楊洪俊 張旭 陳佳佳 孫朋朋 張石林 王鈞銘 王媛花 顏志明

摘要：草莓炭疽病是近幾年草莓生產(chǎn)中的主要病害之一，危害性大、毀滅性強。為明確江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)草莓炭疽病病原菌種類，并篩選對其有效的拮抗菌株，從丹徒區(qū)草莓露天苗圃采集炭疽病發(fā)病植株，采用組織分離法對病原真菌進行分離，通過致病性測定，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)準確鑒定其種類，并以此為靶標病原菌，通過平板對峙法篩選拮抗菌株。 結(jié)果表明，從草莓植株發(fā)病部位共分離獲得11株暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense），其中，從根部分離得到2株（D13、D19）、莖部4株（D1、D2、D11、D12）、葉部5株（D8、D9、D10、D20、D21）。經(jīng)柯赫氏法則驗證，C. siamense 為草莓炭疽病病原真菌，其中D8和D19這2株C. siamense致病性較強。從健康草莓植株內(nèi)分離獲得29株內(nèi)生真菌，以D8和D19作為指示菌，通過平板對峙試驗篩選出5株拮抗效果較好的生防菌株，分別為Z72、Z79、Z52、Z107和Z101，其抑菌率均達到了60%以上，其中Z72對D8和D19的抑菌率分別達到了74.07%、79.82%。經(jīng)鑒定，這5株拮抗菌均為木霉屬真菌（Trichoderma spp.）。暹羅炭疽菌為丹徒區(qū)草莓炭疽病主要病原菌，具有較強的致病性，草莓內(nèi)生真菌可為草莓炭疽病微生物防治提供重要資源。

關(guān)鍵詞：草莓炭疽病；病原真菌；分離鑒定；致病性；拮抗菌

中圖分類號：S436.68+4? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）03-0147-06

我國是世界上最大的草莓生產(chǎn)國，草莓種植面積占比全球近1/3。草莓生產(chǎn)具有周期短、見效快、效益高、果品無公害等特點。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展以及人們生活水平的提高，市場上對草莓的需求量變大，也吸引越來越多的人種植草莓。而草莓炭疽病是草莓生產(chǎn)過程中的主要病害之一［1-2］。1931年Brooks首次報道草莓炭疽病，該病主要危害草莓的匍匐莖、葉柄、根冠、花及果實等［3］。尤其是密閉的草莓棚及高溫高濕環(huán)境等利于草莓炭疽病的發(fā)生，導(dǎo)致草莓減產(chǎn)25%～30%，在草莓育苗期和定植初期，發(fā)病率有時高達80%，嚴重時造成草莓苗大面積凋萎枯死，嚴重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)［4］。

目前，除種植一些高抗品種外，草莓炭疽病仍以化學(xué)藥劑防治為主，但隨著病原菌抗藥性的不斷增強，殺菌劑防治炭疽菌的效果都不太理想且易污染環(huán)境，不利于我國綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展［5］。目前生物防治技術(shù)是國際上競相開發(fā)的新技術(shù)，因其綠色、安全等特點，越來越為人們所關(guān)注［6-7］，其作用機制包括誘導(dǎo)抗性、拮抗、競爭、重寄生、促生等?，F(xiàn)階段雖有一些菌株被用于防治草莓炭疽病，但高效的生防資源依然不足，更多有拮抗效果的菌劑產(chǎn)品及其應(yīng)用技術(shù)亟待開發(fā)。

本研究通過采集鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)草莓產(chǎn)區(qū)草莓炭疽病病株，并對病原真菌進行分離培養(yǎng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)準確鑒定其種類，初步明確了鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)草莓炭疽病病原真菌類型。同時，為了篩選拮抗草莓炭疽病的生防菌株，選擇29株內(nèi)生真菌菌株進行平板對峙試驗，以期為草莓炭疽病的生物防治提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)病草莓植株于2022年6月采自江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)草莓露天苗圃，草莓品種為紅顏。拮抗菌株是筆者所在實驗室前期分離自健康草莓植株內(nèi)的內(nèi)生真菌，包括ZJ5、ZJ6、ZJ7、ZJ8、ZJ11、ZJ14、ZJ17、ZJ28、ZJ33、ZJ36、ZJ41、ZJ42、ZJ45、ZJ47、ZJ49、ZJ51、ZJ52、ZJ63、ZJ66、ZJ72、ZJ75、ZJ77、ZJ79、ZJ81、ZJ93、ZJ95、ZJ99、ZJ101和ZJ107，共29株。

