董曉鳴 劉雨軒 紀(jì)力旸 王靜,2 張勁松

1沈陽愛爾卓越眼科醫(yī)院 愛爾集團(tuán)眼科醫(yī)院集團(tuán)白內(nèi)障與人工晶狀體研究所 沈陽愛爾眼科精準(zhǔn)醫(yī)療研究所 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科 中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 遼寧省晶狀體研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽 110000;2中南大學(xué)愛爾眼科學(xué)院,長沙 410000

白內(nèi)障是世界上首要的致盲眼病,全球范圍內(nèi)有2 000萬人因白內(nèi)障而致盲,年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)是其中常見的一類,占比達(dá)50%以上[1]。房水的成分、晶狀體囊的通透性、代謝紊亂等多種原因都可引起晶狀體蛋白變性,導(dǎo)致晶狀體混濁[2]。目前普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷所致的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)凋亡是除先天性白內(nèi)障以外其他所有類型白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)正常LECs中p53的mRNA及蛋白表達(dá)水平低,而在ARC的LECs中呈高表達(dá),miRNA-125b靶向p53促進(jìn)LECs凋亡,導(dǎo)致晶狀體發(fā)生混濁,表明p53在ARC的發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)控作用[3]。p53作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,是氧化應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡的重要分子[4-5]。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)在眼部疾病中起著重要的調(diào)節(jié)作用,與LECs的增殖、遷移、分化、凋亡和晶體蛋白修飾密切相關(guān)[6-9]。2010年,Huarte等[10]在p53缺失型和野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞DNA損傷模型中通過lncRNAs高通量篩選首次克隆出一種與p53表達(dá)密切相關(guān)的lncRNA,lncRNA-p21。p53可直接結(jié)合于lncRNA-p21的上游調(diào)控區(qū),并正向調(diào)控lncRNA-p21轉(zhuǎn)錄水平。然而,關(guān)于lncRNA-p21在白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制研究報(bào)道較少見。本研究擬以人LECs系HLE-B3細(xì)胞為研究對象,通過過氧化氫誘導(dǎo)體外構(gòu)建氧化損傷模型,驗(yàn)證lncRNA-p21在ARC細(xì)胞模型中的表達(dá),明確其在增生凋亡、氧化應(yīng)激中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來源 人LECs系HLE-B3由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科晶狀體實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要試劑及儀器 總蛋白提取試劑盒(P0013B,上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司);PVDF膜(IPVH00010)、ECL發(fā)光液(WBKLS0100)(美國Millipore公司);兔抗Bax抗體(5023S)、兔抗Bcl-2抗體(3498T)(美國CST公司);鼠抗GAPDH抗體(TA-08,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗(31430)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(31460)(美國Thermo Fisher Scientific公司);細(xì)胞周期檢測試劑盒(BHCK004)(遼寧佰昊生物科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基(01-100-1ACS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(C3580-0500)(上海VivaCell公司);胰蛋白酶(03-050-1A)、胎牛血清(04-002-1A)(上海逍鵬生物科技有限公司);3%過氧化氫溶液(88497,瑞士Sigma公司);Caspase-3活性試劑盒(G015-1,南京建成科技有限公司);異丙醇(101636,成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司);氯仿(10006818)、多聚甲醛(80096618)(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇(868,沈陽瑞豐科技有限公司);RNAiso Plus裂解液(9108,日本TAKARA公司);GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)、GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒(A6001)(美國Promega公司);活性氧檢測試劑盒(S0033S)、EdU-555細(xì)胞增殖試劑盒(C0075S)、TritonX-100(ST795)(上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司);Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(BMS500FI,美國eBioscience公司);DAPI染色液(C0060)、抗熒光衰減封片劑(S2100)(北京索萊寶科技有限公司);熒光原位雜交試劑盒(Lnc1031589,廣州市銳博生物科技有限公司)。流式細(xì)胞儀(EC201827C1,美國Luminex公司);PCR儀(QuantStudioTM3,美國ABI公司);化學(xué)發(fā)光成像儀(Tanon 5200,上海天能生命科學(xué)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1MTS比色法檢測不同濃度過氧化氫處理細(xì)胞活力 收集對數(shù)生長期HEL-B3細(xì)胞于15 ml離心管中,1 000 r/min(離心半徑為7 cm)離心5 min,棄上清;PBS清洗,低速離心后用培養(yǎng)基重懸,制備單細(xì)胞懸液,按照1×104/孔接種至96孔板中,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔;置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h至細(xì)胞貼壁。分別更換0、25、50、100、200、400 μmol/L過氧化氫濃度的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μl MTS檢測試劑,于5% CO2、37 ℃條件下孵育0.5～1.0 h;于492 nm下讀取吸光度(absorbance,A)值。細(xì)胞活力=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白孔)/(A對照組-A空白孔)×100%。

