劉思彤, 黃朝鶴, 羅美玉, 王 楨, 陳虹錚, 張鈺婕, 裴曉靜

北京工商大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院, 北京 100048

引 言

簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和CRISPR-associated (Cas)系統(tǒng)是在大多數(shù)細(xì)菌和古菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)[1-3]。 按照Cas蛋白組成, CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為兩類: Class 1和Class 2, 根據(jù)Cas蛋白的結(jié)構(gòu)和序列又可分為不同亞型, Class 1是由多亞基組成的多蛋白效應(yīng)復(fù)合物, 包括Ⅰ、 Ⅲ和Ⅳ型。 Class 2是單個效應(yīng)蛋白, 包括了Ⅱ型中的Cas9、 Ⅴ型的Cas12a和Ⅵ型的Cas13a等(圖1)。 其中, Cas9具有核酸內(nèi)切酶活性, 兩個酶切活性結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC, 在兩種RNA的引導(dǎo)下, 對含有原間隔序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)的目標(biāo)雙鏈DNA(dsDNA)進(jìn)行特異性識別并切割[4]。 Jennifer Doudna等將兩種RNA整合為單向?qū)gRNA, 使其便于使用[5-6]。 與Cas9不同, Ⅴ型的Cas12a具有類似RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域, 特異性別目標(biāo)雙鏈DNA(dsDNA)后會激活反式切割活性(Trans-cleavage activity), 繼續(xù)非特異切割其他單鏈DNA(ssDNA)或RNA[7]。 Ⅵ型的Cas13(Cas13a、 Cas13b 和Cas13c)包含HEPN結(jié)構(gòu)域, 具有核糖核酸酶活性, 特異性識別靶標(biāo)RNA后會非特異性切割周圍的RNA。 近年來, CRISPR-Cas系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域中, Cas9對核酸的特異性識別作用使其成為理想的核酸檢測工具, 結(jié)合核酸擴(kuò)增法和特定的信號傳感方式, 如熒光法, 可以實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測。 Cas12、 13和14的反式切割活性為核酸分子診斷提供了更多的可能性, 當(dāng)這類Cas蛋白在gRNA的引導(dǎo)下與靶序列結(jié)合后, 形成三元復(fù)合物激發(fā)非特異性切割活性, 可以降解體系中存在的任何單鏈DNA或RNA, 當(dāng)帶有熒光團(tuán)和猝滅基團(tuán)的短鏈DNA或RNA加入體系時, Cas蛋白對靶序列進(jìn)行識別并切割報告探針, 使熒光團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)而使熒光恢復(fù)[8-12]。 CRISPR-Cas系統(tǒng)已與一系列信號讀出方式結(jié)合設(shè)計了多種生物傳感器, 用于不同靶標(biāo)的分析檢測, 廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個領(lǐng)域。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)

基于CRISPR-Cas的生物傳感器能夠以多種形式進(jìn)行信號輸出, 其中光學(xué)信號傳感扮演了重要的角色。 光學(xué)信號傳感根據(jù)物質(zhì)吸收或發(fā)射的電磁波而建立起來的一類分析化學(xué)方法, 目前研究報道的CRISPR-Cas系統(tǒng)的光學(xué)信號傳感包括熒光、 比色、 化學(xué)發(fā)光法等。 結(jié)合本研究進(jìn)展, 主要闡述當(dāng)前CRISPR-Cas系統(tǒng)生物傳感器的光學(xué)信號傳感方式的原理及特點(diǎn), 總結(jié)了不同類型光學(xué)檢測策略的探針分析性能, 如表1, 助力CRSPR-Cas系統(tǒng)在生物安全檢測以及生物學(xué)研究等領(lǐng)域發(fā)揮更大的優(yōu)勢和作用。

