成津燕,方程,徐巖*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇 無錫,214122)

2(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

發(fā)酵酒精飲料在世界范圍內(nèi)被廣泛消費,并被認(rèn)為是最具經(jīng)濟(jì)價值與文化價值的發(fā)酵食品之一[1]。酒文化作為中國傳統(tǒng)文化的重要組成部分,貫穿在中國人的日常生活中,近代科技的發(fā)展促進(jìn)了釀酒科技的進(jìn)步,使得人們對于白酒的認(rèn)識不僅止步于嗜好品,飲酒與健康成為現(xiàn)代人最關(guān)注的話題之一[2]。雖然長期酒精暴露會導(dǎo)致肝損傷,但是白酒獨特而復(fù)雜的多菌種固態(tài)發(fā)酵與固態(tài)蒸餾過程導(dǎo)致其中含有上千種微量組分[3],其中許多成分具有重要的生物活性,例如有機(jī)酸、酚類、吡嗪類、萜烯類及不揮發(fā)脂肽類等物質(zhì),并已被證明對健康有積極影響[4];一些物質(zhì)還被認(rèn)為可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物改善酒精造成的損傷[5-7]。

Akkermansiamuciniphila是一種專性厭氧的革蘭氏陰性菌,隸屬疣微菌門疣微菌科中的Akkermansia屬[8],由荷蘭學(xué)者DERRIEN于2004年在人類糞便中首次發(fā)現(xiàn)并命名[9]。它通過將黏蛋白作為唯一的氮和碳源來定植于腸道,為哺乳動物腸道中最豐富的微生物之一[10]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),A.muciniphila具有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)腸屏障功能、維持黏液層厚度及抗炎等多種有益生理功能,因而被認(rèn)為是“下一代益生菌”[11]。A.muciniphila在發(fā)現(xiàn)至今不到20年時間里,研究已從小鼠模型觀察發(fā)展到代謝綜合征患者干預(yù),是其他“下一代益生菌”無法比擬的,因而在食品工業(yè)領(lǐng)域和學(xué)術(shù)界獲得了極大關(guān)注[12]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn),A.muciniphila是改善酒精相關(guān)疾病的關(guān)鍵腸道微生物[13],直接灌胃補充A.muciniphila能夠通過保護(hù)腸屏障完整性改善酒精攝入引起的肝損傷[14]以及酒精相關(guān)的抑郁癥[15];大黃提取物與硬脂酸干預(yù)可通過增加腸道A.muciniphila豐度從而改善酒精誘導(dǎo)的肝損傷[16-17];另外,在我們的前期研究中也發(fā)現(xiàn),與純酒精喂養(yǎng)相比,白酒喂養(yǎng)可以通過減緩腸道A.muciniphila相對豐度的降低,從而減輕腸道屏障破壞和肝損傷程度[18]。然而,以上研究都是基于高通量測序觀察A.muciniphila的相對豐度,A.muciniphila在腸道中的準(zhǔn)確數(shù)量并不清楚,A.muciniphila隨白酒干預(yù)時間的變化規(guī)律也尚無文獻(xiàn)報道。

本研究通過純培養(yǎng)手段從小鼠糞便中篩選到一株A.muciniphila模式菌株ATCC BAA-835,并建立了基于實時熒光定量PCR測定腸道A.muciniphila數(shù)量的方法;同時通過建立白酒干預(yù)的小鼠動物模型,探究了腸道A.muciniphila隨白酒干預(yù)的變化規(guī)律,并比較了與酒精干預(yù)之間的差異。本研究對開發(fā)A.muciniphila作為新一代益生菌防治酒精性肝損傷具有理論意義和應(yīng)用前景,同時對挖掘白酒中有益活性物質(zhì)以及闡明活性物質(zhì)的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實驗材料

