錢金梅,胡 彬,張飛娥,楊 奇,朱雯雪,張佳玲,蔡 巖

0引言

干眼(dry eye disease,DED)指淚液分泌異常或者淚膜穩(wěn)定性下降并伴隨組織受損和神經(jīng)系統(tǒng)功能的變化,從而引起各種眼部不適癥狀和(或)視功能障礙的眼表疾病[1],嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。我國干眼患病率不同地區(qū)差異較大[2],西部地區(qū)患病率31.3%,高于其他地區(qū)。其中屬于高原山地性氣候的西藏自治區(qū)和青海省玉樹縣的干眼患病率更是高達(dá)52.4%和59.1%。隨著高原地區(qū)經(jīng)濟和國防的不斷發(fā)展,越來越多的人由于旅游、經(jīng)商或駐守等從平原地區(qū)進(jìn)入高原地區(qū),使得對高原環(huán)境下干眼分類及防治方法的探討有著較為重要的意義。

淚液含有多種分子成分,在異常條件下它們的相對濃度可能會發(fā)生變化,因此,對淚液成分進(jìn)行分析可以非侵入地獲得有關(guān)眼睛健康狀況的重要信息。隨著儀器和數(shù)據(jù)處理方法的進(jìn)步,將各種成分分離方法與高靈敏度的光學(xué)技術(shù)相結(jié)合使淚液成分分析成為可能[3]。拉曼光譜(Raman spectroscopy)技術(shù)具有無損、快速、能原位獲得“分子指紋”信息等優(yōu)點,而且檢測所需的物質(zhì)量少,能夠很好地對淚液中的分子物質(zhì)進(jìn)行檢測分析,因此淚液的拉曼光譜信息成為目前研究的熱點[4-5]。本研究依托新疆軍區(qū)總醫(yī)院西北特殊環(huán)境人工實驗艙模擬高原環(huán)境,旨在探索6 000 m海拔留置不同時長后,淚液相關(guān)指標(biāo)如淚液分泌量、淚河高度(tear meniscus height,TMH)、首次非接觸淚膜破裂時間(first non-invasive tear break-up time,NIBUT-first)、平均非接觸淚膜破裂時間(average non-invasive tear break-up time,NIBUT-average)及相關(guān)組織病理學(xué)改變等,并采用拉曼光譜對高原環(huán)境干預(yù)前后的淚液成分變化進(jìn)行分析,探討高原環(huán)境所致干眼可能的類型,為臨床有針對性地防治高原環(huán)境下干眼提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組標(biāo)準(zhǔn)實驗用清潔級健康成年新西蘭兔18只,體質(zhì)量2-2.5 kg,均由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,按標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查排除眼表疾病,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實驗。本研究通過新疆軍區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會正式審查和批準(zhǔn)(審批號：DWLL20230410),保證動物福利。

采用隨機數(shù)字表法將新西蘭兔分為高原組和對照組,每組9只,兩組雌雄數(shù)均等(5雄4雌)。高原組飼養(yǎng)于新疆軍區(qū)總醫(yī)院西北特殊環(huán)境人工實驗艙,以降低艙內(nèi)氣壓的方式將模擬艙以5 m/s的上升速率升至海撥6 000 m,放置充足的飼料及清潔飲水供其自由攝取,每天中午12點將模擬艙高度降至當(dāng)?shù)睾０?進(jìn)行各項檢查并加食、添水及清理衛(wèi)生,下午1點再將艙內(nèi)高度升至6 000 m。對照組飼養(yǎng)于艙外清潔動物實驗室,其他飼養(yǎng)條件與高原組相同,并與高原組同時段進(jìn)行各項檢查。

1.1.2主要耗材和儀器及試劑淚液分泌檢測濾紙(天津晶明)、無菌玻璃毛細(xì)管(Kimble),小鼠抗兔黏蛋白5AC(mucin 5AC,MUC5AC)抗體(Thermo)、免疫組織化學(xué)染色試劑盒(Elabscience),RHCT-1角膜地形圖儀(安達(dá)斯)、共聚焦拉曼光譜儀(LabRAM HR Evolution,Gora Raman spectroscopy,ideal optics,China)。10%甲醛溶液、石蠟、二甲苯、乙醇、蘇木素、伊紅等病理切片用試劑均由本院動物實驗科提供。