表1 不同類型光學(xué)檢測策略探針分析性能比較

1 熒光信號傳感策略

熒光分析方法是根據(jù)熒光團(tuán)的光致發(fā)光特性所建立的傳感方法, 具有靈敏度高、 操作簡單、 分析速度快、 選擇性好等優(yōu)勢, 能夠提供激發(fā)光譜、 發(fā)射光譜、 發(fā)光壽命、 量子產(chǎn)率和各向異性等諸多信息。 熒光信號讀出方式已廣泛應(yīng)用于CRISPR-Cas系統(tǒng)中, 包含了熒光強(qiáng)度信號和熒光數(shù)字信號。 熒光強(qiáng)度表示一段時間內(nèi)大量熒光分子的平均行為, 是一種模擬信號的系綜平均檢測模式, 待測物質(zhì)越多, 熒光強(qiáng)度信號越強(qiáng)。 但是, 這種模擬信號的檢測模式使單個生物分子的行為平均化, 無法對單個信號源或分子進(jìn)行系統(tǒng)研究。 熒光數(shù)字信號通過統(tǒng)計信號源的數(shù)量與目標(biāo)物的濃度或質(zhì)量之間建立聯(lián)系, 基于信號有無開關(guān)統(tǒng)計信號數(shù)量, 即檢測體積內(nèi)含有超過泊松噪音極限數(shù)量的分子, 進(jìn)而將分析物的濃度以數(shù)量的形式表達(dá)出來。

熒光團(tuán)標(biāo)記的ssDNA與可猝滅熒光的物質(zhì)組合形成熒光信號開關(guān)來設(shè)計熒光強(qiáng)度信號探針。 Sun等使用MOF結(jié)構(gòu)(UiO66)開發(fā)了一種SDA-RCA擴(kuò)增方法, 用于大腸桿菌的熒光檢測[20]。 熒光染料可與dsDNA特異性結(jié)合, 如溴化乙錠和SYBR Green I等, 結(jié)合到dsDNA骨架上, 與游離在溶液中相比, 其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。 Huang等利用SYBR Green I進(jìn)行非共價DNA結(jié)合, 建立了CRISPR-Cas9誘導(dǎo)指數(shù)擴(kuò)增方法(CAS-EXPAR), 結(jié)合實(shí)時熒光強(qiáng)度分析, CAS-EXPAR可在1 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)靈敏的DNA檢測[21]。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(F?rster resonance energy transfer, fluorescence resonance energy transfer, FRET)是指當(dāng)一個熒光分子(供體)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊時, 供體發(fā)射的熒光能激發(fā)受體發(fā)出熒光, 同時供體的熒光強(qiáng)度減弱。 FRET與供、 受體分子的空間距離緊密相關(guān), 一般為7～10 nm時即可發(fā)生FRET, 隨著距離延長, FRET呈明顯減弱[22-23]。 基于Cas12a、 Cas13和Cas14系統(tǒng)反式切割活性的熒光報告探針多采用FRET原理而設(shè)計, 即在探針的兩端分別修飾熒光團(tuán)和猝滅基團(tuán)[24], 靶標(biāo)激活Cas蛋白反式切割活性后, 對熒光報告探針進(jìn)行非特異性切割, 熒光恢復(fù), 熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)濃度呈正比[25]。

單鏈熒光報告探針, 即ssDNA或ssRNA熒光報告探針, 具有構(gòu)造簡單, 易于設(shè)計和可控性高等優(yōu)點(diǎn)。 Wang等利用Cas12a的反式切割活性, 以熒光ssDNA報告(HEX-N12-BHQ1)為探針, 開發(fā)了一小時低成本多用途高效檢測系統(tǒng)HOLMES(an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system)可用于目標(biāo)DNA和RNA的快速檢測[26]。 在HOLMES中, Cas12a和crRNA組成的二元復(fù)合物會與靶標(biāo)DNA結(jié)合, 激活反式切割活性, 非特異性切割系統(tǒng)中ssDNA熒光報告探針, 使熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)距離變遠(yuǎn), 進(jìn)而熒光恢復(fù)。 通過測定熒光強(qiáng)度, 可最低檢測0.1 nmol·L-1靶標(biāo); 結(jié)合PCR, 檢測限可降低至10 amol·L-1。

