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        草莓炭疽病病原鑒定及拮抗菌株篩選

        2024-04-08 09:59:48楊洪俊張旭陳佳佳孫朋朋張石林王鈞銘王媛花顏志明
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年3期

        楊洪俊 張旭 陳佳佳 孫朋朋 張石林 王鈞銘 王媛花 顏志明

        摘要:草莓炭疽病是近幾年草莓生產(chǎn)中的主要病害之一,危害性大、毀滅性強。為明確江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)草莓炭疽病病原菌種類,并篩選對其有效的拮抗菌株,從丹徒區(qū)草莓露天苗圃采集炭疽病發(fā)病植株,采用組織分離法對病原真菌進行分離,通過致病性測定,結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)準確鑒定其種類,并以此為靶標病原菌,通過平板對峙法篩選拮抗菌株。 結(jié)果表明,從草莓植株發(fā)病部位共分離獲得11株暹羅炭疽菌(Colletotrichum siamense),其中,從根部分離得到2株(D13、D19)、莖部4株(D1、D2、D11、D12)、葉部5株(D8、D9、D10、D20、D21)。經(jīng)柯赫氏法則驗證,C. siamense 為草莓炭疽病病原真菌,其中D8和D19這2株C. siamense致病性較強。從健康草莓植株內(nèi)分離獲得29株內(nèi)生真菌,以D8和D19作為指示菌,通過平板對峙試驗篩選出5株拮抗效果較好的生防菌株,分別為Z72、Z79、Z52、Z107和Z101,其抑菌率均達到了60%以上,其中Z72對D8和D19的抑菌率分別達到了74.07%、79.82%。經(jīng)鑒定,這5株拮抗菌均為木霉屬真菌(Trichoderma spp.)。暹羅炭疽菌為丹徒區(qū)草莓炭疽病主要病原菌,具有較強的致病性,草莓內(nèi)生真菌可為草莓炭疽病微生物防治提供重要資源。

        關(guān)鍵詞:草莓炭疽病;病原真菌;分離鑒定;致病性;拮抗菌

        中圖分類號:S436.68+4? 文獻標志碼:A

        文章編號:1002-1302(2024)03-0147-06

        我國是世界上最大的草莓生產(chǎn)國,草莓種植面積占比全球近1/3。草莓生產(chǎn)具有周期短、見效快、效益高、果品無公害等特點。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展以及人們生活水平的提高,市場上對草莓的需求量變大,也吸引越來越多的人種植草莓。而草莓炭疽病是草莓生產(chǎn)過程中的主要病害之一[1-2]。1931年Brooks首次報道草莓炭疽病,該病主要危害草莓的匍匐莖、葉柄、根冠、花及果實等[3]。尤其是密閉的草莓棚及高溫高濕環(huán)境等利于草莓炭疽病的發(fā)生,導(dǎo)致草莓減產(chǎn)25%~30%,在草莓育苗期和定植初期,發(fā)病率有時高達80%,嚴重時造成草莓苗大面積凋萎枯死,嚴重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。

        目前,除種植一些高抗品種外,草莓炭疽病仍以化學(xué)藥劑防治為主,但隨著病原菌抗藥性的不斷增強,殺菌劑防治炭疽菌的效果都不太理想且易污染環(huán)境,不利于我國綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展[5]。目前生物防治技術(shù)是國際上競相開發(fā)的新技術(shù),因其綠色、安全等特點,越來越為人們所關(guān)注[6-7],其作用機制包括誘導(dǎo)抗性、拮抗、競爭、重寄生、促生等?,F(xiàn)階段雖有一些菌株被用于防治草莓炭疽病,但高效的生防資源依然不足,更多有拮抗效果的菌劑產(chǎn)品及其應(yīng)用技術(shù)亟待開發(fā)。

