周廣泉,李 堃,季 瑜

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是常見的慢性炎性疾病,可表現為腹瀉和血便等。近年研究顯示,UC在全球范圍內發(fā)病率逐漸升高,已發(fā)展為一個影響全球人群健康的醫(yī)療難題[1]。UC發(fā)病機制和病因現尚不明確。雖有報道證明,其與遺傳易感性、炎性損傷、自噬、腸屏障損傷和腸道菌群失衡等有關,但病程較長,易反復發(fā)作,治愈難度大,嚴重時可進展為結腸癌[2]。對UC西醫(yī)主要采用免疫抑制劑和糖皮質激素等進行治療,但由于存在較多不良反應、遠期療效差等原因,不能滿足臨床需要。隨著現代中醫(yī)的發(fā)展,中醫(yī)治療UC已顯現出獨特優(yōu)勢[3]。潰結靈由黃芪、制大黃、絲瓜絡和珍珠粉組成,是我院季瑜主任治療UC的經驗方,在臨床治療UC方面具有明顯效果。雖然已有研究顯示,潰結靈可改善UC大鼠腸黏膜屏障,提高結腸組織抗炎能力[4-5],但該研究采用的潰結靈與我院潰結靈組方不同。Toll樣受體4(TLR4)-核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NOD)信號通路通過介導炎癥反應參與多種炎性疾病發(fā)展,如UC[6]。目前,臨床上關于我院潰結靈與TLR4-NOD信號通路對UC大鼠影響的研究未見報道。因此,本研究探究潰結靈通過調節(jié)TLR4-NOD信號通路對UC大鼠腸黏膜修復和腸道自噬的影響,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SD大鼠均購自江蘇珂瑪麒生物科技有限公司,生產許可證SYXK(蘇)2021-0060,體質量180～220 g,6～8周齡,雌雄各半,所有動物在黑暗和光照周期各12 h,恒濕(50±10)%,恒溫(23±2)℃下飼養(yǎng),自由進食和飲水。本研究經海安市中醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(HZYLL2021-009)。

1.2 主要試劑

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)購于美國Sigma公司;D-乳酸(D-LAC)試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司;二胺氧化酶(DAO)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)購自上海酶研生物科技有限公司;結腸組織自噬相關蛋白1(Beclin1)抗體、自噬相關基因5(ATG5)抗體、TLR4抗體、Toll樣受體2(TLR2)抗體、NOD樣受體蛋白3(NLPR3)抗體及內參β-actin購自英國Abcam公司。

1.3 潰結靈制備

組方為黃芪130 g、制大黃100 g、絲瓜絡100 g、珍珠粉10 g,稱取藥材加10倍水煎煮1 h,過濾后藥渣加5倍水煎煮1 h,過濾后合并濾液,水浴濃縮成含生藥2 g/mL藥液。成人用藥3.6 g/d,體質量以60 kg估算,劑量為0.06 g/kg,根據轉換公式和劑量系數計算出大鼠劑量為0.37 g/kg,低中高劑量按成人5、10、20倍計算,即1.85、3.70、7.40 g/kg。

1.4 動物建模

選擇48只大鼠建立UC大鼠模型,具體參考文獻[7],TNBS和乙醇溶液經灌腸法制備,大鼠禁食(不禁水)24 h,使用水合氯醛(10%)腹腔麻醉后,將100 mg/kg TNBS和0.25 mL乙醇溶液(50%)用改良版大鼠灌胃針緩慢注入大鼠距肛門7～8 cm腸腔內,注射結束后用手捏住肛門停留數分鐘,防止溶液外漏,保證大鼠腹部呈上傾狀態(tài),注意大鼠保暖。另選取12只大鼠作為正常組,采用同樣方法給予等量生理鹽水灌腸。12 h后觀察造模大鼠出現稀便和血便,表明建模成功。

1.5 動物分組

將48只建模大鼠分為模型組(UC組)和潰結靈低、中、高劑量組,每組12只。建模成功后正常組、UC組大鼠灌胃等量生理鹽水,潰結靈低、中、高劑量組大鼠灌胃1.85、3.70、7.40 g/kg潰結靈,每日1次,連續(xù)12周。

1.6 病變活動指數(DAI)評分

末次灌胃24 h進行評估。DAI評分從體質量降低、大便形狀和大便隱血或肉眼血便進行評估[8]。體質量下降:降低<1%計0分,1%～<6%計1分,6%～<10%計2分,10%～<15%計3分,≥15%計4分。大便性狀:正常計0分,軟便但成形計2分,軟便不成形計3分,腹瀉計4分。大便隱血或肉眼血便:正常計0分,輕度松散為陰性計1分,稀便但隱血陽性計2分,水樣便但隱血陽性計3分,肉眼血便計4分。DAI=(體質量降低+大便形狀+便隱血或肉眼血便)/3。

