張潔仙,劉雪艷,單晴,姜麗巍,吳斌,魏佳

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊,830052)

2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工所,新疆 烏魯木齊,830091)

3(新疆農(nóng)產(chǎn)品加工與保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊,830091)

杏(PrunusarmeniacaL.)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化能力,已成為世界上最受歡迎的水果之一[1]。通常情況下,杏果實(shí)采后具有較高的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放,會(huì)導(dǎo)致果實(shí)采后品質(zhì)質(zhì)量的損失,從而限制了杏果實(shí)的運(yùn)輸、商業(yè)化和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的維持。因此,為防止后熟、維持果實(shí)感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),需要探究一種高效的方法以延長(zhǎng)果實(shí)的保質(zhì)期并增加水果的市場(chǎng)價(jià)值。

近年來(lái),NO處理作為一種可以更高效地提高果實(shí)采后品質(zhì)的策略已被廣泛應(yīng)用。NO具有氧化還原活性,可以通過(guò)擴(kuò)散方式透過(guò)細(xì)胞膜,在細(xì)胞之間具有生物學(xué)作用。另外,NO作為抗氧化劑與活性氧(reactive oxygen species,ROS)通路密切相關(guān),在氧化應(yīng)激期間淬滅ROS并減少脂質(zhì)過(guò)氧化,兩者都可以調(diào)節(jié)參與植物應(yīng)激反應(yīng)、初級(jí)代謝,進(jìn)而維持果實(shí)采后的衰老[2]。已經(jīng)證明NO可以誘導(dǎo)甜瓜[3]、桃[4]和番茄[5]等果實(shí)中的ROS系統(tǒng),這與延緩果實(shí)衰老的能力高度相關(guān)。過(guò)量的ROS與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)反應(yīng)以觸發(fā)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。然而,在植物中存在完善ROS清除系統(tǒng),其可調(diào)節(jié)ROS平衡并維持細(xì)胞的正常氧化還原狀態(tài)?？箟难?谷胱甘肽(ascorbic acid-glutathione,AsA-GSH)循環(huán)作為常見(jiàn)的ROS清除系統(tǒng),有利于保持ROS穩(wěn)態(tài)[6]。AsA-GSH循環(huán)主要包括抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)4種抗氧化酶,以及抗壞血酸(AsA)、脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid,DHA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)。研究發(fā)現(xiàn),NO處理梨果實(shí)后,提高了AsA和GSH含量,增強(qiáng)了APX、GR、MDHAR和DHAR的活性,延緩梨的衰老[7]。APX、GR、MDHAR、DHAR酶活性增強(qiáng),保持了桃果實(shí)貯藏過(guò)程中較高的抗氧化能力[8]。以上結(jié)果表明,NO與AsA-GSH循環(huán)存在密切聯(lián)系。然而,NO能否通過(guò)果皮和果肉AsA-GSH循環(huán)延緩杏果實(shí)采后的品質(zhì)的下降還尚未進(jìn)一步明確。

因此,本研究旨在研究NO處理對(duì)杏果實(shí)采后呼吸強(qiáng)度和品質(zhì)參數(shù)的影響;通過(guò)測(cè)定AsA-GSH循環(huán)相關(guān)指標(biāo)及關(guān)鍵酶活性,分析AsA-GSH循環(huán)在杏果實(shí)果皮和果肉的不同變化;闡明杏果實(shí)采后常溫下貯藏品質(zhì)變化與AsA-GSH循環(huán)存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

吊干杏(PrunusarmeniacaL.cv ‘Diaogan’)于2021年7月8日在新疆阿克蘇市四團(tuán)商業(yè)果園采收,杏果實(shí)采收期為綠色成熟階段(可溶性固形物含量≥11%),采收后運(yùn)回新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院,預(yù)冷24 h后進(jìn)行處理。選擇大小均勻、色澤均一,無(wú)機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害的杏果實(shí),進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

NO標(biāo)準(zhǔn)氣體(≥95%,純度),烏魯木齊鑫天意標(biāo)準(zhǔn)氣體有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮,天津市福晨化學(xué)試劑廠;三氯乙酸,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;還原性谷胱甘肽,瑞禧生物國(guó)產(chǎn)/進(jìn)口有限公司;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GY-4果實(shí)硬度計(jì),浙江艾德堡儀器有限公司;Check Point III O2/CO2分析儀,阿美特克(上海)有限公司;UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司;高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

