楊萱 魏文斌

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 北京同仁眼科中心 眼內(nèi)腫瘤診治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市眼科學(xué)與視覺(jué)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 醫(yī)學(xué)人工智能研究與驗(yàn)證工信部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)是成年人常見(jiàn)的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤,具有惡性程度高、發(fā)病隱匿的特點(diǎn),嚴(yán)重威脅患者的視力乃至生命安全。UM起源于眼球壁的中間葡萄膜層,包括虹膜、睫狀體及脈絡(luò)膜,具有高度侵襲性,約50%的患者會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性UM[1-4]。目前,對(duì)于UM缺乏有效的治療手段,患者的預(yù)后和生存率較差,UM發(fā)生轉(zhuǎn)移后整體的生存時(shí)間為10～12個(gè)月[5-6]。因此,深入了解UM的分子機(jī)制,進(jìn)而確定更有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),對(duì)其早期臨床診斷、制定預(yù)防和治療策略具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種新型內(nèi)源性非編碼RNA,被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物中一類(lèi)穩(wěn)定的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物[7-8]。circRNA由“反向剪接”反應(yīng)產(chǎn)生,具有特征性的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu),并且在特定細(xì)胞類(lèi)型或發(fā)育階段中特異性表達(dá)[9-11]。circRNA具有選擇性保守的微小RNA(microRNA,miRNA)靶位點(diǎn),可以通過(guò)miRNA海綿調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[12]。近年來(lái)研究表明,circRNA具有保守性、穩(wěn)定性、豐富性以及動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn),使其成為新型臨床診斷與治療的重要靶點(diǎn)及標(biāo)志物;同時(shí),circRNA廣泛存在于膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中,是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[13]。目前,已有部分circRNA被發(fā)現(xiàn)可作為皮膚黑色素瘤的潛在靶標(biāo),如circ_0062270[14]等,但是circRNA在UM中的研究較匱乏。本課題組先前研究比較circRNA在UM組織和正常葡萄膜組織中的表達(dá)[15],探討了多個(gè)circRNA作為UM診斷與預(yù)后標(biāo)志物的可能,發(fā)現(xiàn)與正常葡萄膜組織相比,hsa_circ_0103232在UM組織中呈高表達(dá),表明hsa_circ_0103232有望成為UM治療新的潛在靶點(diǎn)。此外,Lin等[16]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0103232可能通過(guò)miR-661增強(qiáng)RAB3D的表達(dá)來(lái)促進(jìn)皮膚黑色素瘤(SKMel1、A375和A875)的進(jìn)展,進(jìn)一步提示了hsa_circ_0103232在黑色素瘤中的作用。但尚未見(jiàn)hsa_circ_0103232對(duì)UM細(xì)胞作用的研究報(bào)道。本研究旨在探討干擾hsa_circ_0103232對(duì)UM細(xì)胞C918和MUM2B增殖、遷移、周期和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及小干擾RNA來(lái)源 C918和MUM2B細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)庫(kù)。3個(gè)靶向hsa_circ_0103232的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(si-hsa_circ_0103232#1、si-hsa_circ_0103232#2、si-hsa_circ_0103232#3)及陰性對(duì)照(siCtrl)由湖州河馬生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.1.2主要試劑及儀器 胎牛血清(04-002-1A,以色列BI公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(42401042)、胰蛋白酶(25200-072)(美國(guó)Gibco公司);1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Trizol(Cat#15596018,美國(guó)Ambion公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Cat#G891,加拿大Abm公司);Primer Script RT 試劑盒[RR014A,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司];TransStart Tip Green qPCR SuperMix(AQ141-01,北京全式金公司生物技術(shù)有限公司);結(jié)晶紫水溶液(R20755,上海源葉生物科技有限公司);4%多聚甲醛(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit,CCK)-8(40203ES80)、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(40301ES60)[翌圣生物科技(上海)股份有限公司];凋亡試劑盒(88-8007,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);Transwell試劑盒(3422,美國(guó)Corning公司);Cyanine 3標(biāo)記的hsa_circ_0103232探針、熒光原位雜交試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)。Real-time PCR儀(7500Fast DX,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);流式細(xì)胞儀(CytoFLEX FCM,美國(guó)Beckman公司);熒光顯微鏡(IX71,日本Olympus公司);倒置顯微鏡(U2-RFLT100,美國(guó)SPW industrial公司);CO2培養(yǎng)箱(MCO-18AC,日本PHCbi公司);低速離心機(jī)(L3-5K,湖南可成儀器設(shè)備有限公司);超凈工作臺(tái)(KLCZ-880A,北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司);酶標(biāo)儀(Infinite F50,瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取C918和MUM2B細(xì)胞株,置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)3 d后傳代,待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各siRNA的干擾效果 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C918和MUM2B細(xì)胞,接種至6孔板,細(xì)胞接種密度為2×105/孔,分為陰性對(duì)照(siCtrl)組、si-hsa_circ_0103232#1組、si-hsa_circ_0103232#2組和si-hsa_circ_0103232#3組。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí),替換為不含胎牛血清和青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的培養(yǎng)基;培養(yǎng)4 h后,使用RNAimax轉(zhuǎn)染試劑分別將siCtrl、si-hsa_circ_0103232#1、si-hsa_circ_0103232#2和si-hsa_circ_0103232#3轉(zhuǎn)染到各組細(xì)胞中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。干擾序列如下:si-hsa_circ_0103232#1為5'-CUUGAUCUUGGUCACUCACAA-3';si-hsa_circ_0103232#2為5'-AUCUUGAUCUUGGUCAC UCAC-3';si-hsa_circ_0103232#3為5'-UUCAUCUUGAU CUUGGUCACU-3';siCtrl為5'-UUCUCCGAACGUGUCA CGU-3'。