陳杉彬,趙東,欒春光*,喬宗偉,鄭佳,張強,馮政,王德良

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)

2(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓,644000)

3(酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心,北京,100015)

阿魏酸(ferulic acid,FA),能夠抗氧化和抗自由基活性,是較多物質(zhì)的前體物質(zhì)。其中阿魏酸鈉作為藥物或制劑的輔料組成,通常被用來治療心腦血管,具有抗炎、護肝等功效。而阿魏酸在中草藥及天然食品中含量更高,在不轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)時,阿魏酸是否具有其他的生理學(xué)功效同樣值得深入研究。阿魏酸用途廣泛,是傳統(tǒng)發(fā)酵食品如白酒、醋中的典型風味物質(zhì)[1]。盡管阿魏酸得到了廣泛的應(yīng)用,但其對細胞生理活性的影響及分子機理目前尚不十分明確。

CT-26細胞系培養(yǎng)條件簡單,無需特殊培養(yǎng)基,且具有造模成瘤快的特點[2]。利用CT-26細胞系構(gòu)建BALB/c小鼠直腸癌模型已經(jīng)成為一種通用的小鼠模型[3]。目前,CT-26細胞系已經(jīng)被應(yīng)用到新藥開發(fā)、細胞代謝通路研究、毒理學(xué)[4]和免疫應(yīng)答[5]等研究中。因此,該細胞系也被用來考察生物活性物質(zhì)對細胞生理活性影響和生物活性物質(zhì)篩選的一種手段。

細胞凋亡(apoptosis)是細胞自主的死亡,在多數(shù)疾病中發(fā)揮作用,針對細胞凋亡能夠改善疾病的發(fā)生[6-7]。同樣,細胞自噬也是維持細胞穩(wěn)態(tài)所必需的,它對于腫瘤等疾病的病理生理過程具有一定的調(diào)控作用[8-9]。細胞凋亡和細胞自噬是2種顯著不同的細胞形式,兩者緊密結(jié)合,密切相關(guān)[10-14]。兩者的動態(tài)平衡對細胞的生理活性至關(guān)重要。細胞自噬能夠?qū)⑹軗p的細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細胞所需的營養(yǎng);此外,自噬能夠調(diào)控細胞凋亡,當自噬使細胞內(nèi)蛋白和細胞器過量消耗,致使細胞無法繼續(xù)生存時,即影響細胞的死亡[15-17]。因此,深入研究阿魏酸對細胞凋亡和細胞自噬的影響有利于明晰其對細胞生理的作用機制。

基于此,本研究利用不同濃度阿魏酸處理CT-26細胞系,考察阿魏酸對細胞生理活性影響的分子機理,在分子生物學(xué)角度揭示阿魏酸的生物活性物質(zhì)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CT-26.WT(ATCC CRL-2638)、RPMI-1640培養(yǎng)基,普諾賽公司;阿魏酸,99%,阿拉丁公司; BCAkit,索萊寶公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素,Hyclone公司;cck8,日本同仁公司;一抗LC3,PM036,P62,PM045,MBL公司; Bcl-2(15071S)、Bax(2772S)、GAPDH(5174S)、二抗(anti-rabbit,7074S;anti-Mouse,7076S),美國CST公司;caspase 3(19677-1-AP,一抗),三鷹生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini-PROTEAN Tetra,Bio-Rad公司;SpectraMax?iD3,Molecular Devices公司;ChemiScope 6000 Exp,中國勤翔公司;7500 Fast/7500(qRT-PCR)系統(tǒng),Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

CT-26細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中,添加胎牛血清和青鏈霉素,正常培養(yǎng)。當細胞生長至80%～90%左右融合度時,胰蛋白酶傳代處理。

1.3.2 細胞存活率實驗

接種CT-26細胞,每孔2.0×104,96孔板,24 h后細胞貼壁,用阿魏酸分別處理24 h和48 h。使用CCK-8檢測細胞[18]。細胞存活率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A處理組為不同萜烯類化合物測定的吸光度;A對照組為正常培養(yǎng)基測定的吸光度。

1.3.3 細胞劃痕實驗

CT-26細胞提前鋪板,正常生長后將移液槍頭垂直于孔板進行平穩(wěn)豎直劃線,棄舊培養(yǎng)液,用PBS清洗2次?？瞻捉M加入無血清培養(yǎng)液,實驗組加入無血清培養(yǎng)液配制的不同濃度阿魏酸,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察大約同一位置,不同時間點(0、12、24、48 h)的狀態(tài),并拍照計算[19],細胞遷移率的計算如公式(2)所示:

細胞遷移率/%=

(2)