采用30 μL/L的NO對(duì)杏果實(shí)進(jìn)行3 h的熏蒸處理,同時(shí)做CK(不熏蒸)空白對(duì)照組,每個(gè)處理3組平行試驗(yàn)[試驗(yàn)處理時(shí)溫度為室溫,(25±1.0) ℃]。NO處理時(shí)將杏果實(shí)置于熏蒸罐(100 cm×75 cm×75 cm)中,先抽真空,再注入氮?dú)馐构迌?nèi)壓力等于大氣壓力,然后使用氣體進(jìn)樣針注入NO標(biāo)準(zhǔn)氣體,立即拔出注射器針口,同時(shí)打開(kāi)風(fēng)扇,使NO氣體在密封箱中均勻分布。熏蒸結(jié)束,將果實(shí)分裝于盒蓋上帶有均勻小孔的保鮮盒中(尺寸為21 cm×15 cm×8.5 cm),每盒500 g左右杏果實(shí),放置在常溫、避光[溫度為(25±1.0)℃,相對(duì)濕度為(80±5)%]條件下貯藏,定期取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo),指標(biāo)平行3次,將樣品果皮果肉分開(kāi)后用液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱中,用于后期其他指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 硬度的測(cè)定

采用GY-4型果實(shí)硬度計(jì)對(duì)每個(gè)處理隨機(jī)選取的6個(gè)杏果實(shí)進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)部位為果實(shí)赤道處,探頭直徑為3 mm,重復(fù)3次。硬度以N表示。

1.3.2.2 可溶性固形物(total soluble solid,TSS)和可滴定酸(titratable acid,TA)含量的測(cè)定

隨機(jī)選取杏果實(shí),榨汁后過(guò)濾,采用PR-PAL-1型數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)定,各處理重復(fù)3次,取其平均值,TSS含量用%表示。

TA的測(cè)定參照曹建康等[9]的方法。TA采用氫氧化鈉滴定法測(cè)定,以蘋(píng)果酸計(jì)(折算系數(shù)0.067),單位:%。

1.3.2.3 呼吸強(qiáng)度的測(cè)定

使用Check Point III O2/CO2分析儀測(cè)定密閉盒內(nèi)CO2體積分?jǐn)?shù),呼吸強(qiáng)度以每小時(shí)每千克果實(shí)累積釋放的CO2質(zhì)量所表示,呼吸強(qiáng)度以mg/(kg·h)表示。

1.3.2.4 H2O2含量的測(cè)定

H2O2含量以μmol/g表示,按照WANG等[10]的方法進(jìn)行測(cè)定,略有修改。稱取凍樣(2.0 g)添加到3.0 mL冷丙酮(4 ℃)中,冰浴研磨勻漿,4 ℃下以10 000×g離心15 min。取上清液1.0 mL與0.1 mL 10%(體積分?jǐn)?shù))四氯化鈦-鹽酸溶液和0.2 mL氫氧化銨(13.38 mol/L)混合,然后在25 ℃下反應(yīng)5 min。離心混合物以獲得沉淀。用冷丙酮洗滌2次后,向沉淀中加入3.0 mL 2 mol/L鹽酸,在吸光度415 nm下記錄。

1.3.2.5 AsA和DHA含量的測(cè)定

AsA和DHA含量根據(jù)ZHU等[11]和伊麗達(dá)娜·迪力夏提等[12]的方法,略有改動(dòng)。將冷凍樣品(1.0 g)在5 mL 6%(體積分?jǐn)?shù))三氯乙酸中于4 ℃研磨1 min。將勻漿在10 000×g下于4 ℃離心10 min。收集上清液以確定AsA和DHA的含量。

AsA+DHA(總抗壞血酸)含量的測(cè)定:向1.0 mL粗酶液中加入0.5 mL 60 mmol/L二硫蘇糖醇-乙醇溶液,用磷酸氫二鈉-氫氧化鈉混合液將溶液pH調(diào)至7～8,置于室溫下10 min,然后加入0.5 mL 20% 三氯乙酸,將pH調(diào)至1～2,在543 nm處測(cè)其吸光值。

AsA的測(cè)定:取1 mL上清液加入1 mL 5%三氯乙酸、1 mL乙醇搖勻,再依次加入0.5 mL 0.4%(體積分?jǐn)?shù))正磷酸-乙醇、1.0 mL 0.5%(體積分?jǐn)?shù))二苯甲酮-乙醇、0.5 mL 0.03%(體積分?jǐn)?shù))三氯化鐵-乙醇。將溶液置于30 ℃下反應(yīng)90 min,然后在543 nm下測(cè)定其吸光值。AsA和DHA含量表示為mmol/g。

