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        1株藍(lán)莓灰霉病病原菌的分離鑒定及殺菌劑室內(nèi)毒力測定

        2024-04-08 09:59:48顏倩侯瑞李思羅其鑫李金子月
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年3期

        顏倩 侯瑞 李思 羅其鑫 李金子月

        摘要:灰霉病是藍(lán)莓生產(chǎn)中的重要病害,近年來嚴(yán)重影響貴州省藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展。為明確藍(lán)莓灰霉病病原菌,采用組織分離法從貴州省麻江縣藍(lán)莓基地采集藍(lán)莓灰霉病病葉,分離鑒定藍(lán)莓灰霉病病原菌。通過形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、ITS、HSP60、RPB2多基因序列,系統(tǒng)發(fā)育樹分析和致病力測定,將分離菌株HM4-1鑒定為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。同時,采用菌絲生長速率測定4種殺菌藥劑對菌株HM4-1的室內(nèi)毒力,結(jié)果表明,在相同濃度梯度下4種殺菌劑對病原菌菌株HM4-1菌絲生長的抑制率分別為:啶酰菌胺56.875%~76.563%、異菌脲30.208%~100.000%、百菌清14.667%~43.960%,腐霉利34.250%~100.000%。將4種殺菌劑對該菌株菌絲生長的抑制率進(jìn)行顯著性及室內(nèi)毒力分析發(fā)現(xiàn),啶酰菌胺的抑制性最佳,EC50為0.622 mg/L,相比于百菌清的相對毒力指數(shù)為63.12,異菌脲和腐霉利次之,百菌清較弱,三者EC50分別為1.368、2.488、39.260 mg/L?;颐共〔≡姆蛛x鑒定和室內(nèi)毒力測定為進(jìn)一步研究藍(lán)莓灰霉病綜合防控提供了理論基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞:藍(lán)莓;灰霉??;分離鑒定;室內(nèi)毒力;抑制率;相對毒力指數(shù)

        中圖分類號:S436.639? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號:1002-1302(2024)03-0153-06

        篤斯越橘(Vaccinium uliginosum)別稱藍(lán)莓,多年生常綠或落葉灌木,屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium),是營養(yǎng)價值較高的小漿果果樹[1]。藍(lán)莓于20世紀(jì)開始在我國進(jìn)行栽培引種,其果實(shí)富含花青甙,抗氧化能力強(qiáng),且低糖、低脂肪對人類健康有益,被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[2-3]。我國引進(jìn)的品種主要為高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓以及兔眼藍(lán)莓等[4]。近年來隨著藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)迅速的發(fā)展,病害也在逐年增加,且危害嚴(yán)重。貴州省常見的藍(lán)莓病害主要為藍(lán)莓灰霉病、藍(lán)莓根腐病、藍(lán)莓枝枯病和藍(lán)莓葉斑病等,對藍(lán)莓的健康生長和產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生極大的危害[5-8]。

        灰霉病為植物常見病害之一,其不僅是危害藍(lán)莓的嚴(yán)重病害,也是番茄、草莓和葡萄等植物的真菌性病害,嚴(yán)重影響植物的健康生長[9-11]。藍(lán)莓灰霉病常見病原菌主要為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),目前報道的灰葡萄孢菌主要分為無菌核產(chǎn)孢、產(chǎn)菌核產(chǎn)孢、菌核產(chǎn)孢3種類型,各菌群代表菌株均有致病性,但存在差異[12]。藍(lán)莓灰霉病在多個省份均有不同程度的暴發(fā),嚴(yán)雪瑞等發(fā)現(xiàn)我國北方藍(lán)莓主要產(chǎn)區(qū)遼寧省、吉林省、山東省等地該病害普遍發(fā)生,成為限制藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一,我國南方貴州省、浙江省、安徽省的藍(lán)莓灰霉病病害也日益嚴(yán)重[12-13]。貴州作為藍(lán)莓主要產(chǎn)區(qū)省份之一,藍(lán)莓灰霉病病害卻少見報道,貴州省藍(lán)莓灰霉病高發(fā)期為每年3—5月,主要危害藍(lán)莓的花、果、葉和莖稈等部位[14]。其在田間發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為侵染初期葉片、花器等出現(xiàn)病斑,隨著侵染時間加長,病斑呈黃褐色水浸狀擴(kuò)散開來,速度快、范圍廣,直至花器、莖稈發(fā)黑腐爛,葉片枯死,且感病植株地下部分會停止生長。

