唐悅玲 李心怡

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合異常形成的瘢痕組織,病變超出損傷部位范圍,持續(xù)生長且無自愈傾向[1]。瘢痕疙瘩不僅引起疼痛和瘙癢等不適反應(yīng),而且影響正常身體功能,同時(shí)也影響美觀,給患者的生活質(zhì)量和身心健康帶來極大的損害[2]。大量細(xì)胞參與瘢痕疙瘩的形成過程,其中成纖維細(xì)胞處于核心位置[3]。成纖維細(xì)胞功能異?；罨?導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和膠原過度合成,從而導(dǎo)致瘢痕不斷生長和擴(kuò)大,形成瘢痕疙瘩,具有類似腫瘤細(xì)胞的特征,因此瘢痕疙瘩又被成為皮膚良性腫瘤[3]。目前,瘢痕疙瘩的臨床治療手段多種多樣,但是治療效果卻不令人滿意,并且治療后復(fù)發(fā)率極高[4]。近年來,中藥治療瘢痕疙瘩取得了一定的進(jìn)展,受到了廣泛的關(guān)注和研究[5]。特別是鑒定中草藥中對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和膠原合成具有調(diào)控作用的活性單體成分,是目前研究的熱點(diǎn),有望為瘢痕疙瘩的治療提供新的突破口。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是目前研究比較廣泛的信號(hào)通路,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等細(xì)胞生物學(xué)過程,其異常調(diào)控和疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。β-catenin在該通路的信號(hào)傳導(dǎo)過程中處于中心位置。當(dāng)沒有Wnt信號(hào)時(shí),β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被降解,維持在極低的水平。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí),β-catenin的降解復(fù)合體解散,導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累,隨后進(jìn)入細(xì)胞核,與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(T-cell factor/Lymphoid enhancing factor,TCF/LEF)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,調(diào)控Wnt靶基因表達(dá),產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[7]。研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路的過度激活和瘢痕疙瘩的形成密切相關(guān)[8]。研究發(fā)現(xiàn),β-catenin及其下游靶分子在瘢痕疙瘩和分離的成纖維細(xì)胞中都呈高表達(dá)狀態(tài)[9]。抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原合成[10-11]。因此,鑒定具有抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的中藥單體成分,對于治療瘢痕疙瘩具有重要的參考價(jià)值。樺木酸(betulinic acid,BA)是一種可從多種草本植物中提取出的羽扇豆烷型五環(huán)三萜類活性物質(zhì),其在樺樹皮中的含量最高,具有抗腫瘤、抗菌、抗炎和抗纖維化等廣泛的藥理作用[12-13]。近年來,BA的生物活性及其治療疾病的潛在價(jià)值受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本研究探討B(tài)A對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和膠原合成的調(diào)控作用,并探討其可能的分子作用機(jī)制,為BA應(yīng)用于瘢痕疙瘩的治療提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 BA(分析標(biāo)準(zhǔn)品,HPLC≥98%)購自上海藍(lán)木化工有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司;CCK-8試劑盒、EdU試劑盒、TOPFlash報(bào)告基因質(zhì)粒、Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑和螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司;Trizol總RNA提取試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司;cDNA合成試劑盒PrimeScript RT reagent Kit和定量PCR試劑盒TB Green Fast qPCR Mix購自大連寶生物工程有限公司;蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;兔抗人Col Ⅰ抗體、β-catenin抗體、c-myc抗體、cyclin D1抗體和GAPDH抗體自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞分離和培養(yǎng):在無菌條件下,將手術(shù)切除的新鮮瘢痕疙瘩組織轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)內(nèi),將組織放入培養(yǎng)皿中,加入含有1%雙抗的0.9%氯化鈉溶液,漂洗,去除皮下組織。將瘢痕疙瘩剪成0.5～1 mm3的碎塊,用鑷子將小塊接種于培養(yǎng)瓶中,滴加少量胎牛血清,以便組織塊貼壁。將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi),瓶底朝上。孵育5 h,待組織塊完全貼壁,加入2 mL含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),每3天更換1次培養(yǎng)液。待組織塊周圍爬滿細(xì)胞時(shí),去除組織塊和培養(yǎng)液,PBS洗滌2次。加入胰酶消化液,孵育3 min。顯微鏡下觀察,待細(xì)胞收縮,間隙變大時(shí),加入2 mL含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,終止消化。采用移液槍反復(fù)吹打,使細(xì)胞懸浮。將細(xì)胞懸液收集到離心管,離心收集細(xì)胞沉淀,再次加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)基1次,待細(xì)胞融合度到達(dá)80%以上,進(jìn)行傳代。取3～4代細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn):將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞常規(guī)消化,制成細(xì)胞懸液,按照3 × 103個(gè)/孔的密度,細(xì)胞接種到96孔板,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。過夜孵育,待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的BA處理,繼續(xù)孵育24 h。取出培養(yǎng)板,吸去培養(yǎng)液,向每孔加入10 μL的CCK-8試劑,置于培養(yǎng)箱中,繼續(xù)孵育。培養(yǎng)2 h后,取出培養(yǎng)板,置于酶標(biāo)儀上。調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀,于450 nm波長處,測定細(xì)胞溶液在的吸光度。