1.7 結腸長度和結腸黏膜損傷指數(CMDI)評分

末次給藥后48 h麻醉脫頸處死大鼠,并進行解剖,取小鼠盲腸至肛門端結腸,鋪在白紙上,直尺測量結腸長度。測量結束后,沿腸系膜側線縱向剪開,經預冷磷酸鹽緩沖液沖洗,濾紙吸干水分,平放白紙上,觀察大鼠結腸損傷情況[9]:無損傷計0分,局部水腫但無潰瘍計1分,有1處潰瘍計2分,有2處潰瘍計3分,有多處潰瘍且長度累計<1 cm計4分,有多處潰瘍且至少1處長度>1 cm計5分。

1.8 血清D-LAC、DAO及尿乳果糖(L)/甘露醇(M)檢測

處死大鼠時取各組大鼠心臟血液5 mL,以3 000 r /min離心10 min后收集上清液,按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒操作步驟檢測血清D-LAC和DAO。各組大鼠末次給藥后24 h,取L、M各2 mL灌胃大鼠,收集大鼠24 h尿液,以3 000 r /min離心10 min,取10 mL并加2 mL硫柳汞防腐(0.2 g/L),用高效液相色譜分析法檢測L和M,計算尿L/M。

1.9 血清和結腸組織TNF-α檢測

血清制備:處死大鼠時取各組大鼠心臟血液5 mL,以3 000 r/min離心10 min后取上清液;結腸組織制備:處死大鼠時取1 cm結腸(肛門2 cm處向上取結腸)組織,剪碎后制備勻漿液,經3 000 r/min離心10 min后取上清液。采用雙抗體夾心法測定血清和結腸組織TNF-α。

1.10 Western blot法檢測結腸組織Beclin1、ATG5、TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達

處死大鼠時取大鼠結腸組織0.1 g制備各組大鼠結腸組織勻漿液,并加入蛋白裂解液,以BCA法對蛋白進行定量檢測,將蛋白與上樣緩沖液混合后,行12%凝膠電泳處理(每個槽孔內加40 μg),用半干法迅速轉移至NC膜上,封閉培養(yǎng)1 h,加一抗Beclin1、ATG5、TLR4、TLR2、NLPR3及內參β-actin在4 ℃下過夜孵育,次日加HRP標記羊抗兔二抗室溫下孵育1 h,最后加顯色試劑用于顯影、定影,凝膠系統(tǒng)拍照后,分析蛋白條帶密度值。

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般情況比較

實驗過程中,正常組大鼠飲食飲水正常、體質量逐漸升高,且大鼠毛發(fā)光澤、活動敏捷,未出現稀便情況、肛門周圍潔凈;UC組大鼠食欲降低,出現懶動、精神萎靡,體質量降低,且出現血便、稀便等情況,大便松散;經過12周治療后,潰結靈低、中、高劑量組大鼠隨著藥物劑量增加、治療時間延長,飲食出現明顯好轉,體質量逐步增加,腹瀉癥狀改善明顯。

2.2 大鼠DAI評分結果比較

治療1、2、6和12周,5組大鼠DAI評分總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與正常組比較,治療1、2、6和12周UC組DAI評分升高;與UC組比較,治療1、2、6和12周潰結靈低、中、高劑量組DAI評分降低;與潰結靈低劑量組比較,治療1、2、6和12周潰結靈中、高劑量組DAI評分降低;與潰結靈中劑量組比較,治療1、2、6和12周潰結靈高劑量組DAI評分降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠不同時間點DAI評分比較分)

2.3 大鼠結腸長度和CMDI評分比較

與正常組比較,UC組結腸長度縮短,CMDI評分升高;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組結腸長度延長,CMDI評分降低;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組結腸長度延長,CMDI評分降低;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組結腸長度延長,CMDI評分降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠結腸長度和CMDI評分比較

2.4 大鼠血清D-LAC、DAO及尿L/M比較

與正常組比較,UC組血清D-LAC、DAO及尿L/M升高;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組血清D-LAC、DAO及尿L/M降低;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組血清D-LAC、DAO及尿L/M降低;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組血清D-LAC、DAO及尿L/M降低(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠血清D-LAC、DAO及尿L/M比較

2.5 大鼠血清和結腸組織TNF-α比較

與正常組比較,UC組血清和結腸組織TNF-α升高;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組血清和結腸組織TNF-α降低;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組血清和結腸組織TNF-α降低;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組血清和結腸組織TNF-α降低(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠血清和結腸組織TNF-α比較

2.6 大鼠結腸組織Beclin1和ATG5表達比較

與正常組比較,UC組結腸組織Beclin1和ATG5表達減少;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組結腸組織Beclin1和ATG5表達增加;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組結腸組織Beclin1和ATG5表達增加;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組結腸組織Beclin1和ATG5表達增加(P<0.05)。見表5和圖1。

Beclin1為自噬相關蛋白1,ATG5為自噬相關基因5,UC為潰瘍性結腸炎。

表5 5組大鼠結腸組織Beclin1和ATG5表達比較

2.7 大鼠結腸組織TLR4-NOD信號通路相關蛋白比較

與正常組比較,UC組結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達增加;與UC組比較,潰結靈低、中、高劑量組結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達減少;與潰結靈低劑量組比較,潰結靈中、高劑量組結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達減少;與潰結靈中劑量組比較,潰結靈高劑量組結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達減少(P<0.05)。見表6和圖2。