1.2.2MTS比色法檢測200 μmol/L過氧化氫處理不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力 取單細(xì)胞懸液,按照1×104/孔接種至96孔板中,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔;置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h至細(xì)胞貼壁。更換200 μmol/L過氧化氫的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后測量吸光度A值并計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 取凍存的LECsHLE-B3,加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞分為正常對照組和過氧化氫組,過氧化氫組細(xì)胞用含200 μmol/L過氧化氫的培養(yǎng)基作用24 h,正常對照組細(xì)胞自然生長不做處理。

1.2.4DCFH-DA活性氧熒光探針法檢測各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平 參照活性氧檢測試劑盒說明,細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,用預(yù)溫的PBS洗滌細(xì)胞2次,加入現(xiàn)配的無血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA(終濃度10 μmol/L)200 μl,37 ℃孵育20 min。設(shè)置熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長為488 nm,檢測525 nm處A值,并計(jì)算各組相對正常對照組的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平。

1.2.5流式細(xì)胞法檢測各組細(xì)胞的凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞按照2×105/孔接種至6孔板中,1 ml每孔,分組處理細(xì)胞,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。另設(shè)置不加染色劑的細(xì)胞樣本作為陰性對照,再設(shè)置分別加Annexin V-FITC染液和PI染液的細(xì)胞樣本作為單染對照。培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,用PBS洗2次,1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞;加入200 μl Binding buffer制備單細(xì)胞懸液,每管加入5 μl Annexin V-FITC混勻后,室溫避光孵育10 min;用200 μl Binding buffer清洗細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,加入190 μl Binding buffer重懸細(xì)胞,加入10 μl PI染色液混勻,室溫下避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞百分比+晚期凋亡細(xì)胞百分比。

1.2.6Caspase-3活性試劑盒法檢測各組細(xì)胞中Caspase-3的活性 細(xì)胞分組培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PBS洗滌1次,低速離心,棄去上清;按照每2×106個(gè)細(xì)胞加入50 μl裂解液的比例添加裂解液,重懸并冰浴裂解30 min,期間渦旋振蕩3～4次,每次10 s;12 000 r/min 4 ℃離心10～15 min;小心吸取上清并轉(zhuǎn)移至新1.5 ml離心管中,并放置冰上待用。采用Bradford法測定蛋白濃度,吸取含100 μg蛋白的細(xì)胞上清,用裂解液補(bǔ)足至50 μl,加入5 μl Ac-DEVD-pNA后混勻;37 ℃孵育6 h后,測定405 nm下A值,即各組Caspase-3活性。

1.2.7Western blot法檢測各組細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞,利用蛋白快速提取試劑盒提取總蛋白,使用BCA法測定總蛋白濃度。利用SDS-PAGE電泳分離蛋白,并通過濕轉(zhuǎn)膜方式將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。取PVDF膜,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入Bax、Bcl-2或GAPDH一抗(均1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜,用TBST洗膜3次,每次10 min;加入相應(yīng)二抗(1∶10 000稀釋)室溫?fù)u床上孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min;ECL超敏顯色液顯色,采用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行拍照。采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參照,計(jì)算各組Bax和Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.8流式細(xì)胞法檢測各組細(xì)胞的周期分布 取對數(shù)生長期細(xì)胞,按照3×105/孔的密度接種至6孔板中進(jìn)行分組處理,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處理48 h后,收集細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清;加入1 ml PBS重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清;加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇,離心沉淀細(xì)胞,用100 μl PBS重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液逐滴加入70%乙醇中,輕輕吹打混勻,-20 ℃固定過夜;1 000 r/min低速離心5 min,棄上清,加入1 ml PBS室溫渦旋混勻1 min;1 000 r/min低速離心5 min,棄上清;每管分別加入475 μl PBS,25 μl的20×PI染色液,再加入1 μl RNaseA,混合均勻,室溫避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.9EDU實(shí)驗(yàn)法檢測HEL-B3細(xì)胞的增殖能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞,按照1×105/孔接種在含有專用細(xì)胞爬片的24孔板中,分組培養(yǎng),每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔。按照1∶500稀釋比例,配置2×EdU工作液;然后加入等體積37 ℃預(yù)熱的2×EdU工作液,孵育細(xì)胞2 h;4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min,PBS漂洗3次,每次5 min;配制Click反應(yīng)液(24孔板每孔量:Click Reaction Buffer 107.5 μl;CuSO45 μl;Azide 555 0.25 μl;Click Additive Solution 12.5 μl),室溫避光孵育30 min,PBS漂洗3次,每次5 min;DAPI復(fù)染核,PBS漂洗3次,每次5 min;應(yīng)用抗熒光淬滅劑封片,使用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.2.10實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測HEL-B3細(xì)胞lncRNA-p21表達(dá)水平 細(xì)胞分組培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。收集各組細(xì)胞,按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA并測定濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火及延伸60 s,共40個(gè)循環(huán)。lncRNA-p21正向引物為5'-GAGGGAGAGTTTTCACTG AATAGCC-3',反向引物為5'-GTAGTTTAGTCAAAA GTGCAGAGCG-3';GAPDH正向引物為5'-TCAAGGC TGAGAACGGGAAG-3',反向引物為5'-TGGACTCCACG ACGTACTCA-3'。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組lncRNA-p21相對表達(dá)量。