1.2.3 細(xì)胞分組:將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞分為3組:空白對照組、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)處理組(溶劑對照組)和BA處理組。加藥后,充分混勻,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h,然后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.4 EdU實(shí)驗(yàn):將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種到含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,過夜培養(yǎng),待細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài),加入BA處理。培養(yǎng)24 h后,將37℃預(yù)熱的EdU工作液,等體積的加入到6孔板中,使終濃度達(dá)到10 μmol/L。加入EdU后,繼續(xù)孵育2 h。倒掉培養(yǎng)液,加入1 mL 的4%的多聚甲醛,室溫固定15 min。倒掉固定液,PBS洗滌細(xì)胞3次。加入1 mL 的通透液,室溫孵育15 min。倒掉通透液,PBS洗滌細(xì)胞3次,加入0.5 mL的EdU反應(yīng)液,輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品,室溫避光孵育30 min。倒掉反應(yīng)液,PBS洗滌3次,加入1 mL的DAPI溶液復(fù)染,室溫避光孵育10 min。PBS洗滌3次,采用抗熒光淬滅封片液,進(jìn)行封片,隨后在熒光顯微鏡下觀察和采集圖像。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù):采用胰酶消化待檢測的細(xì)胞,離心收集細(xì)胞沉淀,預(yù)冷的PBS洗滌2次。收集1×105細(xì)胞,加入100 μL 1 × Binding Buffer重懸細(xì)胞。向細(xì)胞懸液中加入5 μL的 Annexin V-FITC和10 μL的PI 試劑,室溫避光孵育15 min。然后,加入400 μL 1 × Binding Buffer,輕搖混勻,立即采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn):采用胰酶消化瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞,重懸于不含血清的培養(yǎng)基中,制成濃度為5 × 104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。將Transwell上室提前鋪好基質(zhì)膠。待干燥后,將200 μL瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞懸液接種到上室,并添加BA。向下室注入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液。將Transwell系統(tǒng)置于培養(yǎng)箱中,孵育24 h。取出小室,倒掉剩余液體,用棉棒擦除殘留細(xì)胞。加入4%多聚甲醛溶液固定30 min;PBS洗滌,加入結(jié)晶紫染液,染色10 min。流水緩緩沖洗,去除染色液。待小室風(fēng)干后,置于顯微鏡下觀察和采集圖像。