單鏈熒光報告探針與CRISPR的結(jié)合應(yīng)用已非常廣泛, 但是基于雙鏈熒光報告探針卻鮮有報道。 Mehmet V Yigit等證明了激活的CRISPR-Cas12a不但可以對ssDNA進(jìn)行非特異性切割, 也可以對雙鏈進(jìn)行非特異性切割[27], 依此設(shè)計了基于Cas12a反式切割活性的雙鏈熒光報告探針(如圖2)。 通過改變發(fā)光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)之間距離, 通過測定熒光強(qiáng)度信號比較Cas12a對于不同的dsDNA探針的反式切割情況, 證明了無論是否帶有經(jīng)典ssDNA片段(TTATT)缺口, Cas12a均可非特異性切割dsDNA, 且不帶有缺口的dsDNA探針具有較低的背景和更快的熒光恢復(fù)率優(yōu)點(diǎn)[如圖2(b, c)]。

圖2 CRISPR-Cas12a切割雙鏈熒光報告分子示意圖[27]

圖3 (a) 不同熒光探針的背景熒光值; (b) 目標(biāo)物濃度在10 nmol·L-1時的熒光恢復(fù)率; (c) 熒光切割速率; (d) Cas12a檢測不同熒光探針終點(diǎn)熒光比率的熱圖比較, 目標(biāo)物分別為1 nmol·L-1, 100 pmol·L-1和0, t=4 000 s

富含鳥嘌呤(Guanine)的DNA序列能夠通過Hoogsteen氫鍵折疊成G四鏈體結(jié)構(gòu)(G-quadruplexes)。 在G四鏈體結(jié)構(gòu)兩端修飾熒光團(tuán)和猝滅基團(tuán), 可用作CRISPR反式切割的熒光探針[28]。 Li等分別在人端粒G四鏈體((TTAGGG)4)的5’端和3’端標(biāo)記FAM和TAMRA, 證明了Cas12a能夠非特異性切割G四結(jié)構(gòu), 通過FRET, CD、 凝膠電泳和NMR等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證, 為推進(jìn)CRISPR-Cas12a系統(tǒng)和G四鏈體熒光報告探針在生物傳感和生物化學(xué)中的應(yīng)用提供了新途徑。 由于G四鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高, 需要較長時間(長達(dá)幾個小時)才能裂解。 G三鏈體(G-triplex)由富含三段連續(xù)G堿基的富G核酸序列組裝而成, 與G四鏈體具有相似的生物學(xué)功能。 進(jìn)一步研究了Cas12a對G三鏈體探針的反式切割活性, 證明了Cas12a在10 min內(nèi)就可以對G3結(jié)構(gòu)進(jìn)行反式切割, 且其切割速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于G4結(jié)構(gòu)[15]。 基于此設(shè)計Cas12a 和G三鏈體熒光生物傳感器, 對未擴(kuò)增和擴(kuò)增的HPV16的檢測靈敏度分別為50 pmol·L-1和0.1 amol·L-1, 比基于ssDNA熒光報告探針的Cas12a檢測系統(tǒng)提高了20倍。