1.2 試驗方法

1.2.1 草莓炭疽病病原真菌分離、純化 采用組織分離法分離草莓病株上的病原真菌［8-10］。在無菌操作條件下，用剪刀剪取發(fā)病植株病健交界處的組織（約5 mm×5 mm），先放入75%乙醇中浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉浸泡2 min，最后使用無菌水連續(xù)漂洗3次，用滅菌濾紙片吸干表面水分后，用無菌操作法將病組織小塊移至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每皿放置5塊組織塊，用封口膜封口，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d。待發(fā)病組織長出菌絲后，用無菌操作法挑取菌落邊緣菌絲連同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的PDA平板上，進一步純化培養(yǎng)。觀察菌落的生長情況，挑取菌落邊緣的菌絲制成玻片，在顯微鏡下觀察是否為單一菌落，如果觀察到的是單一菌落則獲得純培養(yǎng)，若菌落不單一，則需要重復(fù)此步驟，直至獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 病原真菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：用PDA培養(yǎng)基于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)草莓炭疽病病原真菌5～7 d，逐日觀察菌落形狀、大小和顏色等。并挑取邊緣菌絲制成臨時玻片，用顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子等形態(tài)特征，初步確定病原真菌種類。

分子鑒定：待病原真菌長滿培養(yǎng)皿后，刮取表面菌絲加入液氮充分研磨，按照DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN DNAsecure Plant Kit）操作說明來提取病原真菌基因組DNA，并將DNA產(chǎn)物放于-20 ℃保存，以防DNA降解。

采取通用引物ITS1和ITS4對真菌ITS區(qū)域進行PCR擴增。30 μL擴增體系包括：15 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix （+dye），1 μL正向引物（5 μmol/L），1 μL反向引物（5 μmol/L），1 μL模板DNA溶液和12 μL無菌水。PCR擴增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸 10 min。對于鐮孢菌屬物種，筆者擴增了翻譯延伸因子EF-1α區(qū)域進行確認，對于炭疽菌屬物種，筆者分別擴增了鈣調(diào)蛋白基因（calmodulin，CAL）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、幾丁質(zhì)合成酶A基因（chitin synthase 1，CHS-1）、肌動蛋白基因（actin，ACT）和β-微管蛋白基因（beta-tubulin，TUB）進行確認［11-14］（表1）。對PCR產(chǎn)物進行擴增測序，并與NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST比對，以確定病原真菌種類。

1.2.3 致病性測定

采用創(chuàng)傷接種法進行致病性測定，先用草莓組培苗接種所有分離到的真菌菌株，后根據(jù)發(fā)病情況在草莓葉片接種病原真菌。首先，準備2個滅菌托盤，各鋪上2層無菌紗布并用無菌水濕潤。選擇長勢一致、健康的草莓組培苗，用75%乙醇進行表面消毒，用滅菌接種針輕刺組培苗，切取在25 ℃下培養(yǎng)3 d的炭疽菌菌絲塊（約 3 mm2），用無菌接種針將菌絲塊貼在創(chuàng)口處，用無菌濕潤吸水紙包裹，外面再用無菌錫箔紙包緊，放置在一個托盤中，另一個托盤中的草莓在創(chuàng)口處貼一塊空白PDA培養(yǎng)基（約3 mm2）為對照，設(shè)3個重復(fù)。用保鮮膜密封，放在25 ℃下進行培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

葉片接種法為選取新鮮完整的健康草莓葉片，清洗，用75%乙醇表面消毒后放置在滅過菌的托盤中，底層鋪上無菌水潤濕的無菌紗布來保濕。用滅菌的接種針在草莓葉片兩邊各輕扎幾下以造成創(chuàng)傷，便于病原菌侵入。切取在25 ℃培養(yǎng)3 d的炭疽菌菌絲塊（約3 mm2），用無菌接種針放置在葉片兩邊的傷口上，以接種空白PDA培養(yǎng)基（約3 mm2）為對照，最后用無菌水浸濕過的脫脂棉保濕，并設(shè)置3組重復(fù)，托盤用保鮮膜密封，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

1.2.4 拮抗菌株的篩選

1.2.4.1 拮抗菌的初篩

采用PDA平板對峙法進行初篩：用直徑5 mm的打孔器在培養(yǎng)5 d后的炭疽病原真菌菌落邊緣打孔，并將菌餅接入直徑為9 cm的PDA培養(yǎng)基一端，菌絲面與培養(yǎng)基接觸。同樣操作將拮抗菌用打孔器打孔后，菌餅（直徑5 mm）接入培養(yǎng)基另一端，2個菌餅間相距4 cm。以將草莓炭疽病原真菌菌餅單獨接入空白PDA平板作為對照，放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。5 d后測量病原真菌菌落半徑，篩選出有抑制效果的拮抗菌株進行復(fù)篩。

1.2.4.2 拮抗菌的復(fù)篩

將篩選出的拮抗菌株重復(fù)上述操作，即在直徑為9 cm含有15 mL PDA培養(yǎng)基的平板距離邊緣2 cm處分別對稱接種培養(yǎng)5 d的炭疽病原真菌和具有拮抗效果的拮抗菌株菌餅（直徑5 mm），以只接種病原真菌菌株菌餅的平板作為對照。每個處理設(shè)置3次重復(fù)，25 ℃、黑暗條件下進行培養(yǎng)。5 d后測量病原真菌菌落半徑并計算抑制率。

抑制率=（對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對照組菌落半徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽病的發(fā)病癥狀