棄去培養(yǎng)基,使用PBS洗滌細(xì)胞2次。在6孔板中直接加入1 ml Trizol裂解細(xì)胞。提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下:hsa_circ_0103232正向引物序列為5'-CTCAATTCGTTTGTCCC TGGC-3',反向引物序列為5'-GGACACCGTCTCTCTGG TCA-3';β-actin正向引物序列為5'-CATGTACGTTGC TATCCAGGC-3',反向引物序列為5'-CTCCTTAATGTC ACGCACGAT-3'。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系:TransStart Tip Green qPCR Super Mix 10 μl,正、反向引物各1 μl,模板1 μl,雙蒸水補(bǔ)齊至20 μl。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算hsa_circ_0103232相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C918和MUM2B細(xì)胞,按3×105/孔分別接種至6孔板中,分為siCtrl組和si-hsa_circ_0103232組。參照1.2.2部分方法分別將siCtrl和si-hsa_circ_0103232轉(zhuǎn)染到各組細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24 h更換完全培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C918和MUM2B細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1 000/μl,按100 μl/孔接種于96孔板中;常規(guī)培養(yǎng)24 h后按照1.2.3方法分組轉(zhuǎn)染相應(yīng)siRNA,并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72和96 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液后,將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(absorbance,A)值。細(xì)胞活力(%)=(A干擾組-A空白溶劑孔)/(AsiCtrl組-A空白溶劑孔)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 分別收集轉(zhuǎn)染后的C918和MUM2B細(xì)胞,將MUM2B細(xì)胞按1 600/孔或C918細(xì)胞按2 400/孔分別接種于6孔板,每3 d換液1次,持續(xù)培養(yǎng)15 d。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌1次,每孔加入1 ml 4%多聚甲醛,固定30～60 min,PBS洗滌1次。每孔加入結(jié)晶紫水溶液(1∶1稀釋)500 μl,染色15 min。雙蒸水洗滌數(shù)次,晾干,數(shù)碼相機(jī)拍照,并進(jìn)行細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 分別收集轉(zhuǎn)染后的C918和MUM2B細(xì)胞,加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整C918細(xì)胞和MUM2B細(xì)胞濃度分別為2×106和3×107/ml。取100 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室上層,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。棄去小室上、下層液體后重新向24孔板中加入500 μl PBS,小室中加200 μl PBS,靜置清洗5 min。棄去PBS,向24孔板小孔內(nèi)加入500 μl甲醇固定10 min,棄甲醇,向24孔板小孔內(nèi)加入500 μl結(jié)晶紫染色液染色20 min。向小孔內(nèi)重新加入500 μl PBS,使用棉簽輕輕擦拭小室底膜上層細(xì)胞,PBS清洗小室底膜,10 min/次,清洗3次。將Transwell小室置于透明、干凈載玻片上,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 分別收集轉(zhuǎn)染的C918和MUM2B細(xì)胞,1 000×g離心5 min,棄上清,使用1 ml預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞1次,離心收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀使用1 ml預(yù)冷70%乙醇輕輕混勻,4 ℃固定過(guò)夜。1 000×g離心5 min沉淀細(xì)胞。使用1 ml預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞,1 000×g離心5 min沉淀細(xì)胞。在0.25 ml染色緩沖液中加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)溶液和10 μl RNaseA溶液,避光靜置15 min,進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。采用CytExpert(Version 2.4,美國(guó)Beckman Coulter公司)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量和光散射分析,并計(jì)算細(xì)胞周期的分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別收集轉(zhuǎn)染后的C918和MUM2B細(xì)胞。使用PBS洗滌細(xì)胞1次后,低速離心收集細(xì)胞,使用1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。向100 μl細(xì)胞懸液中加入5 μl熒光染料偶聯(lián)的Annexin V-FITC和5μl PI染液,室溫避光孵育15 min。制備好的細(xì)胞懸液在4 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。采用流式分析軟件CytExpert對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)確定hsa_circ_0103232在細(xì)胞中的定位 分別將C918和MUM2B細(xì)胞接種于6孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用hsa_circ_0103232探針標(biāo)記細(xì)胞,采用熒光原位雜交試劑盒檢測(cè)hsa_circ_0103232表達(dá)信號(hào),使用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中hsa_circ_0103232的表達(dá)情況和定位,hsa_circ_0103232表現(xiàn)為紅色熒光,細(xì)胞核為藍(lán)色熒光[16],以18S和U6作為內(nèi)參對(duì)照,18S分布在細(xì)胞質(zhì)中,U6分布在細(xì)胞核中。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組siRNA干擾效果比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,在C918細(xì)胞中,各組hsa_circ_0103232相對(duì)表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.10,P=0.008),其中si-hsa_circ_0103232#1組hsa_circ_0103232的相對(duì)表達(dá)量為0.263±0.016,si-hsa_circ_0103232#2組為0.237±0.108,對(duì)照組表達(dá)量為1.013±0.008,而si-hsa_circ_0103232#3靶點(diǎn)對(duì)hsa_circ_0103232表達(dá)無(wú)干擾效果。si-hsa_circ_0103232#1與siCtrl組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)。在MUM2B細(xì)胞中,各組hsa_circ_0103232相對(duì)表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.17,P<0.001),其中si-hsa_circ_0103232#1組相對(duì)表達(dá)量為0.469±0.028,對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量為1.004±0.108,而si-hsa_circ_0103232#2和si-hsa_circ_0103232#3組相對(duì)表達(dá)量分別為0.620±0.074和0.533±0.012,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖1B)。因此,選擇si-hsa_circ_0103232#1進(jìn)行下一步研究。