1.2方法為減少各種操作對檢查結(jié)果的影響,先用RHCT-1角膜地形圖儀干眼綜合分析系統(tǒng)進(jìn)行雙眼NIBUT-first、NIBUT-average及TMH檢測,然后采集雙眼淚液以備后續(xù)拉曼光譜分析,最后進(jìn)行無表面麻醉淚液分泌(Schirmer Ⅰ)試驗。

1.2.1淚液指標(biāo)檢測分別于干預(yù)前、干預(yù)3、7 d,2、4 wk在同時間段、地點、環(huán)境下由兩名經(jīng)驗豐富的醫(yī)師完成NIBUT-first、NIBUT-average、TMH檢測及Schirmer Ⅰ試驗。(1)采用RHCT-1角膜地形圖儀干眼綜合分析系統(tǒng)評估NIBUT-first、NIBUT-average及TMH,輔助兔完全瞬目后保持固定不動進(jìn)行雙眼非侵入性淚膜破裂時間檢測,系統(tǒng)自動識別并記錄NIBUT-first和NIBUT-average,觀察40 s;再使用內(nèi)置的紅外線照相功能對雙眼淚河圖像進(jìn)行拍攝,并用系統(tǒng)內(nèi)置的測量工具對瞳孔中央正下方的TMH進(jìn)行測量。重復(fù)測量3次取平均值,連續(xù)測量之間的時間間隔至少為60 s。(2)采用Schirmer Ⅰ試驗評估淚液分泌量,兔固定后將無菌淚液分泌檢測試紙條頭端彎折后從包裝袋內(nèi)取出,在無表面麻醉的情況下置于兔雙眼下結(jié)膜囊中外1/3處,靜置5 min后取出試紙條,記錄試紙條浸潤的長度即為淚液分泌量。

1.2.2拉曼光譜分析

1.2.2.1樣本采集和參數(shù)設(shè)定分別于干預(yù)前、干預(yù)4 wk,將高原組兔固定后,在無眼表面麻醉情況下,采用無菌玻璃毛細(xì)管以虹吸方法在兔下瞼結(jié)膜囊處收集雙眼非刺激性淚液。由于可采集淚液量較少,故將雙眼淚液置于同一玻璃管中進(jìn)行后續(xù)實驗。采用共聚焦拉曼光譜儀在500-2 500/cm范圍內(nèi)測量,半導(dǎo)體激光器激發(fā)波長為785 nm,激光功率為160 mW。采用labspec6軟件進(jìn)行光譜采集和分析,使用10倍物鏡采集每個光譜數(shù)據(jù)。每個淚液樣本在不同位置記錄3次,并獲取每個淚液樣本的平均拉曼光譜用于后續(xù)研究。

1.2.2.2光譜預(yù)處理通常實際采集的拉曼光譜數(shù)據(jù)成分復(fù)雜,除了基本的特征變量之外,還有背景基線、噪聲等信號,通過分析實際拉曼光譜分析技術(shù)發(fā)現(xiàn),檢測對象拉曼光譜數(shù)據(jù)的主要成分來源于采集環(huán)境和設(shè)備所導(dǎo)致的基線,所以在分析建模之前,需要將背景基線濾除,才能從獲得純光譜數(shù)據(jù)中選擇出分析對象對應(yīng)的特征數(shù)據(jù)。本研究使用目前使用最廣的基線校正方法——迭代自適應(yīng)加權(quán)懲罰最小二乘法(adaptive iteratively reweighted penalized least squares,airPLS)對數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正。此外,本研究還對數(shù)據(jù)進(jìn)行了SG(Savitzky-Golay)濾波算法和歸一化處理。原始的淚液拉曼光譜含有噪聲,SG濾波算法對數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑和去噪,可有效濾除高頻噪聲。對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理則可以處理不同樣品的濃度、溫度、壓力等因素對光譜數(shù)據(jù)強度值的影響。

1.2.3組織病理學(xué)檢查于干預(yù)4 wk上述檢測及淚液收集完畢后,采用戊巴比妥鈉沿耳緣靜脈過量注射處死兩組兔,在實驗臺上進(jìn)行常規(guī)無菌操作,摘除兩組兔右眼淚腺、哈氏腺、角膜、下瞼結(jié)膜,用生理鹽水洗凈殘留血液后,立即置于10%甲醛溶液中固定,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察,采集圖像信息,分析組織病理學(xué)變化。

