擺文麗，農(nóng)衛(wèi)霞，李智偉，雷 偉，郭玉娟，張向輝，芮東升，王 奎

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液風(fēng)濕科，新疆 石河子 832000；3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，新疆 烏魯木齊 830001）

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種能夠精確、快速地對(duì)生物細(xì)胞或微粒的理化特性和生物學(xué)特性進(jìn)行定量分析的技術(shù)[1]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和基因生物學(xué)的發(fā)展，F(xiàn)CM 已經(jīng)成為惡性血液病診斷的重要依據(jù)[2]。FCM 數(shù)據(jù)在人工分析中最關(guān)鍵和最耗時(shí)的步驟是識(shí)別數(shù)據(jù)中的同質(zhì)細(xì)胞群，這個(gè)過程為“設(shè)門”[3]。數(shù)據(jù)傳統(tǒng)的分析方法是通過不同參數(shù)組合進(jìn)行人工設(shè)門，隨著檢測(cè)參數(shù)成倍增加，產(chǎn)生了多組合、高維度的流式數(shù)據(jù)，而FCM 數(shù)據(jù)分析成為FCM 中最具挑戰(zhàn)性和最耗時(shí)的診斷步驟[4-7]。自動(dòng)設(shè)門是基于細(xì)胞群熒光強(qiáng)度分布的數(shù)學(xué)建模，可以使用有監(jiān)督和無監(jiān)督的方法來執(zhí)行，用于解決人工設(shè)門所面臨的問題。目前常見的自動(dòng)化分析方法包括FlowMeans[8]、SPADE[9]、Citrus[10]、FlowSOM[11]以及PCA[12]等，其中最常用的是FlowMeans，其是一種無監(jiān)督聚類方法，通過合并多個(gè)聚類以獲得最終細(xì)胞亞群[13，14]，但只能將FCM 數(shù)據(jù)中相似的細(xì)胞聚成亞群[15，16]，不能實(shí)現(xiàn)亞群的標(biāo)注，因此需要工作人員去一一識(shí)別，存在一定局限性?；诖?，本研究旨在分析FlowSOM 與有監(jiān)督分類模型[17]（混合正態(tài)分布模型）聯(lián)合應(yīng)用于FCM 數(shù)據(jù)自動(dòng)化分析中的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 數(shù)據(jù)來源于實(shí)驗(yàn)室2021 年1 月-12 月同一面板急性白血病骨髓檢測(cè)數(shù)據(jù)，共528例，包括412 例正常人、68 例AML、9 例T-ALL 以及39例B-AL。本研究經(jīng)當(dāng)?shù)卣畟惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 數(shù)據(jù)分析 FCM 數(shù)據(jù)細(xì)胞亞群的自動(dòng)分類和自動(dòng)標(biāo)注可以分成4 個(gè)階段進(jìn)行：①預(yù)處理：通過讀取數(shù)據(jù)、補(bǔ)償和轉(zhuǎn)換、去粘連完成FCM 數(shù)據(jù)預(yù)處理；②細(xì)胞聚類：使用FlowSOM 方法對(duì)預(yù)處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞聚類，聚類的結(jié)果以宏細(xì)胞的方式可視化；③亞群分類：利用混合正態(tài)分布模型，訓(xùn)練有監(jiān)督分類模型對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行分類；④亞群標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)③得到的有限個(gè)數(shù)的細(xì)胞亞群類進(jìn)行識(shí)別和標(biāo)注建立多對(duì)多映射，完成細(xì)胞亞群的標(biāo)注。