1.2.7 Western blot:倒掉培養(yǎng)液,預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,劇烈震蕩,冰上孵育30 min。4℃離心,收集上清,采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。向蛋白樣品中加入上樣緩沖液,沸水煮沸5 min,使蛋白變性。按30 μg/孔的上樣量,將蛋白樣品加入道濃縮膠中,進(jìn)行電泳。待電泳結(jié)束,取出分離膠,將濾紙、凝膠和PVDF膜制成“三明治轉(zhuǎn)模結(jié)構(gòu)”,進(jìn)行轉(zhuǎn)模。轉(zhuǎn)模完成后,取出PVDF膜,放入封閉液中,室溫孵育1 h。然后,將膜與一抗稀釋液孵育,4℃過夜。TBST洗膜,將膜與二抗稀釋液孵育,室溫孵育1 h。將發(fā)光液A和B混勻,均勻涂抹在膜上。將膜放入凝膠成像儀中,進(jìn)行曝光和圖像采集。

因此，中心日間手術(shù)開展前，籌備小組認(rèn)真研究和借鑒歐美的日間手術(shù)流程和指南，并實(shí)地考察四川大學(xué)華西醫(yī)院等國內(nèi)率先開展日間手術(shù)的醫(yī)院，再結(jié)合中心兒科?？剖中g(shù)、婦科手術(shù)特點(diǎn)等，最終確定采用，以麻醉醫(yī)生為主導(dǎo)的圍術(shù)期管理模式，對日間手術(shù)中心進(jìn)行管理。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種到24孔板,過夜孵育培養(yǎng),待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右,采用Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑將TOPFlash報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,加入BA處理,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入螢火蟲螢光素酶檢測試劑200 μL,室溫孵育10 min。采用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性。

1.2.9 RT-qPCR:根據(jù)Trizol試劑抽提步驟,提取細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA為模板,加入,加入逆轉(zhuǎn)錄酶溶液、緩沖液和反轉(zhuǎn)錄引物配,補(bǔ)加無RNase的水,配置成20 μL反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為37℃,15 min;85℃,5 s。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物,加入TB Green Fast qPCR Mix和正反擴(kuò)增引物,補(bǔ)加無菌水,配置成25 μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為95℃,30 min;95℃,5 s 和60℃,10 s(40個(gè)循環(huán))。以GADPH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt公式計(jì)算析mRNA相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 BA處理抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長活性 BA為白色結(jié)晶,分子式為C30H48O3,相對分子質(zhì)量為456.7。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測了不同濃度BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長活性的影響。與空白對照組相比,不同濃度BA處理后,瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)。在30 μmol/L BA處理后,瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長活性大約減少1/2,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用30 μmol/L BA處理細(xì)胞進(jìn)行研究。見圖1,表1。

表1 BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生長活性的影響 %,

圖1 BA化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2 BA處理抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖 采用EdU實(shí)驗(yàn)檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組EdU陽性細(xì)胞的比例下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2,圖2。

表2 3組細(xì)胞增值率比較 %,

圖2 EdU實(shí)驗(yàn)檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響(EdU染色×200)

2.3 BA處理促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡 采用Annexin V-FITC/PI對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞染色,然后采用流式細(xì)胞術(shù)分析BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組凋亡細(xì)胞比例上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01。見圖3,表3。

表3 3組細(xì)胞凋亡率比較 %,

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響

2.4 BA處理抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的侵襲 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞侵襲的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組細(xì)胞侵襲數(shù)目降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4,表4。

表4 3組細(xì)胞侵襲能力比較 個(gè),

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞侵襲能力的影響染色(結(jié)晶紫染色×200)

2.5 BA處理抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的膠原合成 采用Western blot檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的膠原合成的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組Col Ⅰ蛋白表達(dá)量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5,表5。

表5 3組細(xì)胞ColⅠ蛋白表達(dá)相對定量分析

圖5 Western blot檢測BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成的影響

2.6 BA處理下調(diào)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路 采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)評估BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示,與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組β-catenin蛋白量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。采用RT-qPCR檢測BA對Wnt/β-catenin靶基因c-myc和cyclin D1表達(dá)的影響。與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組c-myc和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),與空白對照組和DMSO處理組相比,BA處理組c-myc和cyclin D1的蛋白量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖6、7,表6～9。