        本研究通過對貴州省麻江縣藍(lán)莓灰霉病展開病原真菌的分離、鑒定工作,明確其病原真菌種類,同時對藍(lán)莓灰霉病殺菌藥劑進(jìn)行篩選,以期為進(jìn)一步研究藍(lán)莓灰霉病的防治措施提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        藍(lán)莓灰霉病病樣采集自貴州省黔東南州麻江縣瑞藍(lán)果業(yè)藍(lán)莓種植基地(107°60′73″E,26°52′78″N,海拔為864 m)發(fā)病藍(lán)莓植株,供試藍(lán)莓品種為一年生萊格西藍(lán)莓。

        培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基(葡萄糖20 g、馬鈴薯汁 1 000 mL、瓊脂18~20 g)、PDB培養(yǎng)基(葡萄糖 20 g、馬鈴薯汁1 000 mL)。

        供試殺菌劑:50%腐霉利可濕性粉劑(日本住友化學(xué)株式會社)、50%異菌脲懸浮劑(蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司)、75%百菌清可濕性粉劑[先正達(dá)(蘇州)作物保護(hù)有限公司]、50%啶酰菌胺水分散粒劑(山東惠民中聯(lián)生物科技有限公司)。

        1.2 試驗時間及地點(diǎn)

        于2022年5月在貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學(xué)林學(xué)院森林病理學(xué)實(shí)驗室開展試驗。

        1.3 病原菌分離純化

        選取典型發(fā)病癥狀的藍(lán)莓植株利用組織分離法進(jìn)行病原菌的分離和純化,得到代表性菌株HM4-1。選取有病斑藍(lán)莓葉片和果實(shí),用水沖洗表面灰層后晾干,將藍(lán)莓病部組織放置超凈工作臺中,用75%乙醇將病部組織浸泡3 s左右后,放入3%~5%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min,最后用無菌水沖洗5~8次,將病組織部分剪切為5 mm×5 mm小塊,置于無菌濾紙上吸干表面水分,將消毒后的病組織塊在PDA平板上輕輕按壓后取下,并將該平板作為對照用以檢測消毒效果。切取同樣大小病組織塊接種于PDA培養(yǎng)基中央在25 ℃黑暗條件培養(yǎng)3 d后,用接種針挑取邊緣菌絲純化處理,直到PDA平板上長出形態(tài)單一菌落。

        1.4 藍(lán)莓灰霉病病原菌的鑒定

        1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

        超凈操作臺中,內(nèi)徑為5 mm的打孔器先在病原菌菌落邊緣打出菌餅,將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央并放置于25 ℃黑暗條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~7 d后,觀察菌落的形態(tài)、菌絲生長速度、菌絲密度與著生情況等。待菌株培養(yǎng)7~15 d后,采用壓片的方法,用光學(xué)顯微鏡對菌株的分生孢子及菌絲形態(tài)進(jìn)行觀察[15]。

        1.4.2 病原菌致病性測定

        根據(jù)柯赫氏法則測定病原菌致病性,做有傷接種。純化好的菌株在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后,在菌落邊緣取直徑為5 mm的菌絲塊,將生長狀況相同的健康藍(lán)莓葉片用滅菌接種針在藍(lán)莓葉片主脈兩側(cè)扎上傷口,并將純化的菌餅接種到植株傷口上,以無菌PDA 培養(yǎng)基接種到植株作為對照[12]。處理和對照各做10次重復(fù),接種后葉片用雙層濾紙和無菌脫脂棉進(jìn)行保濕處理,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,3~5 d后觀察葉片發(fā)病情況。最后取發(fā)病的部位進(jìn)行病原菌再分離,并將分離后獲得的病原菌與接種病原菌進(jìn)行對比,完成致病性檢測。