1.2.11熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)法檢測細(xì)胞中LncRNA-p21的定位 細(xì)胞分組培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取各組細(xì)胞,多聚甲醛固定1 h,PBS漂洗3次,每次5 min;滴加0.5% TritonX-100室溫孵育10 min,PBS漂洗3次,每次5 min;滴加20 μl預(yù)雜交液于樣本上,蓋膜后37 ℃孵育封閉30 min;將探針與雜交液按1∶39比例配制雜交反應(yīng)液,充分混勻,迅速置于冰上,滴加20～40 μl雜交反應(yīng)液于待測樣本上,蓋膜后73 ℃共變性5～8 min,快速轉(zhuǎn)移至37 ℃雜交過夜(16～20 h);甩凈殘液,放入蒸餾水中,浸泡5 min,53 ℃預(yù)熱的25%甲酰胺/2×SSC洗滌2次,每次5 min,42 ℃預(yù)熱的含0.1% TritonX-100/2×SSC洗滌2次,每次5 min,42 ℃預(yù)熱的0.5×SSC洗滌5 min,42 ℃預(yù)熱的0.2×SSC洗滌5 min;滴加10～20 μl DAPI避光染色10 min,PBS洗滌2次,每次5 min,避光晾干,滴加10～20 μl抗熒光衰減封片劑封片,于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 過氧化氫誘導(dǎo)人LECs氧化損傷模型的構(gòu)建

MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,空白對照組,25、50、100、200和400 μmol/L過氧化氫組細(xì)胞的存活率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=204.10,P<0.001),呈濃度依賴的下降趨勢,400 μmol/L過氧化氫組細(xì)胞活力顯著降低,將200 μmol/L作為本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度(表1)。200 μmol/L的過氧化氫處理細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)組細(xì)胞存活率總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.49,P<0.001),細(xì)胞的存活率呈時(shí)間依賴的下降趨勢,其中處理6、12、24和48 h組細(xì)胞的存活率均明顯低于未處理組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),以24 h作為本研究后續(xù)的處理時(shí)間(表2)。

表1 不同濃度的過氧化氫處理24 h HLE-B3細(xì)胞活力比較(x±s,%)Table 1 Comparison of HLE-B3 cell viability after 24-hour treatment with different concentrations of hydrogen peroxide (x±s,%)組別樣本量細(xì)胞活力空白對照組4100.0±0.025 μmol/L過氧化氫組490.0±6.4 a50 μmol/L過氧化氫組483.0±4.3 a100 μmol/L過氧化氫組474.5±8.6 a200 μmol/L過氧化氫組450.5±3.1a400 μmol/L過氧化氫組44.5±1.0 aF值204.10P值<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05(單因素方差分析,Dunnett檢驗(yàn)) Note:Compared with blank control group,aP<0.05 (One-way ANOVA,Dunnett test)