表6 BA對Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 RLU × 107,

表7 3組細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)相對定量分析

表8 RT-qPCR檢測BA對c-myc和cyclin D1 mRNA表達(dá)的影響

表9 3組細(xì)胞c-myc和cyclin D1 蛋白表達(dá)相對定量分析

圖6 Western blot檢測BA對β-catenin蛋白表達(dá)的影響

圖7 Western blot 檢測BA對c-myc和 cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

中藥治療瘢痕疙瘩歷史悠久,療效顯著,越來越受到重視,從中藥中鑒定療效確切、不良反應(yīng)少的單體活性化合物,是目前的研究的熱點(diǎn),有望為瘢痕疙瘩的治療提供新的突破口。BA具有廣泛的藥理活性,本研究檢測了BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,初步探討B(tài)A治療瘢痕疙瘩的潛在價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn),BA可有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長、增殖、遷移和膠原合成,而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明,BA可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中發(fā)揮作用。

研究表明,BA具有顯著的抗腫瘤活性,可抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移和侵襲,并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14-17]。瘢痕疙瘩被認(rèn)為是一種良性腫瘤,其中成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能異常活化,具有類似腫瘤細(xì)胞的特征。目前,關(guān)于BA是否對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能具有調(diào)控作用,尚未見報(bào)道。因此,本研究首次對BA在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中作用進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn),BA可以顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長活性。進(jìn)一步的檢測實(shí)驗(yàn)表明,BA可以有效降低制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖、侵襲和膠原合成,而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些結(jié)果表明,BA具有逆轉(zhuǎn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞異常生物學(xué)功能的作用,可能對瘢痕的形成和生長具有抑制作用,可作為治療瘢痕疙瘩的潛在藥物。

BA具有較強(qiáng)的抗纖維化作用,可以很好的抑制心、肝、肺和腎等器官的纖維化[18-21]。據(jù)報(bào)道,BA可以抑制肝星狀細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,抑制細(xì)胞增殖、遷移和膠原合成,從而減輕肝纖維化的進(jìn)展[22]。BA還可以抑制肺成纖維細(xì)胞中膠原合成,從而延緩肺纖維化的進(jìn)展[20]。本研究表明,BA對成纖維細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、侵襲和膠原合成等生物學(xué)功能具有顯著的調(diào)控作用,進(jìn)一步證實(shí)了BA的抗纖維化作用,也拓展了BA對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的調(diào)控作用。本研究為BA的抗纖維化活性,提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在瘢痕疙瘩的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子,包括β-catenin和下游靶基因在瘢痕疙瘩及分離的成纖維細(xì)胞中,都成高表達(dá)狀態(tài)[9]。抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原合成[10-11]。已有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),BA具有抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。BA處理腫瘤細(xì)胞可以下調(diào)β-catenin和c-myc的表達(dá),從而發(fā)揮抑癌作用[23]。Li等[20]報(bào)道,BA可阻斷Wnt配體和膜受體的結(jié)合,從而下調(diào)β-catenin和下游靶基因的表達(dá),抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)過程。這些研究表明,BA對Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有抑制活性。鑒于Wnt/β-catenin信號(hào)通路在瘢痕疙瘩的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,本研究檢測了BA是否影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)過程。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),BA處理可有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn),β-catenin以及下游靶基因c-myc和cyclin D1的表達(dá)水平在BA處理的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中都顯著降低。這些結(jié)果表明,BA可以下調(diào)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述,BA具有抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和膠原合成的活性,其分子作用機(jī)制可能與負(fù)向調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)。鑒于成纖維細(xì)胞的異?；罨邱：鄹泶裥纬珊桶l(fā)展的關(guān)鍵,因此BA具有治療瘢痕疙瘩的潛在價(jià)值。