        1.4.3 分子生物學(xué)鑒定

        以病原菌HM4-1的DNA作為模板,用Fungal DNA Midi Kit真菌DNA提取試劑盒(OMEGA),采用真菌ITS通用引物及基于基因HSP60、RPB2設(shè)計的特異引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后送往重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測得的菌株序列提交到GenBank獲得登錄號,同時與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對,于比對結(jié)果中挑取代表性序列在MEGA 7.0中構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

        1.5 室內(nèi)毒力測定

        通過觀察菌株HM4-1菌絲生長速率檢測4種殺菌劑對該菌株的室內(nèi)毒力。以無菌蒸餾水將殺菌劑原藥配制成有效藥劑濃度為1×104 mg/L的母液,在配制母液基礎(chǔ)上對其進(jìn)行梯度稀釋,4種藥劑均按照500、1 000、2 000、5 000、10 000倍濃度稀釋[19-20],稀釋液濃度為20、10、5、2、1 mg/L。

        將在母液基礎(chǔ)上稀釋好的藥劑放置超浄工作臺中,移液槍吸取5 mL藥劑于20 mL滅菌處理完冷卻至50~60 ℃的PDA培養(yǎng)基中,充分使藥劑與PDA混合后倒皿,每種藥劑不同濃度制作3個直徑為90 mm的含藥PDA平板。利用無菌打孔器在活化好的藍(lán)莓灰霉菌株HM4-1邊緣打取直徑為 5 mm 的菌餅接種于含藥平板中央,以無菌水處理為對照,每個處理設(shè)置3次重復(fù)。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng),待對照組菌落基本長滿平板后,采用十字交叉法測量各菌落直徑,數(shù)據(jù)采用SPASS 26.0進(jìn)行顯著性分析,并計算各含藥平板對藍(lán)莓灰霉菌株HM4-1菌絲生長的抑制率以及各藥劑的半最大效應(yīng)濃度(EC50)、95%置信區(qū)間和相關(guān)系數(shù)(r2)。以藥劑抑菌性最弱的EC50為基準(zhǔn)值,計算其他藥劑的相對毒力指數(shù)。

        菌絲生長抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 藍(lán)莓灰霉病病原菌的鑒定

        2.1.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

        從藍(lán)莓葉片中分離出35株形態(tài)相似的致病菌,選取代表性病原菌HM4-1進(jìn)行菌株鑒定、致病性等研究。將菌株HM4-1接種于PDA培養(yǎng)基,于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后,菌絲基本長滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿,發(fā)現(xiàn)其生長速度較快,氣生菌絲發(fā)達(dá),菌絲前期呈白色、地毯式生長(圖1-A),后期菌落逐漸從中心由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榛揖G色且開始產(chǎn)生黑色菌核(圖1-B)。病原菌在培養(yǎng)10 d時間內(nèi)開始產(chǎn)孢,以壓片的方法于光學(xué)顯微鏡下觀察到病原菌HM4-1的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),孢子整體生長較為密集,聚集于孢子梗周圍,孢子梗呈葡萄束狀生長,分生孢子無色透明、表面光滑、橢圓至圓形、未見隔膜、單孢生長(圖1-C、圖1-D),根據(jù)其形態(tài)特征初步判斷病原菌HM4-1為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。

        2.1.2 藍(lán)莓灰霉病田間癥狀

        田間發(fā)病癥狀為:葉片初期從葉緣呈水浸倒三角狀開始侵染形成病斑,花器和果實(shí)等感病后也出現(xiàn)病斑、發(fā)黑、隨發(fā)病時間加長,后期出現(xiàn)葉片枯死、花果腐爛,直至整株干枯死亡(圖1-E、圖1-F)。

        2.1.3 病原菌致病性鑒定

        藍(lán)莓病組織分離所得到的病原菌HM4-1接種到有傷的藍(lán)莓葉片上,3 d 后葉片可見病斑,3~5 d葉片表面開始出現(xiàn)水浸狀病斑,并且擴(kuò)散快速,且隨接種時間延長,葉片表面病斑逐漸蔓延直至枯死(圖1-G)。接種HM4-1的藍(lán)莓葉片刺傷處有稀疏的菌絲生長,對比接種無菌PDA瓊脂塊葉片無發(fā)病癥狀(圖1-H)。