DHA含量:總抗壞血酸含量減去AsA含量即為DHA的含量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2.6 GSH和GSSG含量的測(cè)定

根據(jù)WANG等[10]和伊麗達(dá)娜·迪力夏提等[12]的方法測(cè)定了GSH和GSSG的含量稍作修改。將1.0 g冷凍樣品在2 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))偏磷酸中研磨,然后在10 000×g,4 ℃下離心10 min。

GSH+GSSG含量測(cè)定:300 μL粗酶液加入2.5 mL反應(yīng)液,其中包含500 μL反應(yīng)液A[50 mmol/L七水磷酸氫二鈉、20 mmol/L磷酸二氫鈉、10 mmol/L乙二胺四乙酸、0.2 mmol/L二硫代二硝基苯甲酸、0.02%(體積分?jǐn)?shù))牛血清蛋白]、500 μL反應(yīng)液B[1 mmol/L乙二胺四乙酸、50 mmol/L咪唑和0.02%(體積分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白]、500 μL反應(yīng)液C[5%(體積分?jǐn)?shù))磷酸氫二鈉,pH 7.5]和100 μL 9 mmol/L還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,以6%(體積分?jǐn)?shù))偏磷酸(pH 2.8)代替提取液作為對(duì)照,在412 nm下測(cè)定其吸光值。

GSSG含量測(cè)定:500 μL粗酶液加入2.5 mL乙烯吡啶,25 ℃下水浴1 h,在412 nm下測(cè)其吸光度,GSSG含量表示為mol/g。

GSH含量:總谷胱甘肽含量減去GSSG含量即為GSH含量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2.7 AsA-GSH循環(huán)酶活性的提取與測(cè)定

APX、GR、DHAR和MDHAR的活性根據(jù)HUANG等[13]的方法測(cè)定。稱取1.0 g果皮或果肉,加入3.0 mL預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.8,含有2.0 mmol/L AsA、0.2 mmol/L EDTA和2.0 g/L的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)。在4 ℃和10 000×g下離心20 min,并收集清液以測(cè)定APX、GR、MDHAR和DHAR活性。

混合200 μL粗酶、2.0 mL 100 mmol/L PBS(含有1.0 mmol/L EDTA,pH 7.5)、500 μL 20 mmol/L H2O2和800 μL 3.0 mmol/L EDTA,以測(cè)定APX活性。GR的反應(yīng)混合物由3.0 mL 100 mmol/L PBS(pH 7.5)、0.1 mL 5.0 mmol/L GSH氧化、0.2 mL粗酶液和30 μL 3.0 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)組成。

MDHAR反應(yīng)溶液包括0.2 mL粗酶液、1.7 mL 50 mmol/L PBS(pH 7.5)、200 μL 2.0 mmol/L AsA和100 μL 4.0 mmol/L NADPH。用于DHAR的2 mL反應(yīng)溶液由200 μL粗酶液、1.6 μL 0.1 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫化鉀緩沖液、100 μL 20 mmol/L谷氨酸和100 μL 8.0 mmol/L二十二碳六烯酸組成。

在290 nm和265 nm處每分鐘吸光度的0.01變化分別定義為一個(gè)單位(U)。APX和DHAR激活都被描述為U/g。測(cè)定340 nm處的吸光度,并將每分鐘0.01的變化定義為一個(gè)單位(U)。GR和MDHAR活性均被描述為U/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)過(guò)程完全是隨機(jī)進(jìn)行的。每個(gè)處理由3個(gè)重復(fù)組成,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖,SPSS 20.0和LSD測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO對(duì)杏果實(shí)采后硬度、呼吸強(qiáng)度、TSS和TA含量的影響

在圖1-A中,杏果實(shí)在貯藏的前1 d內(nèi)硬度保持不變,對(duì)照組果實(shí)的硬度隨著貯藏期延長(zhǎng)迅速下降。然而,在整個(gè)貯藏期內(nèi),NO處理的杏果實(shí)硬度的減小速度比對(duì)照緩慢。貯藏6 d,對(duì)照組的硬度僅為NO處理的61.96%(P<0.05)。