1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 通過補(bǔ)償、轉(zhuǎn)換和去粘連完成FCM 數(shù)據(jù)的預(yù)處理。①首先應(yīng)用補(bǔ)償矩陣對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)償，補(bǔ)償矩陣采用流式fcs 格式數(shù)據(jù)自帶的補(bǔ)償矩陣，通過讀取熒光抗體名稱與提取熒光通道的數(shù)據(jù)矩陣，對(duì)熒光抗體做補(bǔ)償[5]；②接著對(duì)FCM 數(shù)據(jù)做轉(zhuǎn)換，對(duì)前向散射光FSC 進(jìn)行線性變換（除以100 k），側(cè)向散射光SSC 進(jìn)行Log10對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，對(duì)抗體做雙指數(shù)變換；③最后使用百分位法在FSC-A 和FSC-H 平面對(duì)數(shù)據(jù)做去粘連處理，具體步驟如下：首先選取FSC-H 大于0.5 且FSC-A 小于2 的細(xì)胞子集，計(jì)算其在全體細(xì)胞中的占比；當(dāng)子集占比小于等于0.75 時(shí)，使用子集計(jì)算變量FSC-A 與FSC-H的百分位點(diǎn)P5和P75，否則計(jì)算P5和P90；以兩個(gè)對(duì)子為端點(diǎn)做基準(zhǔn)線段，將連線垂直上移和下移0.225單位做兩條平行線;兩條平行線之外的點(diǎn)即為粘連細(xì)胞；FSC-H 小于0.2 的點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)胞碎片，其余的為進(jìn)入后續(xù)分析的細(xì)胞，包括正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。上述切割點(diǎn)的選擇用試錯(cuò)法確定。

1.2.2 細(xì)胞聚類 細(xì)胞聚類采用無監(jiān)督分析方法，在操作中不需要任何標(biāo)簽，任何預(yù)定義的類作為引用。聚類算法識(shí)別同一聚類中的事件，將相似的細(xì)胞保留在同一個(gè)集群中，不同的細(xì)胞保留在不同的集群中。FlowSOM 具有節(jié)點(diǎn)網(wǎng)格，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表多維空間中的點(diǎn)[17]。自組織映射（the self-organizing map，SOM）將數(shù)據(jù)中的單元格分配給最近的節(jié)點(diǎn)，該節(jié)點(diǎn)以及周圍的節(jié)點(diǎn)向新單元格更新，以此類推，節(jié)點(diǎn)被分配到數(shù)據(jù)空間中的高密度區(qū)域，節(jié)點(diǎn)網(wǎng)格中相近的節(jié)點(diǎn)比較遠(yuǎn)的節(jié)點(diǎn)更相似[18]。因此，所有的單元格將會(huì)分配到距離他們最近的節(jié)點(diǎn)，從而將FCM 數(shù)據(jù)中相同的細(xì)胞聚類在一起形成細(xì)胞亞群。為便于觀察聚類結(jié)果，F(xiàn)lowSOM 聚類結(jié)果以亞群中心點(diǎn)展示，下文中把亞群中心點(diǎn)稱為宏細(xì)胞。聚類的目標(biāo)是將FCM 數(shù)據(jù)分為若干個(gè)類群，并保證類群內(nèi)的樣本盡可能密集，不同類群之間盡可能離散。FlowSOM將FCM 數(shù)據(jù)中相似的節(jié)點(diǎn)聚在一起形成無標(biāo)簽的細(xì)胞亞群，以宏細(xì)胞的形式展示。當(dāng)比較5×5、10×10和15×15 網(wǎng)格時(shí)，發(fā)現(xiàn)節(jié)點(diǎn)數(shù)量越多對(duì)應(yīng)的純度越高，但是聚類結(jié)果很混亂；根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，前4 管使用12×12 網(wǎng)格，第5 管使用10×10 網(wǎng)格，因此前4 管的每管有144 個(gè)宏細(xì)胞，第5 管有100 個(gè)宏細(xì)胞。