分子信標(biāo)(molecular beacon, MB)是一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈, 特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使其具有背景信號低、 靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)勢, 已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)中, 但較少用于CRISPR系統(tǒng)的熒光分析檢測中。 以Cas12a為例, 設(shè)計了不同類型的分子信標(biāo), 將MB與ssDNA、 dsDNA熒光報告探針進(jìn)行了對比, 證明了Cas12a的反式切割不僅限于ssDNA、 dsDNA, 還可以擴(kuò)展到MB[16]。 在相同的實(shí)驗(yàn)條件下, 四種不同長度的ssDNA熒光報告探針(長度分別為5、 8、 12和15 nt)最低可以檢測到100 pmol·L-1的靶標(biāo); 四種dsDNA熒光報告探針, 最低可以檢測到100 pmol·L-1, 而MB熒光報告探針, 靈敏度可以提高至 20 pmol·L-1。 在優(yōu)化了反應(yīng)條件(包含F(xiàn)RET對、 反應(yīng)溫度、 報告探針濃度以及Cas12a 與crRNA濃度的比例)之后, 發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Texas Red和BHQ2的MB熒光報告探針在無擴(kuò)增的情況下, 最低可以檢測到100 fmol·L-1靶標(biāo), 比ssDNA和dsDNA熒光報告探針靈敏度提高了3個數(shù)量級, 依此開發(fā)了一種高靈敏度的SARS-CoV-2檢測方法, 選取SARS-CoV-2基因組圖譜中13 328～13 437的ORF1a基因作為模型靶點(diǎn), 以冠狀病毒GX/P2V代替SARS-CoV-2進(jìn)行實(shí)際樣品檢測, 檢測限低至27 copies·mL-1, 在臨床分子診斷中具有巨大應(yīng)用前景。

上述熒光強(qiáng)度信號是一種模擬信號的系綜平均的檢測模式, 熒光數(shù)字信號是將反應(yīng)體系等量的分裝成上萬個微反應(yīng)單元, 每一份可能是pL至fL數(shù)量級的體積, 每個微反應(yīng)單元中包含的分子數(shù)服從泊松分布, 每個微反應(yīng)單元內(nèi)的目標(biāo)分子進(jìn)行單獨(dú)的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生熒光亮點(diǎn)信號, 在顯微鏡下對熒光亮點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計, 實(shí)現(xiàn)定量檢測。 目前CRISPR-Cas分子診斷仍然需要單獨(dú)的預(yù)擴(kuò)增步驟, 由此產(chǎn)生的多步驟擴(kuò)增和分析方法使其難以進(jìn)行熒光數(shù)字檢測。

Park等報道了熒光數(shù)字化信號讀出的CRISPR/Cas一鍋法(digitization-enhanced CRISPR/Cas-assisted one-pot virus detection, deCOViD), 并用于SARS-CoV-2檢測中[30]。 利用商用微流控數(shù)字芯片, 將RT-RPA預(yù)擴(kuò)增的Cas12a反應(yīng)分散到0.7 nL反應(yīng)小孔中, 將靶標(biāo)RNA通過RT-RPA擴(kuò)增成DNA, 激活Cas12a-crRNA的反式切割活性, 繼續(xù)切割ssDNA熒光報告探針產(chǎn)生熒光, 在反應(yīng)小孔內(nèi)每個拷貝的靶標(biāo)快速擴(kuò)增產(chǎn)生信號, deCOViD具有高信號背景比、 寬動態(tài)范圍和高靈敏度, 可以實(shí)現(xiàn)15 min內(nèi)定性檢測, 30 min內(nèi)定量檢測, 為推進(jìn) CRISPR/Cas 輔助核酸檢測和對抗COVID-19大流行及其他疾病開辟了新途徑。 Liu提出了一種數(shù)字化熱啟動CRISPR(dWS CRISPR)分析方法, 用于靈敏定量檢測SARS-CoV-2[31]。 他們利用商用QuantStudio 3D數(shù)字芯片, 將dWS-CRISPR反應(yīng)混合物分散到0.7 nL的反應(yīng)小孔中, SARS-CoV-2 RNA靶標(biāo)在每個反應(yīng)微孔發(fā)生dWS-CRISPR反應(yīng), 在52 ℃孵育時產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光(陽性點(diǎn)), 而沒有靶標(biāo)的反應(yīng)微孔不產(chǎn)生(陰性點(diǎn))。 dWS CRISPR在50～55 ℃時有效啟動, 從而防止在室溫下過早的靶點(diǎn)擴(kuò)增, 并實(shí)現(xiàn)核酸的精確數(shù)字量化, dWS-CRISPR與之前相比, 可以無需提取RNA直接檢測熱處理后唾液樣本中的SARS-CoV-2。