        本研究通過采集鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)草莓產(chǎn)區(qū)草莓炭疽病病株,并對病原真菌進行分離培養(yǎng),結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)準確鑒定其種類,初步明確了鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)草莓炭疽病病原真菌類型。同時,為了篩選拮抗草莓炭疽病的生防菌株,選擇29株內(nèi)生真菌菌株進行平板對峙試驗,以期為草莓炭疽病的生物防治提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        發(fā)病草莓植株于2022年6月采自江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)草莓露天苗圃,草莓品種為紅顏。拮抗菌株是筆者所在實驗室前期分離自健康草莓植株內(nèi)的內(nèi)生真菌,包括ZJ5、ZJ6、ZJ7、ZJ8、ZJ11、ZJ14、ZJ17、ZJ28、ZJ33、ZJ36、ZJ41、ZJ42、ZJ45、ZJ47、ZJ49、ZJ51、ZJ52、ZJ63、ZJ66、ZJ72、ZJ75、ZJ77、ZJ79、ZJ81、ZJ93、ZJ95、ZJ99、ZJ101和ZJ107,共29株。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 草莓炭疽病病原真菌分離、純化 采用組織分離法分離草莓病株上的病原真菌[8-10]。在無菌操作條件下,用剪刀剪取發(fā)病植株病健交界處的組織(約5 mm×5 mm),先放入75%乙醇中浸泡30 s,再用2%次氯酸鈉浸泡2 min,最后使用無菌水連續(xù)漂洗3次,用滅菌濾紙片吸干表面水分后,用無菌操作法將病組織小塊移至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),每皿放置5塊組織塊,用封口膜封口,于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3~5 d。待發(fā)病組織長出菌絲后,用無菌操作法挑取菌落邊緣菌絲連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的PDA平板上,進一步純化培養(yǎng)。觀察菌落的生長情況,挑取菌落邊緣的菌絲制成玻片,在顯微鏡下觀察是否為單一菌落,如果觀察到的是單一菌落則獲得純培養(yǎng),若菌落不單一,則需要重復(fù)此步驟,直至獲得純培養(yǎng)。

        1.2.2 病原真菌鑒定

        形態(tài)學(xué)鑒定:用PDA培養(yǎng)基于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)草莓炭疽病病原真菌5~7 d,逐日觀察菌落形狀、大小和顏色等。并挑取邊緣菌絲制成臨時玻片,用顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子等形態(tài)特征,初步確定病原真菌種類。

        分子鑒定:待病原真菌長滿培養(yǎng)皿后,刮取表面菌絲加入液氮充分研磨,按照DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN DNAsecure Plant Kit)操作說明來提取病原真菌基因組DNA,并將DNA產(chǎn)物放于-20 ℃保存,以防DNA降解。

        采取通用引物ITS1和ITS4對真菌ITS區(qū)域進行PCR擴增。30 μL擴增體系包括:15 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix (+dye),1 μL正向引物(5 μmol/L),1 μL反向引物(5 μmol/L),1 μL模板DNA溶液和12 μL無菌水。PCR擴增反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火56 ℃ 45 s,延伸72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃繼續(xù)延伸 10 min。對于鐮孢菌屬物種,筆者擴增了翻譯延伸因子EF-1α區(qū)域進行確認,對于炭疽菌屬物種,筆者分別擴增了鈣調(diào)蛋白基因(calmodulin,CAL)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、幾丁質(zhì)合成酶A基因(chitin synthase 1,CHS-1)、肌動蛋白基因(actin,ACT)和β-微管蛋白基因(beta-tubulin,TUB)進行確認[11-14](表1)。對PCR產(chǎn)物進行擴增測序,并與NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行BLAST比對,以確定病原真菌種類。

        1.2.3 致病性測定

        采用創(chuàng)傷接種法進行致病性測定,先用草莓組培苗接種所有分離到的真菌菌株,后根據(jù)發(fā)病情況在草莓葉片接種病原真菌。首先,準備2個滅菌托盤,各鋪上2層無菌紗布并用無菌水濕潤。選擇長勢一致、健康的草莓組培苗,用75%乙醇進行表面消毒,用滅菌接種針輕刺組培苗,切取在25 ℃下培養(yǎng)3 d的炭疽菌菌絲塊(約 3 mm2),用無菌接種針將菌絲塊貼在創(chuàng)口處,用無菌濕潤吸水紙包裹,外面再用無菌錫箔紙包緊,放置在一個托盤中,另一個托盤中的草莓在創(chuàng)口處貼一塊空白PDA培養(yǎng)基(約3 mm2)為對照,設(shè)3個重復(fù)。用保鮮膜密封,放在25 ℃下進行培養(yǎng),觀察發(fā)病情況。