1.2.4MUC5AC在結(jié)膜組織中的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法檢測MUC5AC在結(jié)膜組織中的表達(dá)。將1.2.3獲取的結(jié)膜組織制備的石蠟切片烘烤后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)后按照試劑盒說明進(jìn)行滅活、封閉、孵育及顯色。顯微鏡下觀察及時終止顯色。經(jīng)蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。角膜標(biāo)本作為陰性對照,胃標(biāo)本作為陽性對照。顯微鏡下觀察結(jié)膜組織細(xì)胞內(nèi)MUC5AC的表達(dá),每張切片隨機拍攝高倍鏡(40×10)下5個不重疊視野照片,以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色或深褐色顆粒者為陽性細(xì)胞,應(yīng)用Image J圖像分析軟件測量每張免疫組織化學(xué)圖像平均光密度(average optical density, AOD)值,對MUC5AC的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

2結(jié)果

2.1一般資料對照組和高原組兔性別構(gòu)成相同。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,對照組兔體質(zhì)量為2146.44±134.16 g,高原組兔體質(zhì)量為2209.11±128.16 g,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.013,P>0.05)。

2.2淚液指標(biāo)干預(yù)前,兩組兔NIBUT-first、NIBUT-average、TMH及淚液分泌量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.3淚液分泌量兩組兔不同時間淚液分泌量比較,具有時間差異性、組間差異性和交互效應(yīng)(F時間=6.129,F分組=23.000,F時間×分組=8.516,均P<0.001),見表3。高原組兔干預(yù)3、7 d淚液分泌量均較干預(yù)前降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但干預(yù)3、7 d淚液分泌量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);干預(yù)2 wk淚液分泌量有所增加,且與干預(yù)3、7 d淚液分泌量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);干預(yù)4 wk淚液分泌量繼續(xù)增加,但與干預(yù)前及干預(yù)2 wk淚液分泌量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組兔不同時間淚液分泌量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)3、7 d,2 wk高原組兔淚液分泌量均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);干預(yù)4 wk兩組兔淚液分泌量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3拉曼光譜數(shù)據(jù)分析干預(yù)前、干預(yù)4 wk高原組兔淚液光譜表現(xiàn)出相同的峰位置,并顯示出相似的光譜圖,見圖1。然而,兩者在某些特定位置存在明顯的峰值差異,這些峰值差異是由與樣本相對應(yīng)的生物分子的成分和含量的變化引起的,如干預(yù)前、干預(yù)4 wk高原組兔淚液樣本光譜在777、856、1 195、1 244、1 373、1 857、1 921/cm處存在較為顯著差異,通過查找各峰值對應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)或物質(zhì),發(fā)現(xiàn)磷脂肌醇、脯氨酸、谷氨酸、磷酸鹽、酰胺Ⅲ、脂質(zhì)等較干預(yù)前高,堿基含量較干預(yù)前低,這與高原環(huán)境引起的機體生化和代謝反應(yīng)有關(guān)。

2.4組織病理學(xué)檢查HE染色結(jié)果顯示,與對照組相比,高原組兔結(jié)膜上皮細(xì)胞排列紊亂且層數(shù)減少,杯狀細(xì)胞增多,上皮下組織中毛細(xì)血管擴張充血、纖維細(xì)胞增生;角膜上皮細(xì)胞層厚薄不一,且部分區(qū)域細(xì)胞脫落,基質(zhì)層腫脹伴空泡狀改變,淺層可見新生血管;淚腺上皮細(xì)胞輕度增生,部分腺泡上皮細(xì)胞核濃縮,部分結(jié)構(gòu)不清,間質(zhì)少量毛細(xì)血管擴張充血,細(xì)胞胞漿萎縮扁平;哈氏腺腺體結(jié)構(gòu)不均一,少量毛細(xì)血管輕度擴張充血,見圖2。

表1 兩組兔不同時間NIBUT-first和NIBUT-average比較 [M(P25,P75),s]

表2 兩組兔不同時間TMH比較 [M(P25,P75),mm]

