崔本科 王巖 盧云鳳

原發(fā)性支氣管肺癌(肺癌)是我國(guó)最常見和死亡率最高的惡性腫瘤,據(jù)國(guó)家癌癥中心最新報(bào)道,2016年我國(guó)肺癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)分別為82.81萬(wàn)例、65.70萬(wàn)例[1]。臨床中85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),由于缺乏有效的早期診斷方法和治療方法,導(dǎo)致NSCLC患者死亡率居高不下[2]。尋找相關(guān)分子標(biāo)志物評(píng)估NSCLC患者預(yù)后至關(guān)重要。研究表明,非編碼RNA能通過調(diào)控多種靶基因參與NSCLC發(fā)生發(fā)展[3-4]。序列相似性家族138成員B(family with sequence similarity 138 member B,FAM138B)是新近發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)。有學(xué)者通過RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),LncRNA FAM138B為肺腺癌潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[5]。微小RNA(microRNA,miRNA)-105-5p是一種miRNA,有研究報(bào)道m(xù)iR-105-5p與胃癌、肝癌等惡性腫瘤預(yù)后有關(guān)[6-7]。同時(shí)有學(xué)者指出,循環(huán)miR-105-5p可作為NSCLC早期診斷標(biāo)志物[8]。但關(guān)于LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)與NSCLC病理特征的預(yù)后的關(guān)系尚未可知。本研究擬探討NSCLC患者血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)與病理特征的預(yù)后的關(guān)系,以期為改善NSCLC患者預(yù)后提供更多思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年12月遼寧省人民醫(yī)院收治的110例NSCLC患者為NSCLC組,男64例,女46例;年齡24～77歲,平均年齡(60.57±8.63)歲;吸煙63例;病理類型:腺癌37例,鱗癌73例;腫瘤大小:≥5 cm 49例,<5 cm 61例;分化程度:低分化51例,中高分化59例;TNM分期[9]:Ⅰ期28例,Ⅱ期38例,Ⅲ期27例,Ⅳ期17例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例。另選取同期60例體檢健康者為對(duì)照組,男35例,女25例;年齡20～75歲,平均年齡(60.41±7.53)歲;2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理檢查確診為NSCLC;②患者或家屬書面知情同意;③初次確診為NSCLC;④入院前未接受抗腫瘤治療;(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①年齡<18歲;②合并慢阻肺等其他肺部疾病;③合并其他部位惡性腫瘤;④合并急慢性感染;⑤合并免疫、血液、神經(jīng)系統(tǒng)損害;⑥院內(nèi)死亡、拒絕接受隨訪。

1.3 方法 采集NSCLC患者入院翌日晨和對(duì)照組體檢時(shí)空腹肘靜脈血3 mL,離心留取上層血清,Trizol試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司,編號(hào):WLA088a)提取血清總RNA,微量分光光度計(jì)(武漢艾維斯特科技有限公司,型號(hào):Nano-300)鑒定RNA濃度和純度合格后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司,編號(hào):R1011)合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件:37℃ 1 h,80℃ 5 s。按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,編號(hào):R223-01)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)體系共20 μL:cDNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、2×TransStart Top Green qPCR SurperMix 10 μL、無(wú)核酸酶水8.5 μL;反應(yīng)條件:95℃ 90 s(1次),95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s(循環(huán)40次)。LncRNA FAM138B、miR-105-5p分別以GAPDH、U6為內(nèi)參校正,2-ΔΔCt法計(jì)算血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p相對(duì)表達(dá)量。LncRNA FAM138B正向引物:5’-GCCTGGAGAGCACCAAGAGGCC-3’;反向引物:5’-ATGGTCCCCAGCCAAAAGCCTC-3’;GAPDH正向引物:5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’;反向引物:5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’;miR-105-5p正向引物:5’-TCGGCAGGTCAAATGCTCAGAC-3’;反向引物:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;U6正向引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向引物:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 隨訪 NSCLC患者出院后通過電話或門診隨訪3年(第1年3個(gè)月1次,第2、3年6個(gè)月1次),隨訪終止事件為患者死亡或隨訪終點(diǎn)時(shí)間(2022年12月),統(tǒng)計(jì)3年總生存率。根據(jù)NSCLC組織中LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)均值分為高、低表達(dá)組。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組與對(duì)照組血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)比較 NSCLC組血清LncRNA FAM138B表達(dá)低于對(duì)照組,miR-105-5p表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC組與對(duì)照組血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)比較