        葉片接種法為選取新鮮完整的健康草莓葉片,清洗,用75%乙醇表面消毒后放置在滅過菌的托盤中,底層鋪上無菌水潤濕的無菌紗布來保濕。用滅菌的接種針在草莓葉片兩邊各輕扎幾下以造成創(chuàng)傷,便于病原菌侵入。切取在25 ℃培養(yǎng)3 d的炭疽菌菌絲塊(約3 mm2),用無菌接種針放置在葉片兩邊的傷口上,以接種空白PDA培養(yǎng)基(約3 mm2)為對照,最后用無菌水浸濕過的脫脂棉保濕,并設(shè)置3組重復(fù),托盤用保鮮膜密封,置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng),觀察發(fā)病情況。

        1.2.4 拮抗菌株的篩選

        1.2.4.1 拮抗菌的初篩

        采用PDA平板對峙法進行初篩:用直徑5 mm的打孔器在培養(yǎng)5 d后的炭疽病原真菌菌落邊緣打孔,并將菌餅接入直徑為9 cm的PDA培養(yǎng)基一端,菌絲面與培養(yǎng)基接觸。同樣操作將拮抗菌用打孔器打孔后,菌餅(直徑5 mm)接入培養(yǎng)基另一端,2個菌餅間相距4 cm。以將草莓炭疽病原真菌菌餅單獨接入空白PDA平板作為對照,放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。5 d后測量病原真菌菌落半徑,篩選出有抑制效果的拮抗菌株進行復(fù)篩。

        1.2.4.2 拮抗菌的復(fù)篩

        將篩選出的拮抗菌株重復(fù)上述操作,即在直徑為9 cm含有15 mL PDA培養(yǎng)基的平板距離邊緣2 cm處分別對稱接種培養(yǎng)5 d的炭疽病原真菌和具有拮抗效果的拮抗菌株菌餅(直徑5 mm),以只接種病原真菌菌株菌餅的平板作為對照。每個處理設(shè)置3次重復(fù),25 ℃、黑暗條件下進行培養(yǎng)。5 d后測量病原真菌菌落半徑并計算抑制率。

        抑制率=(對照組菌落半徑-處理組菌落半徑)/對照組菌落半徑×100%。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 炭疽病的發(fā)病癥狀

        葉片染病時常呈黑色,形狀不一。匍匐莖、葉柄感病初期出現(xiàn)直徑3~7 mm的黑色紡錘形或橢圓形病斑,稍凹陷,蔓延后葉柄和匍匐莖折斷;當匍匐莖和葉柄上的病斑擴展成為環(huán)形圈時,病斑以上部分萎蔫枯死,切斷根莖,從橫斷面上可看到從邊緣向內(nèi)部擴大的紅褐色壞死斑(圖1),隨著病情加重,則全株枯死。

        2.2 病原真菌鑒定

        形態(tài)學(xué)鑒定:病原真菌菌株接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),其菌落一般呈地毯狀生長,無褶皺。形態(tài)初期菌絲為白色,培養(yǎng)后期菌絲逐漸由白色變灰,整齊,并產(chǎn)生暗黃色分生孢子堆,分生孢子兩端鈍圓,無色,光滑,圓柱狀(圖2)。鑒定結(jié)果基本符合魏景超關(guān)于刺盤孢菌屬(炭疽菌)的分類標準[15],初步表明該病原菌為炭疽菌。

        分子鑒定:從草莓植株發(fā)病部位共分離純化獲得21株真菌菌株,分別命名為D1~D21。通過擴增測序,利用NCBI數(shù)據(jù)庫對擴增序列進行比對,發(fā)現(xiàn)在草莓根部分離到11株真菌,包括6株尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum),2株F. commune,2株暹羅炭疽菌(Colletotrichum siamense)和1株Mucor circinelloides;在莖部分離到4株C. siamense和1株F. oxysporum;在葉部分離到的5株全部是 C. siamense(圖3)。