表3 兩組兔不同時間淚液分泌量比較

表3 兩組兔不同時間淚液分泌量比較

組別眼數(shù)干預(yù)前干預(yù)3 d干預(yù)7 d干預(yù)2 wk干預(yù)4 wk對照組1818.67±3.7719.06±2.4119.78±2.6020.06±2.4119.06±5.26高原組1818.33±3.6513.44±2.96a12.56±1.92a16.56±3.99c,e17.94±5.49c,e t0.07338.94489.89410.1480.384P>0.05<0.001<0.001<0.05>0.05

注：aP<0.05 vs 同組干預(yù)前;cP<0.05 vs 同組干預(yù)3 d;eP<0.05 vs 同組干預(yù)7 d。

圖1 干預(yù)前后淚液平均歸一化拉曼光譜圖。

2.5MUC5AC在結(jié)膜組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,對照組兔結(jié)膜上皮內(nèi)散在MUC5AC染色陽性細(xì)胞,形態(tài)飽滿,染色濃密(圖3A);高原組兔結(jié)膜上皮內(nèi)MUC5AC染色陽性細(xì)胞明顯增多,染色更強(圖3B),且與對照組相比,高原組兔結(jié)膜組織中MUC5AC表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.914,P<0.01,圖3C)。

3討論

淚液主要分布于眼表的兩個部位,即穹窿部和眼瞼后方、淚河和淚膜[6]。眼表前淚膜主要分為3層,表面為脂質(zhì)層,中間為水液層,近角膜面為黏蛋白層。生理狀態(tài)下淚膜可以維持眼表微環(huán)境的穩(wěn)定并起到潤滑角膜的作用,從而維持屈光功能。根據(jù)淚液的主要變化成分不同及動力學(xué)因素,2020年《中國干眼專家共識》將干眼分為水液缺乏型、脂質(zhì)異常型、黏蛋白異常型、淚液動力學(xué)異常型及混合型5種[7],任何淚膜組成成分定量或定性的缺乏或改變均可能導(dǎo)致干眼,包括但不限于淚腺損傷、炎癥、感染、系統(tǒng)性自身免疫性疾病和環(huán)境因素[8]。高原環(huán)境具有氧分壓低、紫外線強、氣候寒冷、風(fēng)速高、濕度低等特點。陳曉敏等[9]通過建立可控干燥系統(tǒng)模擬低濕度環(huán)境,建立了水液缺乏型干眼模型。耿玉倩等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)除了低濕度外,無論溫度過高還是過低的環(huán)境均容易增加淚液蒸發(fā),導(dǎo)致脂質(zhì)異常型干眼的發(fā)生發(fā)展。但考慮到實際上無論是高原久居還是去高原旅游,人們的防護(hù)意識越來越強,護(hù)目鏡的普及減弱了高原地區(qū)紫外線輻射、高風(fēng)速、低濕度的影響,故本研究僅探討高原低壓缺氧條件的影響。

圖3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 A：對照組;B：高原組;C：免疫組織化學(xué)染色平均光密度比較,bP<0.01 vs 對照組。

淚膜脂質(zhì)層主要由瞼板腺產(chǎn)生,防止或減少淚液蒸發(fā),并通過降低表面張力穩(wěn)定淚膜,故瞼板腺功能障礙將引起脂質(zhì)層異常和淚膜不穩(wěn)定,導(dǎo)致脂質(zhì)異常型干眼。本研究結(jié)果表明,高原環(huán)境暴露3、7 d,NIBUT-first和NIBUT-average均顯著降低,這與Willmann等[11]研究發(fā)現(xiàn)健康受試者在高海拔(4 559 m)環(huán)境暴露第1、2、4 d淚膜破裂時間顯著減少的研究結(jié)果一致,說明急性高原環(huán)境暴露會破壞淚膜的穩(wěn)定性,可能與脂質(zhì)異常導(dǎo)致蒸發(fā)過強有關(guān)。但也有相關(guān)研究表明,與平原地區(qū)(284 m)相比,高原地區(qū)(3 700 m)長期居住者瞼板腺缺失程度更嚴(yán)重,卻反應(yīng)性地分泌更多脂質(zhì)[12]。此外,兔眼具有特殊的解剖結(jié)構(gòu)——哈氏腺,現(xiàn)有研究表明兔哈氏腺和淚液中的脂質(zhì)不同于人瞼板腺和淚液中的脂質(zhì)[13],這些獨特的兔脂質(zhì)可能對脂質(zhì)異常型干眼具有保護(hù)作用,潤滑眼表穩(wěn)定淚膜,使其淚膜穩(wěn)定性更高[14]。因此,本研究發(fā)現(xiàn)高原環(huán)境暴露4 wk對兔哈氏腺影響并不顯著,這可能是2、4 wk時NIBUT-first和NIBUT-average逐步恢復(fù)的原因。