1.2.3 亞群分類 聚類分析后得到細(xì)胞聚類結(jié)果，但由于FlowSOM 是無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，不同抗體組合的樣本得到的亞群構(gòu)成不一致，導(dǎo)致亞群次序混亂缺乏統(tǒng)一標(biāo)簽，需要對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行分類[19]。把標(biāo)本分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，訓(xùn)練基于混合正態(tài)分布的有監(jiān)督分類模型對(duì)所有的宏細(xì)胞進(jìn)行分類，也就是對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行統(tǒng)一分類，混合正態(tài)分布模型的類別數(shù)設(shè)置為20。有監(jiān)督的混合正態(tài)分布模型對(duì)FlowSOM生成的宏細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行分類。具體步驟如下：為了避免數(shù)據(jù)過少導(dǎo)致訓(xùn)練集分類結(jié)果代表性差，選擇60%～70%的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，30%～40%作為驗(yàn)證集，因此從AML、T-ALL、B-ALL 數(shù)據(jù)中分別隨機(jī)挑選41、9、39 例數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集；正常人數(shù)據(jù)有412例，如果隨機(jī)選擇60%的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，這樣使得訓(xùn)練集中正常人數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于患者數(shù)據(jù)，正常人細(xì)胞亞群特征覆蓋異常細(xì)胞亞群，造成分類不準(zhǔn)確，因此選擇100 例正常數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集。訓(xùn)練集170 例數(shù)據(jù)，共97 920 個(gè)宏細(xì)胞；測(cè)試集358 例數(shù)據(jù)，共206 208 個(gè)宏細(xì)胞，為了使分類結(jié)果清晰明了，從兩個(gè)數(shù)據(jù)中隨機(jī)選取25 000 個(gè)宏細(xì)胞來顯示。

1.2.4 亞群標(biāo)注 為使細(xì)胞亞群分類更加精確，分類模型中亞群數(shù)目的設(shè)置通常高于常規(guī)使用的細(xì)胞類型數(shù)。因此在亞群標(biāo)注過程中，通過提取細(xì)胞聚類信息以及各類細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，將宏細(xì)胞映射到9 個(gè)細(xì)胞類別并進(jìn)行命名標(biāo)注。

2 結(jié)果

2.1 粘連細(xì)胞的識(shí)別去除 以FSC-A 和FSC-H 為坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，基準(zhǔn)線上下移動(dòng)0.225 個(gè)單位產(chǎn)生兩條平行線將粘連細(xì)胞去除，見圖1，經(jīng)檢查去粘連結(jié)果，發(fā)現(xiàn)粘連細(xì)胞劃分均合理。

圖1 預(yù)處理結(jié)果

2.2 聚類分析 各類細(xì)胞的宏細(xì)胞分布是有規(guī)律可循，服從特定的概率分布，見圖2。

圖2 FlowSOM 聚類結(jié)果

2.3 亞群分類與標(biāo)注 共有20 個(gè)類別，且各類宏細(xì)胞位置合理，未見異常，見圖3；另對(duì)20 個(gè)細(xì)胞類別進(jìn)行一一識(shí)別和標(biāo)注，得到9 種已知細(xì)胞類，分別是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、原始細(xì)胞、幼稚細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、其他細(xì)胞，見圖4。

圖4 細(xì)胞亞群標(biāo)注前后比較

3 討論

由于FCM 具有高通量、高靈敏度、高精確度以及多參數(shù)檢驗(yàn)的特點(diǎn)[20]，被廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)研究及臨床診斷中[21-23]，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生高維度、多組合的FCM 數(shù)據(jù)。而傳統(tǒng)人工分析具有分析效率低、主觀性高的問題。近年來不斷有學(xué)者提出FCM 數(shù)據(jù)的分析需要自動(dòng)化分析方法的幫助[5，24]。

針對(duì)以上問題，本研究提出無監(jiān)督聚類方法與有監(jiān)督分類方法共同用于FCM 數(shù)據(jù)分析，模擬人工分析過程，獲取臨床流式實(shí)驗(yàn)室的原始檢測(cè)數(shù)據(jù)，預(yù)處理過程通過補(bǔ)償、轉(zhuǎn)換、粘連細(xì)胞以及細(xì)胞碎片的去除，使得FCM 數(shù)據(jù)規(guī)范化，檢查發(fā)現(xiàn)每例數(shù)據(jù)的粘連細(xì)胞去除均合理；之后將無監(jiān)督聚類方法與有監(jiān)督分類方法結(jié)合起來用于FCM 數(shù)據(jù)聚類、亞群分類與標(biāo)注，顯著優(yōu)點(diǎn)是其既能夠快速分類又能夠提高分類數(shù)目的準(zhǔn)確度。