TLR4為Toll樣受體4,TLR2為Toll樣受體2,NLPR3為NOD樣受體蛋白3,UC為潰瘍性結腸炎。

表6 5組大鼠結腸組織TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表達比較

3 討論

UC是炎性腸道疾病,腸道免疫炎癥反應失衡和腸黏膜屏障損傷與UC發(fā)生發(fā)展密切相關[10]?，F臨床治療UC多以西醫(yī)為主,雖然可改善患者腸道屏障功能,并減輕炎癥反應,但治療后可在一定時間內復發(fā)[11]。中醫(yī)將UC歸為“痢疾”“泄瀉”“腸癖”等范疇,多因脾胃虛弱、或飲食不節(jié)、或憂思惱怒等致脾胃損傷,蘊結于腸道,在腸道相互裹挾,致腸道傳導失司、氣血壅滯、腸絡受損,下痢膿血、反復發(fā)作[12]。UC病位在腎、脾、大腸,病初多為濕熱內蘊,腸道氣機阻滯病久入絡,久病入腎,而出現脾腎陽虛及寒熱虛實夾雜之證,病機總屬本虛標實[13]。本研究所采用潰結靈主要由黃芪、制大黃、絲瓜絡和珍珠粉組成,黃芪可解毒排膿、利水消腫,制大黃可瀉熱通便、化瘀止血,絲瓜絡可祛風通絡,珍珠粉可養(yǎng)血安神、鎮(zhèn)心定驚,諸藥合用可共奏清熱涼血解毒之功效?，F代藥理實驗顯示,黃芪主要成分黃芪多糖可改善UC腸黏膜損傷[14]。大黃中含蒽醌類化合物,含有蒽醌類成分的中藥制劑在臨床上廣泛使用,以番瀉苷、大黃酸和大黃素為主。已有研究報道顯示,大黃酸對葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎有明顯緩解作用[15]。珍珠粉治療UC效果也非常明顯[16]。由以上論述可見潰結靈治療UC效果確切。

本研究使用TNBS和乙醇溶液給大鼠灌腸,發(fā)現UC大鼠腸黏膜明顯損傷,有明顯血便、稀便、體質量降低等現象,且治療不同時間大鼠DAI評分明顯升高。CMDI評分、血清D-LAC和DAO及尿L/M是腸屏障功能受損常用標志物,正常情況下血清中D-LAC和DAO含量較少,尿L/M較低,若腸道出現明顯損傷可促進血清D-LAC、DAO和尿L/M值升高[7]。本研究發(fā)現,不同劑量潰結靈灌胃UC大鼠后,可明顯降低不同時間DAI評分,并降低CMDI評分及血清D-LAC、DAO和尿L/M,這與王慧等[7]研究結果相似?？梢姖⒔Y靈可明顯改善UC大鼠腸黏膜屏障功能,有助于腸黏膜修復。

炎癥反應在UC病理機制中起關鍵作用,表現為促炎性因子和抗炎性因子釋放失衡,造成TNF-α等因子分泌增加,加重腸黏膜損傷程度[17]。目前,有研究報道,自噬功能障礙可破壞腸道穩(wěn)態(tài)、影響腸道微生物及促進炎癥反應等,進一步加重腸道黏膜損傷[18]。Beclin1、ATG5是常用自噬相關蛋白或基因,前者是自噬自動蛋白和基因,后者可參與自噬小體合成,對自噬形成起決定作用[19]。本研究結果顯示,UC組血清和結腸組織中TNF-α釋放明顯增加,Beclin1、ATG5表達減少,經過不同劑量潰結靈灌胃后可降低血清和結腸組織TNF-α,增加Beclin1、ATG5表達。表明潰結靈可改善UC大鼠炎癥反應和腸道自噬。

TLRs和NOD為模式識別受體關鍵蛋白家族,通過介導炎癥反應參與疾病進展,TLRs家族成員中TLR4、TLR2是常見因子,TLRs可通過感知病原體中分子模式參與免疫炎癥反應。已有研究報道,TLR4、TLR2在腸黏膜損傷組織中高表達,可通過激活核因子-κB通路、NLRP3炎性小體活性,進而加重結腸炎腸道炎癥反應[20]。本研究發(fā)現,UC組結腸組織TLR4、TLR2、NLPR3蛋白表達增加,潰結靈可呈劑量效應關系減少TLR4、TLR2、NLPR3蛋白表達,與上述報道相符。說明潰結靈對UC大鼠炎癥反應、腸道屏障功能等作用可能與調節(jié)TLR4-NOD信號通路有關,但具體作用機制尚不清楚,有待進一步探究。

綜上所述,潰結靈可改善UC大鼠腸黏膜屏障功能、腸道自噬,并減輕體內炎癥反應,有利于腸黏膜修復,其作用機制可能與TLR4-NOD信號通路有關,其中高劑量潰結靈效果最為明顯。