        2.1.4 病原菌分子學(xué)鑒定

        將菌株HM4-1的 ITS、HSP60、RPB2序列分別在 NCBI 序列庫中進(jìn)行搜索匹配。比對結(jié)果表明,上述序列分別與登錄號MT832025.1、MN159921.1、MH732872.1最接近。將基于3個不同引物測序所得病原菌HM4-1序列提交到GenBank,分別獲得登錄號OP782300、OP830830、OP830831。根據(jù)病原菌HM4-1序列相似性分析,采用Phylosuite軟件將ITS、HSP60、RPB2序列進(jìn)行多基因數(shù)據(jù)串聯(lián),在MEGA 7.0中構(gòu)建菌株HM4-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

        2.2 4種殺菌藥劑對菌株HM4-1菌絲生長的抑制率

        通過菌絲生長速率法測定4種殺菌藥劑對菌株HM4-1的室內(nèi)毒力 啶酰菌胺在各濃度下對藍(lán)莓灰葡萄孢菌菌絲生長抑制效果差異不大,與對照菌絲相比抑菌能力較強(qiáng),處理組各濃度下菌絲生長緩慢,菌絲稀薄,出現(xiàn)明顯菌絲營養(yǎng)不足、伸長不夠等現(xiàn)象(圖3-A)。異菌脲對菌株HM4-1菌絲生長抑制效果尚佳,5~20 mg/L濃度區(qū)間對其抑制率大于99%,隨著殺菌劑有效含量濃度下降,當(dāng)濃度為 2 mg/L 時菌株開始生長,有少量稀薄菌絲從平板中央開始向四周生長,當(dāng)藥劑濃度最低(1 mg/L)時,菌絲開始大量正常生長,表明異菌胺對菌株HM4-1的抑制性開始下降,對比對照組菌絲生長情況可知該藥劑對菌株還存在一定的抑制效果,但較其他處理濃度來說較弱(圖3-B)。百菌清對藍(lán)莓灰葡萄孢菌菌絲的抑制效果在4種殺菌藥劑中最差,該處理條件下菌株HM4-1菌絲生長情況尚佳,由對照組情況可知,仍存在一定抑制效果,但隨殺菌劑有效濃度降低,對該菌絲生長的抑制性也隨之削弱,當(dāng)濃度為1 mg/L時,抑制率幾乎為零(圖3-C)。腐霉利對藍(lán)莓灰葡萄孢菌菌絲生長抑制率在濃度為20 mg/L時最佳,菌絲無生長趨勢,10 mg/L時次之,菌絲有緩慢生長跡象,其菌絲開始向四周伸長。隨濃度降低,其對菌絲生長抑制效果下降,當(dāng)濃度下降到2、1 mg/L時,腐霉利對菌株HM4-1菌絲生長的抑制差異開始縮?。▓D3-D)。

        在相同濃度梯度下(1、2、5、10 mg/L),4種殺菌藥劑對菌株HM4-1菌絲生長均有較好的抑制效果,其中啶酰菌胺和異菌脲效果最佳,對菌株HM4-1菌絲生長抑制率分別為55.529%~76.563%、30.208%~100.000%,腐霉利的抑制效果次之,百菌清對菌株HM4-1的抑制性最弱,僅為14.667%~43.960%(表2)。

        2.3 4種殺菌藥劑對菌株HM4-1的室內(nèi)毒力

        在相同濃度梯度下4種殺菌藥劑對藍(lán)莓灰霉病病原真菌的室內(nèi)毒力皆處于較高水平,啶酰菌胺、異菌脲、百菌清、腐霉利的EC50分別為0.622、1.368、39.260、2.488 mg/L。其中,啶酰菌胺對菌株HM4-1的室內(nèi)毒力最高,相對毒力指數(shù)為63.12,百菌清和腐霉利對其室內(nèi)毒力較低,相對毒力指數(shù)分別為1.00、15.78(表3)。