圖1 各組hsa_circ_0103232相對(duì)表達(dá)量比較(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn),n=3) A:C918細(xì)胞中各組hsa_circ_0103232表達(dá)量比較 F=19.10,P=0.008.與siCtrl組比較,aP<0.001 B:MUM2B細(xì)胞中各組hsa_circ_0103232表達(dá)量比較 F=49.17,P<0.001.與siCtrl組比較,aP<0.001 1:siCtrl組;2:si-hsa_circ_0103232#1組;3:si-hsa_circ_0103232#2組;4:si-hsa_circ_0103232#3組

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力和細(xì)胞克隆數(shù)比較

CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明,與siCtrl組相比,si-hsa_circ_0103232組C918和MUM2B細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)的增殖活力均顯著降低。相較于轉(zhuǎn)染第1 d,轉(zhuǎn)染后4 d,C918細(xì)胞中si-hsa_circ_0103232組的細(xì)胞活力為(135.99±0.90)%,顯著低于siCtrl組的(210.62±2.56)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=38.86,P<0.001);MUM2B細(xì)胞中si-hsa_circ_0103232組的細(xì)胞活力為(202.36±9.20)%,顯著低于siCtrl組的(248.91±0.53)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.141,P<0.01)(圖2)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,C918細(xì)胞中si-hsa_circ_0103232組細(xì)胞克隆數(shù)為(12±1)個(gè),顯著低于siCtrl組的(28±4)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.93,P=0.008);MUM2B細(xì)胞中si-hsa_circ_0103232組細(xì)胞克隆數(shù)為(45±7)個(gè),顯著低于siCtrl組的(83±3)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.42,P=0.002)(圖3)。