2.2 NSCLC患者血清LncRNA FAM138B與miR-105-5p表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)https://starbase.sysu.edu.cn/預(yù)測(cè),LncRNA FAM138B與miR-105-5p存在互補(bǔ)序列。Pearson相關(guān)性分析顯示,NSCLC患者血清LncRNA FAM138B與miR-105-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.770,P<0.001)。見圖1。

圖1 NSCLC患者血清LncRNA FAM138B與miR-105-5p表達(dá)的線性散點(diǎn)圖

2.3 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)與NSCLC患者病理特征的關(guān)系 不同分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),不同性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤大小NSCLC患者LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)與NSCLC患者病理特征的關(guān)系

2.4 LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)與NSCLC患者生存率的關(guān)系 110例NSCLC患者隨訪3年,失訪4例,死亡48例,3年總生存率為56.36%(62/110)。K-M生存曲線分析顯示,LncRNA FAM138B高表達(dá)組(≥0.871,58例)總生存率67.24%(39/58)高于低表達(dá)組(<0.871,52例)的44.23%(23/52);miR-105-5p高表達(dá)組(≥1.494,56例)總生存率44.64%(25/56)高于低表達(dá)組(<1.494,54例)的68.52%(37/54),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=7.339、5.356,P=0.007、0.021)。見圖2。

圖2 不同LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)的NSCLC患者K-M生存曲線

2.5 NSCLC患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析 排除4例失訪患者,性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA FAM138B、miR-105-5p為自變量,隨訪時(shí)間為時(shí)間變量,生存狀態(tài)為因變量(死亡/存活=1/0)。多因素Cox回歸分析顯示,低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和miR-105-5p≥1.494為NSCLC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,LncRNA FAM138B≥0.871為獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表3。

表3 NSCLC患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

2.6 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析顯示,血清LncRNA FAM138B聯(lián)合miR-105-5p表達(dá)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的AUC大于LncRNA FAM138B、miR-105-5p單獨(dú)預(yù)測(cè)(Z=3.269、3.406,P=0.001、0.001)。見表4,圖3。

圖3 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的ROC曲線

表4 血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

肺癌是起源于支氣管黏膜上皮的惡性腫瘤[2]。近年來(lái)隨著低劑量螺旋CT的開展和居民健康意識(shí)的提高,NSCLC早期診斷率有所提高,但由于早期癥狀不明顯,僅25%患者初診處于可切除的早中期,多達(dá)75%的患者在初診時(shí)處于晚期,失去最佳根治性切除機(jī)會(huì)[9-10]。盡管近年來(lái)基于表皮生長(zhǎng)因子受體、ROS原癌基因1、間變性淋巴瘤激酶等的靶向藥物[11]和基于程序性死亡受體1等的免疫藥物[12]提高了患者客觀緩解率,但僅部分NSCLC患者獲得臨床效益,且隨著獲得性耐藥隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)越來(lái)越多,導(dǎo)致NSCLC患者預(yù)后仍然較差。因此發(fā)現(xiàn)預(yù)后準(zhǔn)確預(yù)測(cè)標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn),對(duì)提高NSCLC患者臨床干預(yù)和生存率具有重要意義。