A-硬度;B-呼吸強(qiáng)度;C-TSS含量;D-TA含量

圖1-B顯示杏果實(shí)在貯藏期間6 d內(nèi)呼吸強(qiáng)度的變化。對(duì)照果實(shí)貯藏4 d時(shí)呼吸強(qiáng)度出現(xiàn)峰值,而NO處理杏果實(shí)5 d出現(xiàn)最大值,NO處理顯著延緩了杏果實(shí)呼吸強(qiáng)度峰值的出現(xiàn)。此后,呼吸強(qiáng)度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而急劇下降。貯藏第4天時(shí),NO處理的杏果實(shí)呼吸強(qiáng)度比對(duì)照降低30.92%(P<0.05)。

在貯藏期間對(duì)照組和處理組TA含量變化均呈先上升后下降趨勢(shì)(圖1-C);而NO處理的杏果實(shí)在整個(gè)貯藏期內(nèi)保持了比對(duì)照組更高的TA含量。在第3天和第6天時(shí),NO處理的杏果實(shí)TA含量分別比對(duì)照高22.4%和42.1%(P<0.05)。

如圖1-D所示,NO處理和對(duì)照組的杏果實(shí)TSS含量變化趨勢(shì)不一致。貯藏前4 d,NO處理組TSS含量低于對(duì)照。對(duì)照組的TSS含量在第4天達(dá)到峰值,比NO處理組高了14.56%;NO處理延緩了杏果實(shí)TSS含量峰值的出現(xiàn),同期比對(duì)照組高12.69%。整個(gè)貯藏期間,NO處理顯著延緩了杏果實(shí)TSS含量的變化(P<0.05)。

2.2 NO處理對(duì)杏果實(shí)采后H2O2含量的影響

果皮中H2O2含量從貯藏第1天開(kāi)始均存在顯著差異,除第2天外(圖2-A)。NO處理組顯著降低H2O2含量,并在第1天和第4天達(dá)到峰值,分別比對(duì)照組H2O2含量低11.30%和30.31%。在NO處理組中,果肉H2O2的含量被顯著抑制(圖2-B)。第6天時(shí),NO處理組H2O2含量比初始值低47.63%(P<0.05)。

A-果皮;B-果肉

2.3 NO處理對(duì)杏果實(shí)采后AsA和DHA含量的影響

貯藏期間,杏果實(shí)果皮和果肉AsA含量變化模式一致,呈先增加隨后減少趨勢(shì)(圖3-A、圖3-B)。貯藏前期,2組果皮和果肉中AsA含量均無(wú)顯著差異,在第3天時(shí)出現(xiàn)最大值,且對(duì)照組AsA含量比NO處理組低37.81%和41.3%。整個(gè)貯藏期間,果皮中AsA含量是果肉的3.23倍(P<0.05)。

在整個(gè)貯藏期間,果皮DHA含量顯示2個(gè)峰(圖3-C)。DHA含量的峰值出現(xiàn)在第2天和第4天,NO處理顯著增加了果皮中DHA的含量(P<0.05)。在第3天和第4天,NO處理果肉中DHA含量明顯增加,且是對(duì)照組的34.62%和22.65%(圖3-D)。然而,除第1 天外,NO處理明顯提高了杏果實(shí)不同組織中的DHA含量,NO處理組果皮果肉平均含量是對(duì)照組的1.93和1.81倍(P<0.05)。

A-果皮AsA;B-果肉AsA;C-果皮DHA含量;D-果肉DHA含量

2.4 NO處理對(duì)杏果實(shí)采后GSH和GSSG含量的影響

GSH含量的變化保持增加的趨勢(shì)(圖4-A、圖4-B)。除第1天外,NO處理顯著提高了杏果實(shí)不同組織的GSH含量。在第2～5天,果皮GSH含量變化最為顯著,且NO處理組GSH含量平均比對(duì)照組高1.21倍。NO處理的果肉中GSH含量在第2天出現(xiàn)最大值,比對(duì)照組增加了14.77%(P<0.05)。

貯藏期間,GSSG含量的變化趨勢(shì)與GSH相反(圖4-C、圖4-D)。除第4天和第6天外,NO處理降低了果皮的GSSG含量變化。同樣地,NO處理組果肉中GSSG含量在第5天顯著高于對(duì)照組,比對(duì)照組高39.83%(P<0.05)。無(wú)論是對(duì)照組還是NO處理組,GSSG含量第1天均為最大值,其中果皮GSSG含量是果肉的2.05倍(P<0.05)。以上結(jié)果表明,NO處理可以保持杏果實(shí)更高的氧化還原狀態(tài)。

