楊承恩, 李 萌, 王天賜, 王金玲, 李雨婷, 蘇 玲

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心, 吉林 長(zhǎng)春 130118

2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130118

3. 長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)學(xué)系, 吉林 長(zhǎng)春 130504

4. 國(guó)藥一心制藥有限公司質(zhì)檢部, 吉林 長(zhǎng)春 130600

引 言

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)又名黑澀石楠、 不老莓, 屬薔薇科植物, 是我國(guó)新引進(jìn)的小漿果果樹(shù), 引進(jìn)后在我國(guó)黑龍江、 吉林、 遼寧等東北地區(qū)最先種植, 并逐步發(fā)展為我國(guó)最大的黑果腺肋花楸種植基地, 河北、 河南等省也已形成了規(guī)?；N植基地[1-2]。 黑果腺肋花楸果實(shí)富含多酚、 花青素、 多糖、 黃酮等活性成分, 其中花青素含量尤為突出, 遠(yuǎn)高于葡萄、 黑枸杞、 藍(lán)莓等高花青素植物, 具有抗氧化、 防治心血管疾病、 降血糖、 抗血小板凝集等多種生物活性[3]。 國(guó)家衛(wèi)健委于2018年9月12日發(fā)布公告, 批準(zhǔn)黑果腺肋花楸進(jìn)入新食品原料名單, 也加速了黑果腺肋花楸深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 目前已開(kāi)發(fā)的黑果腺肋花楸產(chǎn)品包括酒類(lèi)、 飲料、 功能食品、 化妝品等60余種。 深加工產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大, 使得對(duì)黑果腺肋花楸原料的需求量及品質(zhì)要求越來(lái)越高。 研究表明, 不同種植地區(qū)的溫度、 土壤等氣候及環(huán)境條件的差異, 導(dǎo)致黑果腺肋花楸果實(shí)多酚、 黃酮、 多糖等主要成分含量差異顯著, 果品品質(zhì)參差不齊[4-6]。 為加強(qiáng)對(duì)黑果腺肋花楸果品的規(guī)范、 有序管理, 打造具有地區(qū)特色的品牌, 需要建立可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、 快速、 低成本的黑果腺肋花楸果實(shí)產(chǎn)地鑒別方法。

當(dāng)前國(guó)外研究者主要開(kāi)展了黑果腺肋花楸果實(shí)及其次級(jí)代謝物臨床試驗(yàn)研究工作及其酚類(lèi)化合物在食品、 化妝品中作為添加劑的應(yīng)用, 國(guó)內(nèi)開(kāi)展黑果腺肋花楸果實(shí)的研究起步相對(duì)較晚, 近年來(lái)采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法鑒定黑果腺肋花楸果實(shí)花青素成分, 并通過(guò)DPPH、 ABTS及總抗氧化離實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黑果腺肋花楸果實(shí)的抗氧化活性差異, 但國(guó)內(nèi)外都尚未開(kāi)展黑果腺肋花楸果實(shí)產(chǎn)地鑒別的研究工作。 傅里葉變換紅外光譜(Fourier translation infrared spectroscopy, FTIR)具有操作簡(jiǎn)便、 樣本需求少、 價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn), 適用于有機(jī)物快速分析[7]。 研究證實(shí), 將紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)作物種類(lèi)、 產(chǎn)地的快速、 準(zhǔn)確鑒別。 陳文靜等人采用紅外光譜對(duì)12座茶山的古樹(shù)曬青茶進(jìn)行鑒別研究, 發(fā)現(xiàn)不同茶山茶葉間具有一定差異[8]; 李嘉儀等基于紅外光譜技術(shù)結(jié)合Fisher判別分析方法, 建立不同產(chǎn)地茯苓塊識(shí)別模型, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)茯苓塊產(chǎn)地的快速無(wú)損鑒別[9]; 安淑靜等采用紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立山茱萸產(chǎn)地鑒別模型, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)7個(gè)省份山茱萸的準(zhǔn)確高效鑒別[10]。

本研究將中紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合, 采集15個(gè)產(chǎn)地共750份黑果腺肋花楸果實(shí)樣品的紅外光譜數(shù)據(jù), 采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 建立可快速、 準(zhǔn)確識(shí)別黑果腺肋花楸產(chǎn)地的鑒別方法, 為黑果腺肋花楸產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