表2 200 μmol/L過氧化氫處理不同時(shí)間點(diǎn)HLE-B3細(xì)胞活力比較(x±s,%)Table 2 Comparison of HLE-B3 cell viability at different time points after 200 μmol/L hydrogen peroxide induction (x±s,%)組別樣本量細(xì)胞活力未處理組492.55±1.40處理6 h組479.28±8.39a處理12 h組468.35±4.38 a處理24 h組455.40±3.93 a處理48 h組446.50±5.94 aF值47.49P值<0.001 注:與未處理組相比較,aP<0.05(單因素方差分析,Dunnett檢驗(yàn)) Note:Compared with control group,aP<0.05 (One-way ANOVA,Dunnett test)

2.2 過氧化氫組和正常對照組細(xì)胞中ROS水平變化

正常對照組和過氧化氫組細(xì)胞中ROS含量分別為1.00±0.01和4.65±0.38,過氧化氫組細(xì)胞中ROS含量明顯高于正常對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.66,P<0.05)(圖1)。

圖1 過氧化氫組和正常對照組HLE-B3細(xì)胞中ROS水平比較 與正常對照組比較,aP<0.05 (獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) ROS:活性氧簇

2.3 過氧化氫組和正常對照組細(xì)胞中凋亡水平變化

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,過氧化氫組細(xì)胞凋亡染色較正常對照組明顯增多,正常對照組和過氧化氫組細(xì)胞凋亡率分別為(0.37±0.07)%和(64.86±5.39)%,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.69,P<0.05)(圖2A、B)。Caspase-3活性試劑盒檢測結(jié)果顯示,正常對照組和過氧化氫組Caspase-3的活性分別為0.026±0.001和0.070±0.002,與正常對照組相比,過氧化氫組Caspase-3的活性顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=39.80,P<0.05)(圖2C)。Western blot結(jié)果顯示,過氧化氫組Bax蛋白表達(dá)條帶強(qiáng)度較正常對照組明顯升高,正常對照組和過氧化氫組Bax蛋白相對表達(dá)量分別為0.59±0.07和1.19±0.04,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.73,P<0.05)(圖2D、E);過氧化氫組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量較正常對照組降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2F)。

圖2 過氧化氫組與正常對照組LECs凋亡水平比較 A:各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖 B:各組細(xì)胞凋亡率比較 與正常對照組相比,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);n=3) C:各組細(xì)胞Caspase-3的活性比較 與正常對照組比較,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);n=3) D:各組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)電泳圖 E、F:各組Bax和Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較 與正常對照組相比,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);n=3)

2.4 過氧化氫組和正常對照組細(xì)胞增殖的變化

與正常對照組相比,過氧化氫組G2期的LECs增多,正常對照組和過氧化氫組G2期細(xì)胞比例分別為(9.34±1.01)%和(33.73±1.53)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.10,P<0.05)(圖3A)。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過氧化氫組EDU陽性比例為(25.41±6.99)%,明顯低于正常對照組的(50.58±9.15)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.559,P<0.05)(圖3B)。

圖3 過氧化氫組和正常對照組LECs增殖能力比較 A:各組細(xì)胞周期流式細(xì)胞圖 B:各組細(xì)胞周期分布比較 與正常對照組相比,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);n=3) C:各組細(xì)胞EDU染色免疫熒光圖(EDU ×100,標(biāo)尺=200 μm) D:各組細(xì)胞EDU陽性細(xì)胞百分比比較 與正常對照組相比,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);n=9)

2.5 過氧化氫組和正常對照組lncRNA-p21的表達(dá)及細(xì)胞定位

過氧化氫組lncRNA-p21相對表達(dá)量為2.36±0.29,明顯高于正常對照組的1.02±0.02,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.893,P<0.05)(圖4A)。熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,lncRNA-p21定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖4B)。

圖4 過氧化氫組和正常對照組lncRNA-p21表達(dá)及細(xì)胞定位 A:與正常對照組相比,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);n=3) B:人晶狀體上皮細(xì)胞lncRNA-p21定位的熒光原位雜交圖(×200,標(biāo)尺=100 μm) lncRNA-p21呈紅色熒光(Cy3),細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI),lncRNA-p21定位于細(xì)胞質(zhì)