基于芯片的數(shù)字化檢測模式可以實(shí)現(xiàn)高靈敏多重檢測, 在傳染性病原體常規(guī)監(jiān)測和綜合診斷具有重要應(yīng)用價值, Ackerman等利用數(shù)字化Cas13發(fā)展了一種大規(guī)模多重核酸檢測方法(CARMEN)[32], 打破了上述兩種數(shù)字化CRISPR只能進(jìn)行單一目標(biāo)物診斷的弊端。 該微孔陣列芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成, 具有大量微孔, 每個核酸樣本通過RPA或PCR擴(kuò)增, 并與特定熒光編碼結(jié)合實(shí)現(xiàn)信號讀出, 能夠在單個陣列上對超過4 500個靶標(biāo)進(jìn)行穩(wěn)定測試, 同時區(qū)分169種人類相關(guān)病毒, 可用于病原體高通量檢測。

相比其他光學(xué)檢測方法, 熒光信號傳感方式具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn), 也在向著更便攜, 更簡單的方向發(fā)展。 但與此同時, 它仍然需要專業(yè)的光學(xué)儀器的協(xié)助和專業(yè)人員的操作才可以完成檢測。

2 比色信號傳感策略

比色法通過貴金屬納米顆粒聚集前后吸收光譜的變化來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的測定, 它最大的優(yōu)勢在于可以實(shí)現(xiàn)裸眼檢測, 對儀器設(shè)備要求低, 適用于非專業(yè)條件下的快速定性與半定量檢測。

Yuan等利用Cas12a/crRNA對dsDNA特異性識別和Cas13a/crRNA對RNA的特異性識別, 分別激活其反式切割ssDNA和ssRNA的性質(zhì), 產(chǎn)生DNA功能化的 AuNPs聚集, 溶液顏色改變實(shí)現(xiàn)裸眼檢測[17]。 同年, Raffaele Velotta采用SARS-CoV-2誘導(dǎo)AuNPs相互作用的比色生物傳感器用于檢測鼻咽拭子中病毒顆粒[33]。 當(dāng)含有病毒粒子的溶液混合時, 攜帶SARS-CoV-2的三種表面蛋白的抗體功能化的金納米粒子的消光譜在幾分鐘內(nèi)發(fā)生紅移, 檢測限接近實(shí)時熒光PCR。

相對于上述需要進(jìn)行擴(kuò)增的比色信號傳感器, Choi課題組在2021年開發(fā)了基于CRISPR-Cas12a的無核酸擴(kuò)增的熒光和比色雙模式生物傳感器, 他們利用DNA功能化金納米顆粒通過金屬增強(qiáng)熒光(MEF)原理檢測游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)。 當(dāng)cfDNA激活CRISPR-Cas12a復(fù)合體后, 非特異性切割A(yù)uNPs和熒光團(tuán)之間的ssDNA, 金納米顆粒發(fā)生顏色從紫色到紅紫色的變化[34]。 在該研究中, 作者引入了兩個大小不同的AuNPs(20和60 nm), 并且由一個7 nm長的dsDNA和一個9 nm長的ssDNA連接, 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記在dsDNA一端, 由于距離接近60 nm 的AuNPs而保持猝滅狀態(tài)。 有靶標(biāo)存在時, 激活了Cas12a的反式切割活性, 將兩金納米之間的連接鏈切斷, FITC遠(yuǎn)離60 nm的AuNPs依然與20 nm的AuNPs保持連接, 由熒光恢復(fù)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庠鰪?qiáng)狀態(tài), 溶液顏色由紫色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色, 通過裸眼定性檢測, 通過熒光信號實(shí)現(xiàn)定量檢測, 無需進(jìn)行核酸擴(kuò)增, 檢測限可以達(dá)到飛摩爾濃度級別。