收集黑龍江省七臺(tái)河、 伊春、 雙鴨山、 佳木斯等4市; 吉林省白山、 蛟河、 通化、 延邊朝鮮族自治州等4市、 州; 遼寧省鞍山、 大連、 丹東、 錦州等4市; 河北省秦皇島市、 河南省安陽(yáng)市以及俄羅斯等15個(gè)地區(qū)的黑果腺肋花楸果實(shí), 每個(gè)地區(qū)樣品50份, 共750份。

主要設(shè)備: Nicolet is10 傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo scientific), HY-12型壓片機(jī)(天津天光光學(xué)儀器有限公司), DKZ恒溫水浴鍋(上海一恒技術(shù)有限公司), 8453紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Agilent), CS-700型超帥高速多功能粉碎機(jī)(浙江武義海納電器有限公司), 200目不銹鋼篩等。

1.2 紅外光譜數(shù)據(jù)

黑果腺肋花楸果實(shí)冷凍干燥、 粉碎、 過(guò)200目篩。 分別精密稱(chēng)取1.8 mg樣品, 加入190 mg溴化鉀于75 ℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥, 研磨均勻, 壓片, 掃描樣品400～4 000 cm-1間紅外光譜, 設(shè)定分辨率4 cm-1, 掃描次數(shù)16, 重復(fù)3次取平均光譜。 光譜采集過(guò)程中, 保持室內(nèi)溫度25 ℃, 濕度35% RH。

1.3 樣品劃分與光譜預(yù)處理

采用K-S檢驗(yàn)法(kennard-stone, K-S), 對(duì)符合樣本分布規(guī)律并具有代表性的訓(xùn)練集光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行劃分[11]。 由于樣品、 光散射及基線漂移等因素, 采集的光譜信息出現(xiàn)的隨機(jī)偏差需經(jīng)過(guò)光譜預(yù)處理方法進(jìn)行修正。 在與原始光譜對(duì)比的基礎(chǔ)上, 使用The Unscrambler X 10.4軟件對(duì)采集的原始光譜進(jìn)行多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)、 標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variable transformation, SNV)、 移動(dòng)平滑(smoothing, SG)、 一階導(dǎo)數(shù)(first derivative, FD)、 二階導(dǎo)數(shù)(second derivative, SD)等處理。

1.4 主成分分析

主成分分析(principal component analysis, PCA)是統(tǒng)計(jì)分析法中的一種重要方法, 通過(guò)線性變換將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為一組各維度線性無(wú)關(guān)的特征成分, 可用于提取數(shù)據(jù)的主要特征分量, 進(jìn)行聚類(lèi)分析的算法。

1.5 光譜特征信息提取

1.5.1 競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)采樣法

競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)采樣法(competitive adapative reweighted sampling, CARS)是參照達(dá)爾文的“適者生存”理論, 結(jié)合PLS與蒙特卡洛采樣的光譜特征信息提取方法[12], 通過(guò)減去權(quán)重小的波長(zhǎng)點(diǎn), 保留絕對(duì)值大的波長(zhǎng)點(diǎn), 找出交互驗(yàn)證均方根誤差(root mean square error of cross validation, RMSECV)最低的子集, 選出最優(yōu)變量組合。

1.5.2 連續(xù)投影算法

連續(xù)投影算法(successive projections algorithm, SPA)是采用矢量空間共線性最小化原則的光譜特征波長(zhǎng)篩選算法, 可以從冗長(zhǎng)的光譜數(shù)據(jù)中提取出既具有代表性又冗余信息含量最少的特征波長(zhǎng)。

1.6 模型構(gòu)建

1.6.1 支持向量機(jī)

支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)是光譜定量與定性分析的常用方法[13]。 該方法通過(guò)把數(shù)據(jù)從低維度映射到高維度特征空間, 再通過(guò)線性與非線性映射關(guān)系構(gòu)造一個(gè)N維超平面來(lái)解決數(shù)據(jù)分析問(wèn)題。

1.6.2 隨機(jī)森林

隨機(jī)森林(random forest, RF)是一種具有集成思想的分類(lèi)與預(yù)測(cè)算法[14]。 將每一個(gè)單獨(dú)的決策樹(shù)匯集成決策森林, 從而產(chǎn)生“好而不同”的個(gè)體學(xué)習(xí)器, 并在保持準(zhǔn)確性和多樣性方面做出最優(yōu)的分類(lèi)與預(yù)測(cè)選擇。