淚膜水液層主要由淚腺分泌,可以起到保護(hù)、沖洗、潤濕角膜和結(jié)膜的作用。本研究發(fā)現(xiàn),暴露在模擬6 000 m高海拔環(huán)境下的新西蘭兔,3、7 d淚液分泌量和TMH顯著降低。早期對長期居住在高原地區(qū)(3 700 m)的藏族居民的調(diào)查研究也顯示其基礎(chǔ)淚液分泌量明顯低于內(nèi)地居民[15]。馬建洲等[16]研究發(fā)現(xiàn)正常中青年人在高原地區(qū)(4 300 m)居住1 mo后與前往高原前相比,淚液分泌量顯著增多。這也與本研究觀察到2、4 wk高原組兔淚液分泌量有所增加相符,但仍低于對照組,提示可能為適應(yīng)性增加。然而,由于高原低壓缺氧環(huán)境增加了淚液成分的蒸發(fā),故雖然淚膜穩(wěn)定性較高,但仍不能抵消水液蒸發(fā)的程度,因此在2、4 wk時,雖然高原組淚膜穩(wěn)定性提高,NIBUT-first和NIBUT-average延長,甚至與對照組相比無顯著差異,但TMH仍較低,這與Li等[12]研究結(jié)果相似。實驗動物模型發(fā)現(xiàn)兔淚腺摘除后將導(dǎo)致水液缺乏型干眼[17],提示淚腺對于維持淚液分泌量具有關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,高原環(huán)境暴露4 wk部分新西蘭兔淚腺充血較重,淚腺上皮細(xì)胞萎縮,腺體結(jié)構(gòu)破壞,腺泡黏液物質(zhì)減少,將導(dǎo)致淚液的質(zhì)和量改變及淚膜穩(wěn)定性降低。

角結(jié)膜上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能是維持眼表健康的關(guān)鍵。水液中含有的氧和葡萄糖可供角膜新陳代謝。有證據(jù)表明,干眼將導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞凋亡增加及上皮脫落和更新增加,破壞正常眼表環(huán)境穩(wěn)態(tài)[18]。本研究發(fā)現(xiàn),高原組兔角膜上皮細(xì)胞層數(shù)減少,基質(zhì)腫脹,周邊部基質(zhì)層新生血管形成,可能由于高原低壓缺氧環(huán)境限制了角膜與氧氣的接觸,導(dǎo)致顯著的局部角膜缺氧引起的代償增生[19]。與本研究類似,Willmann等[20]同樣發(fā)現(xiàn)14名健康成年人在急進(jìn)到高海拔地區(qū)(4 559 m)4 d內(nèi),淚膜層和角膜上皮厚度顯著減少,而角膜內(nèi)皮和角膜基質(zhì)厚度顯著增加。故高原低壓缺氧使角膜解剖結(jié)構(gòu)改變,破壞其生理作用,使眼表穩(wěn)定性下降,導(dǎo)致干眼的發(fā)生。

眼表黏蛋白的表達(dá)水平及其在淚膜中的分布對維持淚膜的穩(wěn)定和眼表上皮細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要[21]。其中,分泌型膠樣黏蛋白MUC5AC是最主要的,主要由結(jié)膜杯狀細(xì)胞分泌入淚液,能通過連接水分子并形成膠從而起到保持水分、維持淚膜穩(wěn)定等作用。與既往研究[22]一致,本研究進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)MUC5AC在兔結(jié)膜杯狀細(xì)胞中均質(zhì)表達(dá),表明高原環(huán)境暴露4 wk結(jié)膜杯狀細(xì)胞增多,且MUC5AC表達(dá)水平較對照組高,淚膜穩(wěn)定性同樣恢復(fù)。另有研究表明,在急性手術(shù)應(yīng)激后1 mo時MUC5AC水平增加[23],但與急性干眼狀態(tài)相關(guān)的眼部炎癥自發(fā)消退,提示MUC5AC的過度表達(dá)可能有助于眼表穩(wěn)態(tài)的代償性恢復(fù)。據(jù)報道,在慢性干眼條件下,杯狀細(xì)胞數(shù)量和MUC5AC含量也減少[24-25]。由此推測,杯狀細(xì)胞增多及MUC5AC表達(dá)增加可能是由于短期內(nèi)維持眼表穩(wěn)態(tài)的破壞對黏蛋白需求增加而適應(yīng)性地增加,但具體機制仍需進(jìn)一步研究。