不同縱橫比的金納米棒(GNR)具有獨(dú)特的橫向表面等離子體共振(TSPR)和縱向表面等離子體共振(LSPR)模式, 表現(xiàn)出不同的顏色。 這些特性使得GNR在顯色反應(yīng)中具有良好的顯色性能。 Xu課題組利用轉(zhuǎn)化酶-葡萄糖氧化酶級聯(lián)反應(yīng)引起GNR變色和Fenton反應(yīng)讀出信號[35]。 靶標(biāo)DNA在 crRNA引導(dǎo)下激活 Cas12a系統(tǒng)的反式切割活性, 切斷了功能磁珠和轉(zhuǎn)化酶之間的ssDNA, 磁分離后上清液中釋放的轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行級聯(lián)反應(yīng)催化蔗糖水解, 生成的葡萄糖立即被GOx氧化生成H2O2。 在酸性環(huán)境下, H2O2通過Fe2+誘導(dǎo)的Fenton反應(yīng)迅速轉(zhuǎn)化為活性中間體(·OH)。 ·OH主要沿縱軸方向刻蝕GNR, 所產(chǎn)生的長徑比明顯變化, 從而改變?nèi)芤侯伾?因此最終的顏色可以有效地與目標(biāo)DNA的濃度相關(guān)聯(lián), 并且可以通過裸眼輕易地區(qū)分出來。 更重要的是, LSPR位移的峰值波長可用于紫外-可見分光光度法對目標(biāo)DNA的半定量檢測, 在重組酶輔助擴(kuò)增(recombinase-aided amplification)后, 對目標(biāo)DNA靈敏度達(dá)1 amol·L-1, 與熒光報告探針的靈敏度相當(dāng)。

比色檢測可將目標(biāo)物識別事件轉(zhuǎn)變?yōu)轭伾兓? 具有操作簡單、 肉眼可見和不需要昂貴或復(fù)雜的儀器等優(yōu)勢, 并逐步向一體化、 高靈敏方向發(fā)展。

3 側(cè)流層析檢測策略

側(cè)流層析法(lateral flow dipstick, LFD)是檢測病原體、 小分子、 癌癥和基因分型最常用的方法之一, 研究者將CRISPR-Cas系統(tǒng)與側(cè)流層析試紙結(jié)合, 已發(fā)展出多種簡單便攜的生物傳感器[36-40], 因其技術(shù)成熟, 操作簡便, 適用于居家核酸或者抗原檢測產(chǎn)品開發(fā), 具有極其廣泛的應(yīng)用前景。

側(cè)流層析試紙條一般由樣品墊、 結(jié)合墊、 硝酸纖維素膜和吸附墊組成, 由于試紙條的毛細(xì)作用, 將待測樣品滴到樣品墊后, 樣品將隨液體在試紙條上向前移動。 在結(jié)合墊處靶標(biāo)樣本和顯色物質(zhì), 如納米金標(biāo)記的抗體結(jié)合形成復(fù)合物繼續(xù)向前移動。 當(dāng)復(fù)合物移動至抗體標(biāo)記的檢測線處, 抗原和抗體特異性結(jié)合, 檢測線顯色, 表明待測靶標(biāo)存在; 繼續(xù)向前移動, 顯色物質(zhì)標(biāo)記的抗體和對照線處的抗體特異性結(jié)合, 對照線顯色, 表明側(cè)流試層析紙條正常工作。 若檢測線顯色而對照線不顯色或檢測線對照線均不顯色, 則檢測結(jié)果無效。 若檢測線和對照線均顯色, 則檢測結(jié)果為陽性; 如檢測線不顯色, 對照線顯色, 則檢測結(jié)果為陰性。