        2.3 病原真菌致病性測定

        通過將分離到的病原真菌回接草莓組培苗,接種6 d后,發(fā)現(xiàn)20株菌株能侵染草莓,其中D16(Mucor circinelloides)在草莓上不具有致病性,D1、D2、D3、D4、D6、D7、D8、D9、D11、D12、D18、D19、D20和D21共14株發(fā)病較重,D13、D14和D17發(fā)病較輕,且對照組無發(fā)病情況(圖4、表2)。選取致病性較強的D8和D19這2株菌株進行葉片接種,2 d后,發(fā)病癥狀如圖5所示,左側(cè)為對照。通過對比觀察發(fā)現(xiàn),C. siamense能夠在草莓上引起與田間相似的病害癥狀。重新對發(fā)病植株進行病原菌分離,經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)與接種菌為同一真菌,根據(jù)柯赫氏法則,說明C. siamense為草莓致病菌。

        2.4 拮抗菌篩選結(jié)果

        將筆者所在實驗室前期分離得到的29株草莓內(nèi)生真菌分別與D8和D19這2株C. siamense做平板對峙試驗,通過初篩,發(fā)現(xiàn)17株內(nèi)生真菌菌株對D8和D19這2株C. siamense表現(xiàn)出不同程度的拮抗。通過復(fù)篩,發(fā)現(xiàn)Z72、Z79、Z52、Z107和Z101拮抗效果較好,抑菌率達66%~79%,其中Z72對D8和D19的抑菌率分別達到了74.07%、79.82%(圖6、圖7)。經(jīng)鑒定,這5株拮抗內(nèi)生菌均屬于木霉屬(Trichoderma)真菌。

        3 結(jié)論與討論

        目前,國內(nèi)外報道的草莓炭疽病主要是由膠孢炭疽菌(C. gloeosporioides)、尖孢炭疽菌(C. acutatum)和草莓炭疽菌(C. fragariae)侵染草莓所引起的病害[16-21]。近年來,關(guān)于暹羅炭疽菌(C. siamense)侵染草莓也時有報道[22-24]。本試驗對鎮(zhèn)江丹徒區(qū)草莓產(chǎn)區(qū)采集的草莓植株病害樣品進行組織分離,共獲得21株病原真菌菌株,經(jīng)致病性測定,并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的鑒定方法,明確了鎮(zhèn)江丹徒區(qū)草莓產(chǎn)區(qū)草莓炭疽病的致病菌為暹羅炭疽菌(C. siamense)。

        目前草莓炭疽病仍以化學(xué)藥劑防治為主,但易造成化學(xué)殘留和環(huán)境污染,還會使炭疽菌的抗藥性增加。據(jù)報道,多次使用多菌靈和乙霉威等化學(xué)藥劑可致病原菌抗性高達90%以上[25]。利用拮抗生防菌可以規(guī)避以上問題且安全高效,利于環(huán)境的保護,已逐漸成為防治草莓炭疽病的首選措施。本試驗從健康草莓植株分離獲得29株內(nèi)生菌,以 C. siamense 為靶標病原菌,采用平板對峙法將所得29株內(nèi)生菌進行初篩和復(fù)篩,獲得有拮抗作用的菌株17株,其中5株對C. siamense有較強的拮抗效果,經(jīng)鑒定這5株菌株均為木霉屬真菌。

        已有研究表明棘孢木霉(T. asperellum) GYSW-6m1對草莓炭疽菌LC0220的抑制率高達79.03%,具有顯著的防治效果[26]。毛雪琴等報道的黃藍狀菌菌株MT-06對草莓炭疽病菌的抑制率也達到了70%以上[27]。本試驗通過平板對峙法篩選出的Z72對草莓炭疽病病原菌(C. siamense)的抑制率達到了76.95%。說明該菌株對草莓炭疽病菌具有良好的拮抗作用,具有一定的實際應(yīng)用潛力,為進一步田間應(yīng)用提供了理論支持。

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