3 討論

隨著人口老齡化,白內(nèi)障發(fā)病率逐年升高,并嚴(yán)重影響國民眼健康水平與社會(huì)生產(chǎn)力能力。手術(shù)是目前治療白內(nèi)障唯一有效的方法,雖然白內(nèi)障手術(shù)設(shè)備及屈光性人工晶狀體在不斷更新?lián)Q代,但白內(nèi)障的藥物治療領(lǐng)域尚未取得突破性進(jìn)展[11-12]。因此,進(jìn)一步尋找切實(shí)可行的治療靶點(diǎn)以延緩和阻止ARC的發(fā)生和發(fā)展,具有重要及深遠(yuǎn)的意義。lncRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有生物學(xué)功能的非編碼RNA,其轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt,在進(jìn)化中高度保守,參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑及組蛋白修飾、可變剪接、分子海綿吸附miRNAs、蛋白質(zhì)的活性、定位及功能等功能[13-14]。然而,關(guān)于lncRNAs在白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展中生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道尚少[15]。Shen等[16]發(fā)現(xiàn)lncRNA MIAT是白內(nèi)障的特異性生物標(biāo)志物,并通過miRNA-150-5p/Akt參與調(diào)節(jié)LECs的功能,對細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖和凋亡有影響。此外,Cheng等[17]發(fā)現(xiàn),lncRNA H19在ARC患者的晶狀體中高表達(dá),敲除lncRNA H19可加重UVB輻射誘導(dǎo)的人LECs氧化損傷,降低細(xì)胞存活率和增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

2010年,Huarte等[9]在p53缺失型和野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞DNA損傷模型中通過lncRNAs高通量篩選首次克隆出一種與p53表達(dá)密切相關(guān)的長鏈非編碼RNA,lncRNA-p21,位于Ckdn1a(p21)基因座上,其編碼區(qū)位于兩條蛋白質(zhì)編碼基因之間,是5種lncRNAs亞型中的一種。p53可直接結(jié)合于lncRNA-p21的上游調(diào)控區(qū),并正向調(diào)控LncRNA-p21轉(zhuǎn)錄水平[18]。自lncRNA-p21的發(fā)現(xiàn),越來越多的研究表明,其與腫瘤明顯相關(guān),調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19-20]。Han等[21]研究證實(shí),lncRNA-p21通過miR130b/PTEN/AKT信號通路抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。Shen等[22]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA-p21低表達(dá)通過HIF-1/Akt/mTOR/P70S6K信號通路減少自噬,從而增加缺氧腫瘤細(xì)胞的放療敏感性。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)lncRNA-p21通過靶向β-連環(huán)蛋白信號通路增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的放療敏感性。Wang等[24]發(fā)現(xiàn),lncRNA-p21通過靶向β-catenin/Wnt信號通路,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性。

目前普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷所致的LECs凋亡是除先天性白內(nèi)障以外其他所有類型白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。細(xì)胞發(fā)生氧化損傷時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到干擾,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白/錯(cuò)誤折疊蛋白發(fā)生堆積,激活未折疊蛋白應(yīng)答,即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[25-26]。在本研究中,過氧化氫組HLE-B3細(xì)胞ROS含量顯著上升,同時(shí)細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)顯著增加,Bcl-2蛋白表達(dá)降低,凋亡蛋白Caspase-3的活性也顯著增強(qiáng)。本研究結(jié)果還顯示,過氧化氫組處于G2期的細(xì)胞百分比升高,表明細(xì)胞在G2期發(fā)生阻滯,最終抑制細(xì)胞增殖;過氧化氫組EDU陽性細(xì)胞比例明顯降低,說明HLE-B3細(xì)胞存活率降低,過氧化氫可誘導(dǎo)LECs損傷。

lncRNA發(fā)揮作用主要取決其細(xì)胞定位,在細(xì)胞核中,lncRNA能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,通常通過充當(dāng)支架來組裝大型染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物[27-28];在細(xì)胞質(zhì)中,lncRNA可以充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA),與其他RNA轉(zhuǎn)錄本競爭相同的miRNA,從而導(dǎo)致相互作用和后續(xù)調(diào)控[29-30]。本研究通過熒光原位雜交法發(fā)現(xiàn)lncRNA-p21定位于細(xì)胞質(zhì)中,推測其可能通過控制miRNA表達(dá)來影響其靶基因的表達(dá)量。然而本研究未驗(yàn)證lncRNA-p21敲減后對細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響,未來需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其因果關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明董曉鳴:研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集及分析/解釋、文章起草及修改;劉雨軒:研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集;紀(jì)力旸:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn);王靜:統(tǒng)計(jì)分析、指導(dǎo)研究;張勁松:直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱及定稿