1.6.3 極限學(xué)習(xí)機(jī)

極限學(xué)習(xí)機(jī)(extreme learning machine, ELM)是基于經(jīng)典神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)改進(jìn)后的快速學(xué)習(xí)算法[15]。 在訓(xùn)練階段采用隨機(jī)的輸入層權(quán)值和偏差, 能夠以極快的速度進(jìn)行較好泛化工作, 具有選擇參數(shù)少、 學(xué)習(xí)效果好、 適用性強(qiáng)的特點(diǎn)。

1.6.4 偏最小二乘-判別分析

偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)是多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)中的判別分析法, PLS經(jīng)常用來(lái)處理分類(lèi)和判別問(wèn)題, 并以PCA為理論基礎(chǔ)在自變量存在多重相關(guān)性的條件下進(jìn)行分類(lèi)或回歸建模。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1 黑果腺肋花楸原始光譜

2.2 樣品劃分

根據(jù)K-S法按照訓(xùn)練集和測(cè)試集樣品數(shù)量比例4∶1, 劃分750份樣品, 得訓(xùn)練集樣品600個(gè), 測(cè)試集樣品150個(gè)。

2.3 預(yù)處理方法對(duì)比與歸一化

采用SVM對(duì)不同預(yù)處理方法獲得的紅外數(shù)據(jù)進(jìn)行建模對(duì)比, 獲得黑果腺肋花楸果實(shí)產(chǎn)地模型識(shí)別結(jié)果如表1, 并使用PCA對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)和MSC光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析對(duì)比, 如圖2(a, b)。 經(jīng)預(yù)處理優(yōu)化后, 光譜數(shù)據(jù)識(shí)別效果均高于84%, 明顯優(yōu)于未處理光譜數(shù)據(jù)模型的識(shí)別效果。 其中, MSC模型識(shí)別效果最佳, 訓(xùn)練集識(shí)別率與測(cè)試集識(shí)別率均為93.33%, 能夠有效對(duì)不同產(chǎn)地黑果腺肋花楸果實(shí)進(jìn)行鑒別。 同時(shí), 對(duì)比原始光譜數(shù)據(jù)和MSC光譜數(shù)據(jù)的PCA聚類(lèi)效果, 發(fā)現(xiàn)MSC預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)聚類(lèi)效果更好, 故將MSC預(yù)處理后的光譜作為樣品最優(yōu)預(yù)處理光譜。 將MSC光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行映射范圍為0～1的歸一化處理, 見(jiàn)圖3。

表1 光譜預(yù)處理方法對(duì)比

圖2 PCA聚類(lèi)可視化的結(jié)果

圖3 歸一化后的黑果腺肋花楸光譜數(shù)據(jù)

2.4 光譜特征信息提取

2.4.1 CARS分析

通過(guò)Matlab2014b軟件對(duì)歸一化后光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行CARS算法的特征波長(zhǎng)篩選, 蒙特卡羅采樣次數(shù)設(shè)置為100次, 波長(zhǎng)篩選結(jié)果如圖4。 圖4(a)為選擇波長(zhǎng)過(guò)程中的變量變化過(guò)程, 當(dāng)運(yùn)行次數(shù)在1～54次之間, 特征波長(zhǎng)數(shù)量迅速下降, 在54～100次之間下降緩慢。 圖4(b)為特征波長(zhǎng)選擇中RMSECV的變化趨勢(shì), 可知在第54次時(shí)篩選時(shí)RMSECV值為最低。 圖4(c)中各線表示隨著運(yùn)行次數(shù)增加各波長(zhǎng)變量回歸系數(shù)的趨勢(shì), 紅線所對(duì)應(yīng)位置為RMSECV值最小即第54次采樣。 遵循RMSECW值最小原則, 選擇第54次采樣獲得的91個(gè)波長(zhǎng)變量子集為最優(yōu)波長(zhǎng)變量數(shù)。