葉片染病時常呈黑色，形狀不一。匍匐莖、葉柄感病初期出現(xiàn)直徑3～7 mm的黑色紡錘形或橢圓形病斑，稍凹陷，蔓延后葉柄和匍匐莖折斷；當匍匐莖和葉柄上的病斑擴展成為環(huán)形圈時，病斑以上部分萎蔫枯死，切斷根莖，從橫斷面上可看到從邊緣向內(nèi)部擴大的紅褐色壞死斑（圖1），隨著病情加重，則全株枯死。

2.2 病原真菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：病原真菌菌株接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落一般呈地毯狀生長，無褶皺。形態(tài)初期菌絲為白色，培養(yǎng)后期菌絲逐漸由白色變灰，整齊，并產(chǎn)生暗黃色分生孢子堆，分生孢子兩端鈍圓，無色，光滑，圓柱狀（圖2）。鑒定結(jié)果基本符合魏景超關(guān)于刺盤孢菌屬（炭疽菌）的分類標準［15］，初步表明該病原菌為炭疽菌。

分子鑒定：從草莓植株發(fā)病部位共分離純化獲得21株真菌菌株，分別命名為D1～D21。通過擴增測序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫對擴增序列進行比對，發(fā)現(xiàn)在草莓根部分離到11株真菌，包括6株尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum），2株F. commune，2株暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）和1株Mucor circinelloides；在莖部分離到4株C. siamense和1株F. oxysporum；在葉部分離到的5株全部是 C. siamense（圖3）。

2.3 病原真菌致病性測定

通過將分離到的病原真菌回接草莓組培苗，接種6 d后，發(fā)現(xiàn)20株菌株能侵染草莓，其中D16（Mucor circinelloides）在草莓上不具有致病性，D1、D2、D3、D4、D6、D7、D8、D9、D11、D12、D18、D19、D20和D21共14株發(fā)病較重，D13、D14和D17發(fā)病較輕，且對照組無發(fā)病情況（圖4、表2）。選取致病性較強的D8和D19這2株菌株進行葉片接種，2 d后，發(fā)病癥狀如圖5所示，左側(cè)為對照。通過對比觀察發(fā)現(xiàn)，C. siamense能夠在草莓上引起與田間相似的病害癥狀。重新對發(fā)病植株進行病原菌分離，經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)與接種菌為同一真菌，根據(jù)柯赫氏法則，說明C. siamense為草莓致病菌。

2.4 拮抗菌篩選結(jié)果

將筆者所在實驗室前期分離得到的29株草莓內(nèi)生真菌分別與D8和D19這2株C. siamense做平板對峙試驗，通過初篩，發(fā)現(xiàn)17株內(nèi)生真菌菌株對D8和D19這2株C. siamense表現(xiàn)出不同程度的拮抗。通過復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)Z72、Z79、Z52、Z107和Z101拮抗效果較好，抑菌率達66%～79%，其中Z72對D8和D19的抑菌率分別達到了74.07%、79.82%（圖6、圖7）。經(jīng)鑒定，這5株拮抗內(nèi)生菌均屬于木霉屬（Trichoderma）真菌。

3 結(jié)論與討論

目前，國內(nèi)外報道的草莓炭疽病主要是由膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）和草莓炭疽菌（C. fragariae）侵染草莓所引起的病害［16-21］。近年來，關(guān)于暹羅炭疽菌（C. siamense）侵染草莓也時有報道［22-24］。本試驗對鎮(zhèn)江丹徒區(qū)草莓產(chǎn)區(qū)采集的草莓植株病害樣品進行組織分離，共獲得21株病原真菌菌株，經(jīng)致病性測定，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的鑒定方法，明確了鎮(zhèn)江丹徒區(qū)草莓產(chǎn)區(qū)草莓炭疽病的致病菌為暹羅炭疽菌（C. siamense）。

目前草莓炭疽病仍以化學(xué)藥劑防治為主，但易造成化學(xué)殘留和環(huán)境污染，還會使炭疽菌的抗藥性增加。據(jù)報道，多次使用多菌靈和乙霉威等化學(xué)藥劑可致病原菌抗性高達90%以上［25］。利用拮抗生防菌可以規(guī)避以上問題且安全高效，利于環(huán)境的保護，已逐漸成為防治草莓炭疽病的首選措施。本試驗從健康草莓植株分離獲得29株內(nèi)生菌，以 C. siamense 為靶標病原菌，采用平板對峙法將所得29株內(nèi)生菌進行初篩和復(fù)篩，獲得有拮抗作用的菌株17株，其中5株對C. siamense有較強的拮抗效果，經(jīng)鑒定這5株菌株均為木霉屬真菌。

已有研究表明棘孢木霉（T. asperellum） GYSW-6m1對草莓炭疽菌LC0220的抑制率高達79.03%，具有顯著的防治效果［26］。毛雪琴等報道的黃藍狀菌菌株MT-06對草莓炭疽病菌的抑制率也達到了70%以上［27］。本試驗通過平板對峙法篩選出的Z72對草莓炭疽病病原菌（C. siamense）的抑制率達到了76.95%。說明該菌株對草莓炭疽病菌具有良好的拮抗作用，具有一定的實際應(yīng)用潛力，為進一步田間應(yīng)用提供了理論支持。

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