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力比較(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),Bonferroni校正,n=3) A:各組不同時(shí)間點(diǎn)C918細(xì)胞活力比較 與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)siCtrl組比較,aP<0.001 B:各組不同時(shí)間點(diǎn)MUM2B細(xì)胞活力比較 與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)siCtrl組比較,aP<0.001,bP<0.01 siCtrl:陰性對(duì)照siRNA;si-hsa_circ_0103232:靶向hsa_circ_0103232的siRNA

圖3 各組細(xì)胞克隆數(shù)量比較 A:各組C918細(xì)胞克隆形成情況(結(jié)晶紫×200) B:各組C918細(xì)胞形成克隆數(shù)比較 與siCtrl組比較,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) C:各組MUM2B細(xì)胞克隆形成情況(結(jié)晶紫×200) D:各組MUM28細(xì)胞克隆數(shù)比較 與siCtrl組比較,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) 1:siCtrl組;2:si-hsa_circ_0103232組

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較

Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示,C918細(xì)胞中si-hsa_circ_0103232組遷移細(xì)胞數(shù)為(4±1)個(gè),顯著低于siCtrl組的(37±12)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.91,P=0.017);在MUM2B細(xì)胞中si-hsa_circ_0103232組遷移細(xì)胞數(shù)為(24±2)個(gè),顯著低于siCtrl組的(57±3)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.80,P<0.001)(圖4)。

圖4 各組C918和MUM2B細(xì)胞遷移數(shù)比較 A:各組C918細(xì)胞遷移情況(結(jié)晶紫×200) B:各組C918細(xì)胞遷移數(shù)比較 與siCtrl組比較,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) C:各組MUM2B細(xì)胞遷移情況(結(jié)晶紫×200) D:各組MUM2B細(xì)胞遷移數(shù)比較 與siCtrl組比較,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) 1:siCtrl組;2:si-hsa_circ_0103232組

2.4 各組不同細(xì)胞周期比例比較

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,C918細(xì)胞中si-hsa_circ_0103232組G0/G1期細(xì)胞比例為(84.33±0.07)%,顯著高于siCtrl 組的(70.51±0.48)%,S期和G2/M期細(xì)胞比例分別為(5.56±0.33)%和(9.92±0.10)%,均顯著低于siCtrl組的(11.28±0.24)%和(17.98±0.56)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.50、33.70、20.00,均P<0.001);MUM2B細(xì)胞中si-hsa_circ_0103232組G0/G1期細(xì)胞比例為(51.27±0.68)%,顯著高于siCtrl組的(47.48±0.75)%,G2/M期細(xì)胞比例為(44.08±1.80)%,顯著低于siCtrl組的(49.32±0.76)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.286、3.79,均P<0.05)(圖5)。

圖5 各組不同細(xì)胞周期分布比較 A:各組C918細(xì)胞周期分布流式細(xì)胞圖 B:各組C918細(xì)胞周期分布量化比較 與相應(yīng)細(xì)胞周期siCtrl組比較,aP<0.001(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) C:各組MUM2B細(xì)胞周期分布流式細(xì)胞圖 D:各組MUM2B細(xì)胞周期分布量化比較 與相應(yīng)細(xì)胞周期siCtrl組比較,aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) siCtrl:陰性對(duì)照siRNA; si-hsa_circ_0103232:靶向hsa_circ_0103232的siRNA

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,si-hsa_circ_0103232組C918和MUM2B細(xì)胞凋亡率分別為(15.46±0.23)%和(14.90±0.66)%,均顯著多于siCtrl組的(9.31±0.05)%和(5.79±0.14)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=36.83、19.02,均P<0.001)(圖6)。

圖6 各組細(xì)胞凋亡數(shù)比較 A:各組C918細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖 B:各組C918細(xì)胞凋亡率比較 與siCtrl組比較,aP<0.001(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) C:各組MUM2B細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖 D:各組MUM2B細(xì)胞凋亡數(shù)比較 與siCtrl組比較,aP<0.001(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),n=3) 1:siCtrl組;2:si-hsa_circ_0103232組