圖4 CARS算法篩選特征波長(zhǎng)的過(guò)程

2.4.2 SPA分析

通過(guò)Matlab2014b軟件對(duì)歸一化后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行SPA降維, 設(shè)定波長(zhǎng)數(shù)為1～30, 計(jì)算不同特征波長(zhǎng)數(shù)下的均方根誤差, 如圖5。 由圖5(a)經(jīng)過(guò)迭代后, 可知均方根誤差最小值為1.5602, 最終選取16個(gè)波長(zhǎng)數(shù)作為最優(yōu)波長(zhǎng)數(shù)。 光譜選取波長(zhǎng)變量如圖5(b)所示。 這16個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的特征波長(zhǎng)分別為7、 12、 580、 820、 1 067、 1 201、 1 600、 2 275、 2 409、 2 576、 2 649、 2 732、 4 517、 5 240、 6 247和6 721 cm-1。

圖5 SPA算法篩選特征波長(zhǎng)的過(guò)程

2.5 建模結(jié)果及建模方法對(duì)比

將歸一化后的MSC全段光譜(full spectrum, FS)與經(jīng)CARS、 SPA降維后的紅外光譜數(shù)據(jù)作為輸入變量, 建立RF、 ELM、 SVM、 PLS-DA的不同產(chǎn)地黑果腺肋花楸果實(shí)識(shí)別模型, 結(jié)果見(jiàn)表2和圖6(a, b)。

圖6 最優(yōu)模型識(shí)別結(jié)果

由表2可知, 在RF模型中當(dāng)決策樹(shù)棵樹(shù)為4324時(shí)SPA-RF識(shí)別效果最佳, 其訓(xùn)練集識(shí)別率為100%, 測(cè)試集識(shí)別率為99.33%, 僅有一個(gè)樣品發(fā)生錯(cuò)誤識(shí)別。 在ELM模型中SPA-ELM識(shí)別效果最佳, 其訓(xùn)練集識(shí)別率為99.5%, 有3個(gè)樣本識(shí)別錯(cuò)誤, 測(cè)試集識(shí)別率為100%。 在SVM模型中測(cè)試集識(shí)別率均為100%, 但FS-SVM訓(xùn)練集識(shí)別率僅為99.33%稍低于CARS-SVM與SPA-SVM訓(xùn)練集識(shí)別率。 在PLS-DA模型中PLS-DA-SPA模型識(shí)別效果最佳, 其訓(xùn)練集識(shí)別率為99.67%, 有2個(gè)樣本識(shí)別錯(cuò)誤, 測(cè)試集識(shí)別率為100%。

綜合比較模型識(shí)別率和建模速度, 可知CARS-SVM和SPA-SVM識(shí)別效果最佳, 訓(xùn)練集與測(cè)試集識(shí)別率均為100%, 但SPA-SVM建模數(shù)據(jù)僅需16個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn), 低于CARS-SVM建模數(shù)據(jù)的91個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn), 因此選擇c=2.824、g=2, RBF核函數(shù)時(shí)的SPA-SVM作為最優(yōu)識(shí)別模型。

3 結(jié) 論

采用中紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法, 提出一種對(duì)不同產(chǎn)地黑果腺肋花楸果實(shí)快速鑒別的方法。

紅外光譜數(shù)據(jù)經(jīng)不同方法預(yù)處理后, 結(jié)合SVM建模, 確定MSC光譜預(yù)處理方法效果最佳, MSC-SVM模型訓(xùn)練集識(shí)別率為93.33%, 測(cè)試集識(shí)別率為92.67%, 能有效減少光譜采集過(guò)程中的隨機(jī)偏差。

歸一化后的光譜數(shù)據(jù), 再經(jīng)CARS和SPA光譜特征信息提取后, 結(jié)合RF、 ELM、 SVM、 PLS-DA建模都有良好的識(shí)別效果, 測(cè)試集和訓(xùn)練集識(shí)別率均高于97.33%。 其中CARS-SVM、 SPA-SVM模型識(shí)別效果最佳, 測(cè)試集和訓(xùn)練集識(shí)別率均為100%, 但從模型識(shí)別率和建模速度, 選擇僅需16個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)的SPA-SVM模型為最佳模型。

中紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法, 特別是SVM模型能夠更準(zhǔn)確地鑒別不同產(chǎn)地的黑果腺肋花楸果實(shí), 此方法可為其他種類(lèi)的小漿果產(chǎn)品來(lái)源鑒別提供參考。