AuNPs-LF(gold nanoparticles-based lateral-Flow, AuNP-LF)檢測是一種快速發(fā)展的技術(shù), 它利用AuNPs作為免疫反應(yīng)的信號報告探針。 與其他報告標(biāo)簽探針相比, AuNPs具有良好的生物相容性和較小的生物毒性, 在體外和體內(nèi)診斷方面具有極大的優(yōu)勢。 迄今為止, AuNP-LF檢測已被廣泛用于檢測各種目標(biāo)物, 包括感染性病毒、 蛋白質(zhì)、 藥物和其他病原體[41]。 Benjamin等發(fā)展了一種half-strip形式的側(cè)流層析試紙條, 即不使用樣品墊和結(jié)合墊, 將樣本和納米金納米顆粒標(biāo)記的抗體混合, 而后插入硝酸纖維素膜和吸附墊組裝而成的試紙條直接檢測[42]。 該方法檢測SARS-CoV-2 N蛋白的檢測限為0.65 ng·mL-1。 Xie等利用核殼結(jié)構(gòu)磁性量子點(diǎn)標(biāo)簽構(gòu)建了一種雙模式熒光側(cè)流層析檢測方法, 可以同時檢測SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白[43]。 磁性量子點(diǎn)標(biāo)簽不僅可以高靈敏顯色, 而且可以富集病毒顆粒, 該方法全程檢測時間為10 min, 靶向SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白的檢測限分別為1和0.5 pg·mL-1檢測限有了很大的提高。 Garrit等在側(cè)流層析試紙條檢測的基礎(chǔ)上, 采用同步輻射X射線熒光成像(synchrotron X-ray fluorescence imaging)技術(shù)讀取檢測結(jié)果, 檢測限較普通的肉眼讀取方式提高100倍[44]。

與上述不同的是, 納米硒納米粒子(SeNPs)作為LFIAs(lateral flow immunochromatographic assay)的定性探針, 具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性, 與膠體金相比, 硒納米粒價格更低廉。 Ma課題組提出了一種基于納米硒顆粒修飾的SARS-CoV-2核蛋白的側(cè)流層析免疫檢測試劑盒, 該試劑盒可以檢測人血清中抗SARS-CoV-2 IgM和抗SARS-CoV-2 IgG, 結(jié)果可在10 min內(nèi)裸眼讀取[45]。 多種信號讀出方式的聯(lián)合使用可以將檢測效率大大提高。

基于側(cè)流層析試紙條檢測方法在檢測速度和檢測成本方面具有很大的優(yōu)勢, 其操作簡單, 快捷高效, 安全可靠。 2018年, 張鋒團(tuán)隊(duì)開發(fā)了基于Cas13的分子診斷技術(shù)(specific high-sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing, SHERLOCK)[46], 利用Cas13a對RNA特異性識別后反式切割熒光團(tuán)和猝滅基團(tuán)修飾ssRNA探針, 利用熒光強(qiáng)度信號實(shí)現(xiàn)對多種病毒RNA的定性檢測。 該團(tuán)隊(duì)通過加入Csm6開發(fā)了SHERLOCK v2[19], 將檢測靈敏度提高了3.5倍, 通過不同顏色的熒光報告探針, 實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)檢測。 通過商業(yè)化的試紙條, 裸眼直接觀察顏色來判讀結(jié)果, 且不需要特殊儀器。 ssDNA兩端修飾FAM和生物素, 無靶標(biāo)時, ssDNA沒有被切斷, ssDNA的FAM端與抗FAM抗體修飾的金納米結(jié)合后流向C線, ssDNA的biotin端與C線的鏈霉親和素結(jié)合, 無法到達(dá)Test線, 無信號。 當(dāng)有靶標(biāo)存在時, CRISPR/CrRNA的激活反式切割活性被激活, 非特異性切割ssDNA, 切斷后的ssDNA的FAM端與抗FAM抗體修飾的金納米結(jié)合后流過C線后, 無法被固定, 繼續(xù)流向T 線, 顯示信號。 部分ssDNA未被切斷, ssDNA的FAM端與抗FAM抗體修飾的金納米結(jié)合后流向C線, ssDNA的biotin端與C 線的鏈霉親和素結(jié)合, 作為對照。 2020年初, 該團(tuán)隊(duì)將CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術(shù)用于新型冠狀病毒檢測, 以側(cè)流層析試紙條信號讀出, 開發(fā)了SHERLOCKTM CRISPR SARS-CoV-2 檢測試劑盒, 在1h內(nèi)完成檢測, 適合居家新冠病毒核酸大規(guī)模初篩檢測。