2.6 hsa_circ_0103232在C918和MUM2B細(xì)胞中的定位

熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,hsa_circ_0103232與細(xì)胞核染色存在共定位,hsa_circ_0103232主要在細(xì)胞核中表達(dá)(圖7)。

圖7 hsa_circ_0103232在C918和MUM2B細(xì)胞中熒光原位雜交定位情況(標(biāo)尺=50 μm) 內(nèi)參探針18S、U6、hsa_circ_0103232 RNA染色均為紅色熒光(Alexa Fluor 594),細(xì)胞核染色均為藍(lán)色熒光(DAPI)

3 討論

UM患者常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為無(wú)痛性視力下降、視野缺損、光幻覺(jué)或虹膜顏色改變等;約30%的UM患者無(wú)癥狀,僅能通過(guò)常規(guī)眼底檢查發(fā)現(xiàn)[17]。目前,UM有多種治療方式,包括經(jīng)質(zhì)子束放射治療、鞏膜敷貼放射治療、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?、激光光凝和腫瘤局部切除以及眼球摘除等[18]。UM早期可發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移至肝臟、肺部和骨骼,分別約占89%、29%和17%[19-21]。目前,UM患者在診斷后5、15、25和35年的病死率分別為31%、45%、49%和52%[5,22]?，F(xiàn)階段,UM診斷和預(yù)后的有效分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)仍十分欠缺,亟待使用新的研究思路和手段來(lái)發(fā)掘UM轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,為UM的臨床診療提供新的線(xiàn)索。

circRNA早期被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤或副產(chǎn)物[23];近年來(lái),circRNA因其在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的重要調(diào)控作用已成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[22]。CiRS-7是一種經(jīng)典的促癌circRNA,在多種腫瘤中呈異常高表達(dá),包括肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和食管癌等;研究表明其可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑癌基因miR-7,拮抗miR-7對(duì)PI3K/AKT、ERGF等促腫瘤增生信號(hào)通路的抑制作用,進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力[24]。circRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力具有重要調(diào)控作用,可激活多個(gè)信號(hào)通路以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn),circRNA-51217在前列腺癌組織及細(xì)胞株中高表達(dá),并與miRNA-646競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表達(dá)增加,誘導(dǎo)TGFβ1/p-Smad2/3信號(hào)通路的激活,以增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞侵襲浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[25]。綜上,circRNA的異常表達(dá)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷徙等生物學(xué)行為,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

本課題組前期通過(guò)微陣列揭示hsa_circ_0103232在UM組織中呈高表達(dá),表明其可能參與UM的進(jìn)展[15]。本研究中采用siRNA干擾C918和MUM2B細(xì)胞中hsa_circ_0103232的表達(dá)并觀察細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力變化,發(fā)現(xiàn)干擾hsa_circ_0103232能顯著降低C918和MUM2B細(xì)胞活力,減少克隆形成,有效抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究還發(fā)現(xiàn),干擾hsa_circ_0103232后,細(xì)胞周期受抑制,且凋亡數(shù)量顯著增加。以上結(jié)果均表明,敲低hsa_circ_0103232能抑制細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、促進(jìn)凋亡,提示hsa_circ_0103232可能具有癌基因的角色,或可作為UM的治療靶點(diǎn)。本研究熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hsa_circ_0103232在細(xì)胞核中表達(dá),與Lin等[16]hsa_circ_0103232在細(xì)胞質(zhì)中的報(bào)道不一致,這可能是由于不同種類(lèi)細(xì)胞的差異造成。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示hsa_circ_0103232定位在UM細(xì)胞的細(xì)胞核中;干擾hsa_circ_0103232能顯著抑制UM細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究的局限性在于缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以對(duì)hsa_circ_0103232進(jìn)行深入的發(fā)展和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的探究,這也將是本課題組下一步研究重點(diǎn)。本研究探討了circRNA在UM中的作用,hsa_circ_0103232可能成為抑制UM進(jìn)展的潛在治療靶點(diǎn),為UM的疾病控制與治療提供了新方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明楊萱:直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、起草文章、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章知識(shí)性?xún)?nèi)容的審閱;魏文斌:直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、對(duì)文章智力性?xún)?nèi)容的修改及定稿