NSCLC是多因素、多基因、多機(jī)制參與的復(fù)雜過程,表觀遺傳能通過修飾或改變特定染色體區(qū)域結(jié)構(gòu)等因素影響基因表達(dá),進(jìn)而參與NSCLC發(fā)生發(fā)展[13]。LncRNA是一類新興表觀遺傳調(diào)控分子,能通過直接與蛋白質(zhì)相互作用、與miRNA相互作用形成內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA、編碼蛋白質(zhì)或多肽等多種方式調(diào)控NSCLC進(jìn)程。LncRNA FAM138B定位于人染色體2q14.1,Li等[5]首次通過RNA測(cè)序證實(shí),LncRNA FAM138B在肺腺癌組織中低表達(dá),且與患者預(yù)后生存率降低有關(guān)。Zhuo等[14]研究報(bào)道,LncRNA FAM138B在肝癌中低表達(dá),上調(diào)LncRNA FAM138B能靶向下調(diào)miR-765,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。基于上述研究,我們推測(cè)LncRNA FAM138B可能與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,NSCLC組血清LncRNA FAM138B表達(dá)降低,與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說(shuō)明LncRNA FAM138B低表達(dá)參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。LncRNA FAM138B在NSCLC中低表達(dá)可能與其啟動(dòng)子被甲基化而表達(dá)沉默有關(guān)[15]。而隨著LncRNA FAM138B表達(dá)降低,可能降低ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、環(huán)磷酸腺苷,導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖,促進(jìn)NSCLC惡性進(jìn)展[5]。

miRNA也是一類新興表觀遺傳調(diào)控分子,能通過引發(fā)信使RNA的降解或轉(zhuǎn)錄后基因沉默,進(jìn)而參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。miR-105-5p定位于人染色體Xq28,近年來(lái)大量研究報(bào)道了其與腫瘤的關(guān)系,如艾恒玲等[16]研究報(bào)道,miR-105-5p能靶向上調(diào)XIAP相關(guān)因子1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲。上述研究表明,miR-105-5p是一種癌基因。同時(shí)有學(xué)者報(bào)道,miR-105-5p高表達(dá)與乳腺癌、原發(fā)性骨髓瘤等惡性腫瘤患者的預(yù)后不良有關(guān)[17]?；谏鲜鲅芯?我們推測(cè)miR-105-5p可能與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,NSCLC組血清miR-105-5p表達(dá)升高,這與既往報(bào)道結(jié)果[8]相符。本結(jié)果還顯示,NSCLC組血清miR-105-5p表達(dá)與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說(shuō)明血清miR-105-5p表達(dá)升高參與NSCLC發(fā)生發(fā)展。miR-105-5p在NSCLC中高表達(dá)可能與其啟動(dòng)子被癌基因激活而大量表達(dá)有關(guān)[8]。而隨著miR-105-5p表達(dá)升高,能上調(diào)GTP酶IMAP家族成員6,促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18]。

本研究通過StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),LncRNA FAM138B與miR-105-5p存在互補(bǔ)序列,相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)兩者在NSCLC患者血清中表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示LncRNA FAM138B與miR-105-5p可能共同參與NSCLC進(jìn)程。Gao等[19]實(shí)驗(yàn)也顯示,上調(diào)LncRNA FAM138B表達(dá)能靶向抑制miR-105-5p,進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)果。本研究通過隨訪分析LncRNA FAM138B、miR-105-5p與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn),LncRNA FAM138B高表達(dá)和miR-105-5p低表達(dá)患者3年總生存率顯著提升,miR-105-5p≥1.49為NSCLC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,LncRNA FAM138B≥0.87為獨(dú)立保護(hù)因素,說(shuō)明血清LncRNA FAM138B低表達(dá)和miR-105-5p高表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后不良密切相關(guān)。最后我們通過繪制ROC曲線也發(fā)現(xiàn),血清LncRNA FAM138B聯(lián)合miR-105-5p表達(dá)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的AUC為0.905,較LncRNA FAM138B、miR-105-5p單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC顯著增加。說(shuō)明血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)對(duì)NSCLC患者預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值,且聯(lián)合檢測(cè)血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)能提升其預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述,NSCLC患者血清LncRNA FAM138B表達(dá)降低,miR-105-5p表達(dá)升高,與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān),血清LncRNA FAM138B、miR-105-5p表達(dá)對(duì)NSCLC患者預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值,二者聯(lián)合預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的價(jià)值較高,可能成為NSCLC患者預(yù)后的輔助預(yù)測(cè)指標(biāo)。