-2、 EpiAirway相比, 其跨膜電阻(trans epithelial electric resistance, TEER)較高, 細胞連接致密, 這將限制藥物經(jīng)細胞旁路途徑的吸收, 該模型較適合用于血腦-屏障的研究, 并且, Caco-2腸細胞系是唯一獲得FDA批準(zhǔn)的評估藥物吸收的體外預(yù)測模型, 但是Caco-2細胞起源于結(jié)腸, 不存在粘液層, 并且腸道與鼻屏障在形態(tài)和生理等方面均有較大的差異性, 故對于評價鼻黏膜制劑的黏液滲透性而言, 選擇合適的細胞極其重要; MPT法可以動態(tài)檢測顆粒在生物基質(zhì)中的運動與相互作用, 但需要對藥物進行染色或者標(biāo)記, 在一定程度上可能改變了藥物結(jié)構(gòu), 對其造成影響, 并且亦無法對藥物的滲透機制進行具體的說明。 本工作利用藥物制劑的結(jié)構(gòu)特點與ATR-FTIR相結(jié)合, 既可定量檢測藥物在黏液中的滲透, 又可對藥物滲透的機制進行分析和解釋, 可為后續(xù)實驗的方向選擇和方案調(diào)整提供指導(dǎo)。

3 結(jié) 論

建立的基于ATR-FTIR的體外評價鼻黏膜制劑的黏液滲透性方法, 與其他方法相比, 不需要對藥物進行標(biāo)記, 因此不會對藥物制劑結(jié)構(gòu)造成影響, 簡單可靠, 可實時進行檢測, 并藉此可獲得更豐富的分子間相互作用信息。 除脂質(zhì)體等脂質(zhì)納米粒外, 本方法也可用于其他鼻黏膜制劑的黏液滲透性評價, 如微球、 納米乳、 納米凝膠等多種制劑(另文發(fā)表); 經(jīng)適應(yīng)性改進后, 還可用于藥物制劑在其他黏液例如口腔黏液、 下消化道黏液和生殖腔道黏液中的滲透性評價, 應(yīng)用前景廣闊。