側(cè)流層析試紙條信號傳感方式綜合了色譜優(yōu)異的分離能力和傳統(tǒng)免疫分析的高特異性和高靈敏性的優(yōu)點(diǎn), 已成為現(xiàn)場即時檢測的一種重要工具。 采用目視法讀取定性或半定量結(jié)果, 檢測靈敏度和準(zhǔn)確度顯然不能滿足當(dāng)下對分析物高靈敏定量檢測的要求。

現(xiàn)今血糖儀和智能手機(jī)幾乎是每個家庭必備的設(shè)備, 運(yùn)用血糖儀或者智能手機(jī)進(jìn)行檢測或者信號的讀出無疑是一種非常方便的選擇。 Ning等報道了一種RT-RPA CRISPR 的熒光檢測系統(tǒng), 可以精確地量化唾液中存在的SARS-CoV-2, 而無需分離RNA, 并將該檢測方法應(yīng)用于智能手機(jī)讀取芯片, 用于即時使用, 并評估了其分析性能, 智能手機(jī)讀取的CRISPR-FDS分析結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果之間的一致, 適用于超靈敏的現(xiàn)場COVID-19篩查工作[47]。 Pimkhuan Hannanta-anan課題組介紹了一種基于智能手機(jī)設(shè)備以及機(jī)器學(xué)習(xí)軟件[48]。 該設(shè)備由一個3D打印外殼和低成本的光學(xué)組件組成, 可以激發(fā)熒光報告探針, 并選擇性地將熒光信號傳輸?shù)街悄苁謾C(jī)上實(shí)現(xiàn)信號讀出。 凝膠電泳分析也可以用于CRISPR-Cas的終點(diǎn)信號讀出, Mehmet V Yigit等利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hybridization chain reaction, HCR)與Cas12a結(jié)合, 以煙草卷梢病毒(TCSV)和乙型肝炎病毒(HepBV)為模型靶標(biāo), Cas12a識別靶標(biāo)后激活反式切割活性, 切割了體系中的引物鏈, 使得HCR無法進(jìn)行, 從凝膠電泳上無法看到HCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 利用凝膠電泳終點(diǎn)讀出, 凝膠顯示引物的條帶強(qiáng)度隨著目標(biāo)量的增加而降低, 靈敏度達(dá)1.5 fmol, 比單純的HCR靈敏度提高了100倍[49]。

4 總結(jié)與展望

CRISPR-Cas系統(tǒng)研究正在逐步改變著傳統(tǒng)的基因編輯和分子診斷模式, CRISPR-Cas技術(shù)具有簡單、 特異、 靈敏的特點(diǎn), 可與多種技術(shù)相結(jié)合。 基于本課題組的研究進(jìn)展, 總結(jié)了CRISPR-Cas系統(tǒng)構(gòu)建的光學(xué)傳感器的信號傳感方式原理及特點(diǎn), 并介紹了當(dāng)前各課題組的研究進(jìn)展。 隨著科技的發(fā)展, 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)信號讀出正向智能化、 便攜式方向發(fā)展。 目前絕大多數(shù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的分析檢測依賴預(yù)擴(kuò)增過程, 如何利用信號讀出的方式擺脫預(yù)擴(kuò)增步驟, 簡化操作是未來的發(fā)展方向之一。 高靈敏高通量的檢測在新冠病毒等病原體感染性疾病的大規(guī)模初篩具有重要意義, 如何利用CRISPR-Cas系統(tǒng)的順、 反式切割活性設(shè)計信號讀出, 實(shí)現(xiàn)高靈敏高通量的檢測也是分析化學(xué)追求的目標(biāo)之一。