A-果皮GSH;B-果肉GSH;C-果皮GSSG含量;D-果肉GSSG含量

2.5 NO處理對(duì)杏果實(shí)采后AsA-GSH循環(huán)DHAR和APX酶活性的影響

貯藏第2～6天內(nèi),杏果實(shí)果皮DHAR活性呈穩(wěn)定上升趨勢(shì),隨后迅速下降(圖5-A)。NO處理促進(jìn)了果皮中DHAR活性的提高,在貯藏第4天和第6天時(shí),NO處理果實(shí)的DHAR活性分別比對(duì)照組高15.79%和9.91%(P<0.05)。對(duì)照組和NO處理的果肉DHAR活性在貯藏期的前3 d內(nèi)均呈上升趨勢(shì),之后下降直至貯藏結(jié)束(圖5-B),但NO處理的DHAR活性在整個(gè)貯藏期內(nèi)均高于對(duì)照組。貯藏6 d后,NO處理組的DHAR活性比對(duì)照組高25.77%(P<0.05)。

A-果皮DHAR活性;B-果肉DHAR活性;C-果皮APX酶活性;D-果肉APX酶活性

APX活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)(圖5-C、圖5-D),NO處理組維持了較高水平的APX活性。果皮中NO處理的APX活性在第4天達(dá)到峰值,是對(duì)照處理的1.45倍(P<0.05);果肉APX活性與果皮的變化相似,且NO處理組與對(duì)照組存在顯著性差異,NO處理延緩了果肉中APX活性峰值的出現(xiàn),與對(duì)照組相比提高了37.02%(P<0.05)。

2.6 NO處理對(duì)杏果實(shí)采后AsA-GSH循環(huán)GR和MDHAR酶活性的影響

果皮的GR活性在第2～4天增加,隨后下降(圖6-A)。NO處理顯著提高了果皮的GR活性,并在第4天達(dá)到最大值,NO處理組比對(duì)照組高22.92%(P<0.05)。貯藏結(jié)束時(shí),對(duì)照組果皮GR活性比NO處理組低29.51%(P<0.05);果肉中GR活性與果皮活性變化趨勢(shì)一致,除第1天外,NO處理顯著提高了果肉中GR的活性,且第3天達(dá)到峰值(圖6-B)。

整個(gè)貯藏期間,NO處理激活了果皮MDHAR活性(圖6-C)。NO處理組的果皮MDHAR活性在第2、3、5、6天與對(duì)照組相比分別增加了16.69%、14.12%、20.65%和14.50%。在果肉中,NO處理均顯著促進(jìn)了MDHAR活性,與對(duì)照組相比分別增加了18.56%、27.67%、26.67%、13.75%、32.99%和26.43%(圖6-D)。整個(gè)貯藏期間,果皮MDHAR活性顯著高于果肉(P<0.05)。

A-果皮GR活性;B-果肉GR活性;C-果皮MDHAR活性;D-果肉MDHAR活性

3 討論

杏果實(shí)采后的成熟過(guò)程涉及一些生理反應(yīng),例如呼吸爆發(fā)、乙烯的積累和品質(zhì)變化[14-15]。其中,硬度、呼吸速率以及TA、TSS含量作為衡量果實(shí)品質(zhì)的重要因素,反映了貯藏期間果實(shí)采后的新鮮程度[16]。本研究發(fā)現(xiàn),NO處理能顯著抑制杏果實(shí)采后呼吸強(qiáng)度、TA和TSS含量的變化,并保持了果實(shí)的硬度,延緩貯藏期間品質(zhì)的下降(圖1)。近年來(lái),外源NO在改善果實(shí)采后品質(zhì)方面的研究越來(lái)越多。NO處理的桃果實(shí)在冷藏過(guò)程中TSS、TA含量均發(fā)生了變化[11]。樹(shù)莓果實(shí)在NO處理下表現(xiàn)出TSS和TA的最小損失,以及呼吸強(qiáng)度的緩慢增加,保持了貯藏品質(zhì)[17],表明NO在采后處理中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