拉曼光譜是一種基于分子振動對光的非彈性散射的光學(xué)技術(shù),可以提供血清、組織或體液的“分子指紋”,進(jìn)而可用于以非侵入性、無標(biāo)記的方式檢測內(nèi)源性大分子、代謝物、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞類型等,具有很高的特異性[3]。角膜前淚膜是具有不同結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝物和電解質(zhì)的復(fù)雜混合物。有研究者利用滴涂沉積拉曼光譜、表面增強拉曼光譜[4]分析淚液,從而提供了完整的人體淚液的溶菌酶、乳鐵蛋白、白蛋白等蛋白質(zhì)信息。眼淚中的蛋白質(zhì)在抗菌防御和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用,本研究利用拉曼光譜分析高原組干預(yù)前和干預(yù)4 wk淚液成分的變化,發(fā)現(xiàn)干預(yù)4 wk與干預(yù)前淚液樣本拉曼光譜存在差異的多數(shù)區(qū)域峰值強度高于干預(yù)前,對應(yīng)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等產(chǎn)物成分含量增多,也與干預(yù)4 wk免疫組織化學(xué)染色及淚液指標(biāo)所提示結(jié)果相一致。對應(yīng)的峰值強度低于干預(yù)前代表核酸含量減少,可能是由蛋白水解、氧化分解代謝和糖異生的失調(diào)引起。

高原環(huán)境條件復(fù)雜,單一或混雜因素均可造成眼部不適癥狀,但就本研究結(jié)果而言,低壓缺氧所導(dǎo)致的干眼仍傾向于脂質(zhì)異常與水液缺乏共同作用的結(jié)果,提示在防治高原環(huán)境下干眼時可適當(dāng)應(yīng)用護(hù)目鏡或濕房鏡并綜合選用人工淚液、局部促進(jìn)淚液分泌劑、局部糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑,在出現(xiàn)嚴(yán)重角膜上皮病變時可以聯(lián)合自體血清進(jìn)行治療[26]。

綜上所述,本研究通過模擬高原環(huán)境探討低壓缺氧對新西蘭兔淚液指標(biāo)及相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)的影響,證實急性(3-7 d內(nèi))低壓缺氧引起淚液蒸發(fā)增加或破壞淚液分泌而直接或間接導(dǎo)致淚液分泌量下降,破壞淚膜穩(wěn)定性,而隨著暴露時間的延長(2-4 wk內(nèi)),高原環(huán)境所致?lián)p傷程度有所降低,甚至功能代償性增加,這與平原地區(qū)人群進(jìn)入高原后所產(chǎn)生的缺氧習(xí)服機制相同。然而,本研究還存在一定的不足：(1)由于未能獲取兔瞼板腺及脂質(zhì)層分析的紅外圖像,沒有定量及定性研究淚液脂質(zhì)及瞼板腺的變化,故尚不能確定急性高原暴露導(dǎo)致的淚膜穩(wěn)定性下降是否由脂質(zhì)異常導(dǎo)致;(2)未觀察干預(yù)3、7 d兩組兔結(jié)膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量及MUC5AC的表達(dá),不清楚早期的變化趨勢;(3)出于倫理學(xué)考慮,本研究利用高原模擬艙未將人列為研究對象,由于兔眼和人眼解剖學(xué)類似故選擇兔為研究對象,但兔眼仍有其特殊結(jié)構(gòu),且淚液成分有差異,故研究結(jié)果雖然有參考價值,但具有一定局限性,后續(xù)可實地收集高原與平原地區(qū)居住者的淚液樣本進(jìn)行分析。目前,低壓缺氧導(dǎo)致干眼的具體分子生物學(xué)機制尚不清楚,后續(xù)研究可深入探討高原與平原地區(qū)人群淚液中氧化應(yīng)激、缺氧相關(guān)因子的差異及與拉曼光譜的聯(lián)系。