1.3.4 Western blotting試驗

將CT-26細胞按照1.6×105/孔放置6孔板中,阿魏酸處理24 h后,用蛋白質(zhì)裂解液裂解CT-26細胞,添加裂解液后放置在冰箱在4 ℃中10 min,并離心15 min,以10 000×g。對總蛋白質(zhì)濃度定量。加5× sample buffer制樣。樣品在98 ℃下加熱10 min,然后以12 000×g離心。將10 μL上清液加到10% SDS-PAGE凝膠上。電泳約1 h,觀察溴酚藍位置,停止電泳,通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至膜上,轉(zhuǎn)膜條件為120 V、60 min,并用封閉緩沖液室溫封閉1 h,添加不同一抗4 ℃孵育過夜。過夜后用TBST洗膜3次5 min,對應(yīng)二抗孵育1 h后,繼續(xù)洗膜,顯色后定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行多組間方差分析和T檢驗,所有實驗數(shù)據(jù)均為3個平行試驗的平均值。用平均值±標準誤(standard error,SE)表示;圖表由Origin 2018繪制;半定量分析和比較由ImageJ軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸對細胞存活率的影響

本研究首先考察了阿魏酸濃度對細胞活力的影響,用以篩選處理細胞的最適阿魏酸濃度,研究結(jié)果見圖1。研究結(jié)果表明,與對照組比較,在使用阿魏酸處理CT-26細胞24 h和48 h[20]后,各組細胞的活力均受到顯著抑制,且抑制率呈顯出濃度和時間依賴性,阿魏酸處理濃度越大,細胞存活率越低;處理時間越長,細胞存活率越低。但在阿魏酸處理濃度為100 μmol/L時,處理時間為24 h與48 h,反而會在一定程度上促進CT-26細胞的增殖;同時,在阿魏酸處理濃度為800 μmol/L時,處理時間(24 h或48 h)對CT-26細胞存活率沒有明顯區(qū)別。采用SPSS 23.0軟件分析的結(jié)果表明,阿魏酸作用24和48 h的IC50均在800 μmol/L以上,阿魏酸濃度為0～400 μmol/L時,對細胞增殖沒有明顯影響。因此,后續(xù)研究中選用阿魏酸濃度為0～400 μmol/L,處理時間為24 h作為細胞的處理條件。

圖1 不同濃度阿魏酸對細胞活力的影響

2.2 阿魏酸對細胞遷移能力的影響

遷移能力也是癌癥細胞活力的重要指標,抑制癌癥細胞的遷移能力能夠一定程度地緩解癌癥進程[21]。然而,阿魏酸是否會對癌癥細胞的遷移能力產(chǎn)生影響尚不清楚。本研究采用細胞劃痕實驗對阿魏酸對癌癥細胞遷移能力進行了初步研究。細胞劃痕實驗結(jié)果表明(圖2),與對照組相比較,不同濃度的阿魏酸可顯著抑制CT-26細胞的遷移,降低了結(jié)腸癌細胞CT-26的遷移能力;而且,隨著藥物濃度增加,作用時間延長,細胞遷移速率降低越顯著(P<0.05)。該結(jié)果與阿魏酸對細胞存活率的影響基本一致。同時,該結(jié)果提示細胞存活率與細胞遷移速率呈正相關(guān)。

a-劃痕實驗結(jié)果;b-劃痕實驗半定量結(jié)果

2.3 阿魏酸對細胞凋亡關(guān)鍵信號通路Bcl-2/Bax的影響

細胞凋亡是由自我控制的細胞死亡,對腫瘤的抑制有積極作用。其中Bcl-2/Bax通路是影響細胞凋亡的關(guān)鍵通路之一[22-23]。研究中使用磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參,使用不同濃度(0～400 μmol/L)阿魏酸處理來考察阿魏酸對細胞凋亡的影響。研究結(jié)果見圖3。圖3中的結(jié)果顯示,與0 μmol/L處理組相比較,在GAPDH(內(nèi)參)表達量基本一致的情況下,隨著阿魏酸處理濃度的增加,抑制凋亡的關(guān)鍵蛋白Bcl-2的表達量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,而促凋亡關(guān)鍵蛋白Bax的表達量則逐漸增加。雖然在100 μmol/L處理后,抑制凋亡關(guān)鍵蛋白Bcl-2相比200 μmol/L處理組其灰度值反而有一定程度的減少,但并不影響隨阿魏酸濃度增加Bcl-2蛋白表達量降低的整體趨勢。同時,半定量結(jié)果也表明,阿魏酸可能是通過調(diào)控Bcl-2/Bax途徑對細胞凋亡進行調(diào)控的,阿魏酸能夠在一定程度上促進細胞凋亡并導(dǎo)致細胞存活率下降。

半胱氨酸蛋白酶(caspases)屬于半胱氨酸蛋白酶家族,它是細胞凋亡的關(guān)鍵[24]。本研究對凋亡通路上游的Cleaved caspase3和caspase3的蛋白表達情況也進行了考察。研究結(jié)果表明(圖3-c、圖3-d,半定量分析),在GAPDH(內(nèi)參)表達量沒有受到影響的情況下,隨著阿魏酸處理濃度的增加,caspase3被切割為Cleaved caspase3蛋白的量也在增加,從而進一步導(dǎo)致更多的Cleaved caspase3蛋白聚集和表達。該研究結(jié)果提示,阿魏酸在一定程度上通過caspase3通路對細胞凋亡進行調(diào)控。