果實(shí)衰老主要是由于過(guò)量的ROS引起的氧化損傷。植物已經(jīng)發(fā)展出有效的機(jī)制來(lái)控制ROS水平,當(dāng)這種平衡被破壞時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS水平將顯著增加,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不可逆氧化損傷。在此同時(shí),植物可以通過(guò)AsA-GSH循環(huán)解毒,并在細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[18-19]。本試驗(yàn)表明,NO處理維持了不同組織中H2O2含量的變化(圖2)。對(duì)照組果皮和果肉H2O2含量在貯藏后期下降可能是因較高抗氧化酶活性而受到抑制[20]。AsA和GSH在非酶促反應(yīng)中充當(dāng)ROS的清除劑,是決定果實(shí)抵御采后氧化應(yīng)激能力的關(guān)鍵標(biāo)志[21]。較高水平ROS清除劑可以減少ROS的積累,維持細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的氧化還原狀態(tài)。在本試驗(yàn)中,NO處理促進(jìn)了杏果實(shí)果皮和果肉中AsA和GSH的積累,降低了DHA和GSSG的含量(圖3、圖4),說(shuō)明NO處理可以激活果皮和果肉中的AsA-GSH循環(huán),通過(guò)調(diào)節(jié)ROS水平,從而延緩杏果實(shí)的衰老。此外,NO的釋放還可以提高抗氧化酶活性,促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)之間的轉(zhuǎn)換,減少ROS積累所造成的氧化損傷[22]。先前的研究證明植物細(xì)胞中AsA-GSH循環(huán)可以通過(guò)清除過(guò)量的ROS延遲收獲后衰老[5,23-24]。上述結(jié)果有力地證實(shí)了NO處理可以通過(guò)增強(qiáng)氧化還原穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)變來(lái)提高杏果實(shí)的抗氧化能力。

AsA-GSH循環(huán)的另一部分是抗氧化酶。APX、GR、DHAR和MDHAR是參與這一循環(huán)的關(guān)鍵酶,為促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)的再生和維持植物體內(nèi)還原物質(zhì)平衡發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10,12]。APX通過(guò)將H2O2還原成H2O,維持了細(xì)胞內(nèi)自由基的代謝平衡,并與GR協(xié)同將AsA氧化為DHA。在清除ROS的過(guò)程中,DHAR將GSH氧化為GSSG,GSH被GR回收,MDHAR和DHAR可分別將MDHA和DHA還原為AsA,較高的還原電位有利于維持植物正常的細(xì)胞功能和抗氧化應(yīng)激[25-26]。本研究中,NO處理杏果實(shí)果皮和果肉APX、MDHAR以及DHAR活性顯著增加(圖5-A、圖5-B、圖6-A、圖6-B)。GR是AsA-GSH循環(huán)的一種潛在酶,以維持AsA-GSH循環(huán),在ROS防御系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。NO處理激活了杏果實(shí)中GR活性(圖6-C、圖6-D),這與桃果實(shí)的結(jié)果類似[22]。上述結(jié)果證實(shí),AsA和GSH氧化還原狀態(tài)的變化與AsA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵酶活性的變化規(guī)律一致。另外,果皮中AsA-GSH循環(huán)抗氧化酶活性顯著高于果肉,可能是果皮對(duì)氧化損傷的防御能力高于果肉的原因,推測(cè)主要受果實(shí)組織結(jié)構(gòu)、抗氧化物質(zhì)和含水量的影響。外源褪黑激素處理后增強(qiáng)了櫻桃中AsA-GSH循環(huán)的抗氧化酶活性,維持了更好的ROS穩(wěn)態(tài),延遲了果實(shí)的衰老[10]。此外,經(jīng)減壓處理的桃果實(shí)表現(xiàn)出較高的AsA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵酶活性,減輕了0 ℃貯藏果實(shí)的冷害[27]。結(jié)果表明AsA-GSH是維持杏果實(shí)采后ROS穩(wěn)態(tài)和氧化還原狀態(tài)的重要機(jī)制。

綜上所述,30 μL/L NO較好地維持了杏果實(shí)采后的硬度以及呼吸速率、TSS、TA含量變化。NO處理通過(guò)激活了參與AsA-GSH循環(huán)的關(guān)鍵酶的活性,從而提高了AsA和GSH的含量,降低了DHA和GSSG的含量。以上數(shù)據(jù)表明NO處理較大程度地增強(qiáng)了果皮和果肉中抗氧化酶的活性,從而提高了杏果實(shí)AsA-GSH循環(huán)清除ROS的能力,維持了細(xì)胞氧化還原平衡,提升了杏果實(shí)采后的貯藏品質(zhì)。此外,AsA和GSH含量的變化與APX、MDHAR、DHAR和GR活性的變化具有相似的規(guī)律,證實(shí)了參與AsA-GSH循環(huán)的酶負(fù)責(zé)AsA和GSH的再生。