無監(jiān)督聚類方法FlowSOM 作為分析的起點(diǎn)，將FCM 數(shù)據(jù)中相似的細(xì)胞聚在一起形成無標(biāo)簽的細(xì)胞亞群，通過設(shè)定的參數(shù)，F(xiàn)lowSOM 將FCM 數(shù)據(jù)中相似的細(xì)胞聚在一起形成無標(biāo)簽的細(xì)胞亞群，以宏細(xì)胞的形式展示。從聚類結(jié)果看出，F(xiàn)lowSOM 具有良好的性能以及快速的運(yùn)行時(shí)間，是對(duì)FCM 數(shù)據(jù)進(jìn)行快速探索性分析的理想工具。但是將宏細(xì)胞進(jìn)一步聚類時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同細(xì)胞類型合并的現(xiàn)象，不能通過FlowSOM 模型的元聚類對(duì)亞群進(jìn)一步聚類與特征提取。因此，使用有監(jiān)督分類模型混合正態(tài)分布模型對(duì)FlowSOM 生成的宏細(xì)胞進(jìn)行分類，有監(jiān)督學(xué)習(xí)算法可以達(dá)到這樣一種狀態(tài)：在提供足夠的信息數(shù)據(jù)前提下，它能夠預(yù)測(cè)未見數(shù)據(jù)的正確標(biāo)簽；混合正態(tài)分布模型對(duì)亞群進(jìn)行分類時(shí)，首先將數(shù)據(jù)集分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，使用訓(xùn)練集訓(xùn)練有監(jiān)督分類模型過程中，對(duì)亞群類別參數(shù)進(jìn)行設(shè)定，發(fā)現(xiàn)隨著亞群數(shù)的增加，分類精確度會(huì)提高，但是不利于對(duì)亞群進(jìn)行標(biāo)注；反之，亞群數(shù)減少，精確度降低，但是會(huì)出現(xiàn)將不同細(xì)胞亞群分到一起的現(xiàn)象。故根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，將細(xì)胞亞群設(shè)置為20 個(gè)，接下來使用測(cè)試集對(duì)模型進(jìn)行測(cè)試，檢查訓(xùn)練集與測(cè)試集的分類結(jié)果，未見異常，可以認(rèn)為有監(jiān)督分類模型能夠準(zhǔn)確地對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集進(jìn)行分類。最后通過設(shè)定標(biāo)簽的形式將20 個(gè)類別依次識(shí)別并用已知的細(xì)胞類別進(jìn)行標(biāo)注，即將宏細(xì)胞映射到9 個(gè)細(xì)胞類別，對(duì)這9 個(gè)細(xì)胞類別進(jìn)行命名標(biāo)注，檢查所有數(shù)據(jù)標(biāo)注前與標(biāo)注后的可視化結(jié)果圖，亞群標(biāo)注結(jié)果清晰，未見異常。

總之，通過將基于本研究方法的亞群分類與標(biāo)注結(jié)果與傳統(tǒng)人工分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，成功驗(yàn)證了自動(dòng)化分析方法在FCM 數(shù)據(jù)分類與標(biāo)注中的可行性和高準(zhǔn)確性，具有較好的應(yīng)用前景，可以為下游FCM 數(shù)據(jù)自動(dòng)化診斷提供參考，并且能夠保留原始數(shù)據(jù)更多的特征信息，為下游診斷結(jié)果的質(zhì)量控制提供依據(jù)。本研究也有不足之處：作為流式數(shù)據(jù)全程自動(dòng)化分析的重要組成，而且分類結(jié)果較難用評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此利用分類結(jié)果進(jìn)行特征提取和疾病診斷，診斷結(jié)果與專家人工分類結(jié)果基本相同，從而反推證明本研究提出的FCM 數(shù)據(jù)自動(dòng)化分類方法可靠；自動(dòng)化分析FCM 數(shù)據(jù)時(shí)假設(shè)流式實(shí)驗(yàn)室在樣本準(zhǔn)備、熒光染色、儀器校準(zhǔn)和調(diào)整階段均正常，在實(shí)際情況中，可能出現(xiàn)數(shù)據(jù)大幅度偏移，建立在分布規(guī)律基礎(chǔ)上的亞群標(biāo)注結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)偏差。目前，本研究提出的自動(dòng)化分析方法已經(jīng)在公共數(shù)據(jù)庫Flowrepository.orgAML 項(xiàng)目提供的數(shù)據(jù)以及本地實(shí)驗(yàn)室急性白血病骨髓檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行過測(cè)試，效果良好。