        3 討論

        本研究通過對貴州省麻江縣分離所得到的1株代表性菌株HM4-1結(jié)合形態(tài)學(xué)、多基因序列測序(rDNA-ITS、HSP60和RPB2)分析鑒定,確定藍(lán)莓灰霉病致病菌為灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea),這與王丹等研究發(fā)現(xiàn)的山東省藍(lán)莓灰霉病病原菌rDNA-ITS的鑒定結(jié)果[21]一致。 郜海燕等早在2017年利用rDNA-ITS基因序列測序,將浙江杭州藍(lán)莓灰霉病病原菌鑒定為灰葡萄孢菌[22]。本研究同時采用真菌通用測序引物rDNA-ITS 及2種特異引物HSP60和RPB2對藍(lán)莓灰霉病病原菌進(jìn)行分析鑒定,在貴州省屬首次報道。該病原真菌適應(yīng)性強(qiáng),寄主范圍廣,致病率高[23]。

        灰葡萄孢菌(B. cinerea)可侵染多種植物進(jìn)而引發(fā)灰霉病,如龍牙百合灰霉病、煙草灰霉病,同時也是草莓和番茄等植物灰霉病的病原菌[9-10,17,24]?;移咸焰呔秩痉秶^為廣泛,可引起世界范圍內(nèi) 1 000 種以上植物發(fā)生灰霉?。?5]。鑒于其適應(yīng)性較強(qiáng)的特點(diǎn),近年來在貴州省各地均有發(fā)生,其中麻江、黔東南、遵義地區(qū)藍(lán)莓灰霉病發(fā)生嚴(yán)重[5]。本研究采用菌絲生長速率法測定4種殺菌藥劑(啶酰菌胺、異菌脲、百菌清、腐霉利)對菌株HM4-1的室內(nèi)毒力[26-27],結(jié)果表明,相同濃度梯度下,4種藥劑對菌株HM4-1菌絲生長均有不同程度的抑制作用,其中啶酰菌胺和異菌脲表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制性,室內(nèi)毒力較高,EC50分別為0.622 mg/L和 1.368 mg/L。李鴻浩等在研究中發(fā)現(xiàn),異菌脲對灰霉病病原菌菌絲生長的抑制作用較強(qiáng),腐霉利較前兩者次之,EC50為2.488 mg/L[28];張從宇等研究發(fā)現(xiàn),分離所得灰霉菌株中,有56%的菌株對腐霉利產(chǎn)生較強(qiáng)抗藥性[29]。百菌清對菌株HM4-1菌絲生長抑制作用較弱,EC50為39.260 mg/L,說明菌株HM4-1對其產(chǎn)生較高抗性,抑制效果較差。設(shè)置相同濃度梯度下,啶酰菌胺和百菌清對菌株HM4-1的毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)趨近于1,而異菌脲、腐霉利的相關(guān)系數(shù)則較前兩者略低,表明在該濃度梯度下,菌株HM4-1的菌絲在殺菌劑啶酰菌胺和百菌清中生長狀態(tài)變化較為平緩,而異菌脲及腐霉利對HM4-1菌絲生長變化影響隨著濃度不同波動較大,從而導(dǎo)致其相關(guān)系數(shù)較低。啶酰菌胺在各濃度下對灰霉菌菌株的抑制率差異較小,效果較佳,異菌脲5、10、20 mg/L濃度下對灰霉菌菌株的抑制性最高,腐霉利僅在20 mg/L濃度下對菌株HM4-1菌絲生長

        有較強(qiáng)抑制性,菌株HM4-1對百菌清產(chǎn)生抗藥性,各濃度下抑制效果差于其他3種殺菌劑。

        藍(lán)莓灰霉病對藍(lán)莓產(chǎn)量和品質(zhì)影響嚴(yán)重,本試驗通過對貴州省麻江縣藍(lán)莓灰霉病病原真菌的分離鑒定以及不同殺菌藥劑對其的室內(nèi)毒力測定,可為下一步展開深入研究和防治工作奠定基礎(chǔ)。

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