2.4 阿魏酸對細胞自噬調(diào)控關(guān)鍵蛋白的影響

LC3和P62是調(diào)控細胞自噬的關(guān)鍵蛋白[25]。研究中以GAPDH為內(nèi)參,通過阿魏酸處理,考察其對結(jié)腸癌CT-26細胞中LC3和P62蛋白的表達影響。如圖4-a所示,內(nèi)參GAPDH的表達量一致,LC3Ⅱ的表達量隨著阿魏酸處理濃度的增加而增加,400 μmol/L阿魏酸處理組LC3II表達量最高;同時,P62的表達水平則隨隨著阿魏酸處理濃度的增加具有略微下降的趨勢。半定量分析結(jié)果(圖4-b)提示,低濃度的阿魏酸(<100 μmol/L)對CT-26細胞細胞自噬沒有造成顯著影響;而較高濃度的阿魏酸能夠促進細胞自噬。

a-自噬關(guān)鍵蛋白免疫印跡結(jié)果;b-自噬關(guān)鍵蛋白灰度值分析

3 結(jié)論與討論

為探究在傳統(tǒng)發(fā)酵食品及中草藥中含量更多的阿魏酸具體作用,以阿魏酸為研究對象,通過不同濃度的阿魏酸對CT-26細胞進行處理,考察在不同濃度處理條件下,阿魏酸對CT-26細胞的增殖情況和遷移能力等細胞生理活性的影響。研究表明,在同一處理濃度下,細胞存活率隨時間的延長而減少,但這種減少不是無限制的,在高濃度阿魏酸處理48 h和24 h時,其細胞存活率基本一致。而當處理時間相同時,隨著阿魏酸處理濃度增大,細胞存活率逐漸降低。雖然本研究在使用100 μmol/L阿魏酸處理時,結(jié)果提示阿魏酸在一定程度上對CT-26細胞的增殖有一定促進作用(圖1),但并不影響隨著阿魏酸濃度增加,細胞存活率降低的趨勢。同時阿魏酸對CT-26細胞的遷移能力影響的研究結(jié)果表明,阿魏酸對細胞遷移能力具有抑制作用。

細胞凋亡在生物體中的作用主要是維持穩(wěn)定,生物體主要依靠凋亡作用對癌細胞進行清除,一旦這種凋亡作用紊亂將導(dǎo)致細胞異常增殖[26]。凋亡通路上游主要受到caspase家族的調(diào)控,在細胞凋亡出現(xiàn)后,caspase3蛋白被激活,同時被切割并活化促進Cleaved caspase3發(fā)揮生物學(xué)作用。本研究結(jié)果表明,隨著阿魏酸處理濃度的增加,造成了Cleaved caspase3蛋白積累增加,達到調(diào)控細胞凋亡的目的。

研究表明,細胞自噬和細胞凋亡通路相互關(guān)聯(lián),互為調(diào)控。細胞自噬能夠抑制細胞凋亡,進行細胞的正常生命活動;二者會相互調(diào)控,相互作用[27-28]。細胞自噬也是維持生命穩(wěn)態(tài)的重要生命活動,而控制細胞自噬的主要標志蛋白為LC3和P62。當細胞自噬流增大的時候,LC3Ⅱ蛋白增多,而P62蛋白減少。本研究通過不同濃度阿魏酸對結(jié)腸癌細胞處理后發(fā)現(xiàn),低濃度阿魏酸對細胞自噬沒有明顯影響,在高濃度條件下,能夠一定程度上促進細胞自噬的發(fā)生。該結(jié)果提示,在低濃度阿魏酸條件下,CT-26細胞可能能夠通過細胞自噬維持正常生理活動,甚至促進細胞的增殖,而在高濃度條件下,一旦超過臨界點,細胞自噬與細胞凋亡進行協(xié)同作用,抑制細胞的存活,導(dǎo)致細胞程序性死亡。

綜上所述,一定濃度的阿魏酸可能通過細胞自噬及細胞凋亡通路中關(guān)鍵信號蛋白的表達量抑制CT-26細胞的增殖和遷移,并導(dǎo)致CT-26細胞死亡。該結(jié)果表明,作為阿魏酸鈉等功能成分的前體物質(zhì)阿魏酸具有本身特色生物活性,能夠?qū)毎懋a(chǎn)生一定的影響。后續(xù)將圍繞中草藥及食品中不同阿魏酸衍生物的具體含量及功能作用進行深入研究,明晰其具體協(xié)同關(guān)系及功能作用之間的強弱關(guān)系。