實驗菌株:大腸桿菌(JM109)為實驗室保存;A.muciniphila(ATCC BAA-835)從小鼠糞便樣本中分離得到。

實驗動物:SPF級雄性C57BL/6 J小鼠(8周,20～22 g),斯萊克實驗動物(上海)有限公司。

1.1.2 試劑和儀器

實驗所用白酒和食用級乙醇均來自本實驗室貯存;BHI培養(yǎng)基,海博生物技術(shù)(青島)有限公司;豬胃黏蛋白,Sigma-Aldrich(德國)公司;N-乙酰-D-氨基葡萄糖,麥克林生物科技(上海)有限公司;蘇氨酸、瓊脂、L-半胱氨酸鹽酸鹽、吐溫80、LB培養(yǎng)基,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;TOPO-Blunt Cloning Kit,天霖生物科技(上海)有限公司;PrimeStar Max DNA Polymerase,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;DNA Gel Extractuon Kit、PCR Product Purification Kit、Plasmid Mini-PREPS Kit、0.1 mL 8 Strip Real-time PCR Tubes,生工生物工程(上海)股份有限公司;TIANamp Bacteria DNA Kit、TIANamp Stool DNA Kit,天根生化科技(北京)有限公司;2×Rapid Taq Master Mix、ChamQ SYBR qPCR Master Mix,諾唯贊生物科技(南京)股份有限公司;MGC 7 L厭氧盒、MGC 3.5 L厭氧產(chǎn)氣袋、MGC氧氣指示劑,三菱化學(xué)(日本)株式會社;Bugbox厭氧工作站,貝克(英國)公司;NanoDrop 8000超微量分光光度計,賽默飛世爾科技(美國)公司;StepOne熒光定量PCR儀,應(yīng)用生物系統(tǒng)(美國)公司。

篩菌所用培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)基參考翟齊嘯等[19]研究設(shè)置;液體初篩培養(yǎng)基參考朱永亮等[20]研究設(shè)置,成分為BHI培養(yǎng)基30 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5 g、蘇氨酸5.0 g、N-乙酰-D-氨基葡萄糖5.0 g、吐溫80 0.5 mL、加水定容至1 L;固體分離培養(yǎng)基在液體初篩培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入瓊脂18 g。

1.1.3 引物

16S通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′;參考文獻(xiàn)[21]合成特異性引物,正向引物AM1:5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3′;反向引物AM2:5′-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3′,安升達(dá)(天津)生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選

1.2.1.1 樣品均質(zhì)與富集

選取8只正常小鼠的糞便。每日上午灌胃前將每只小鼠單獨放置于空籠,按照編號對小鼠糞便進(jìn)行單獨采集,每管3～5顆小鼠糞便。取3～5顆小鼠糞便加入10 mL PBS中進(jìn)行均質(zhì),記作10-1,梯度稀釋均質(zhì)液至10-5,吸取各梯度均質(zhì)液500 μL加入4.5 mL富集培養(yǎng)基中,將富集管放置于37 ℃厭氧恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。選取較為均一、懸濁、無沉淀與絲狀物的較高稀釋度的富集管,吸取1 mL培養(yǎng)液12 000 r/min離心5 min后棄上清液,使用50～200 μL無菌水重懸,沸水浴煮沸10～15 min,12 000 r/min離心1 min,取上清液為模板使用AM1與AM2為引物進(jìn)行PCR檢測有無陽性條帶,目標(biāo)片段長度為329 bp,反應(yīng)采用10 μL體系,擴(kuò)增條件為2×Rapid Taq Master Mix 5 μL,AM1與AM2各0.2 μL,模板0.1 μL,ddH2O 4.5 μL;反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,32個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。

1.2.1.2 分離培養(yǎng)

將得到陽性條帶的富集管菌液使用PBS緩沖液進(jìn)行梯度稀釋,吸取10-5～10-8各稀釋度200 μL分別涂布至固體分離培養(yǎng)基,每個稀釋度涂布3個平板;將涂布完成的平板放置于厭氧盒,放入2個三菱瓦斯化學(xué)株式會社(Mitsubishi Gas Chemical Company,MGC)3.5 L厭氧產(chǎn)氣袋與1個氧氣指示劑,迅速將盒子密封,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。

1.2.1.3 初篩鑒定

選擇培養(yǎng)完成的固體平板上直徑在1 mm以內(nèi)、乳白色、黏稠狀單菌落,挑取菌落接種于5 mL液體初篩培養(yǎng)基中,于37 ℃厭氧恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。選擇渾濁初篩管,使用AM1與AM2引物擴(kuò)增特異性片段,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性條帶。選取有陽性條帶的初篩管菌液使用16S通用引物27F與1492R進(jìn)行擴(kuò)增,目標(biāo)片段長度為1 500～1 600 bp,反應(yīng)采用10 μL體系,擴(kuò)增條件為2×Rapid Taq Master Mix 5 μL,27F與1492R各0.2 μL,模板0.1 μL,ddH20 4.5 μL;反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,32個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,對序列結(jié)果進(jìn)行BLAST搜索比對并保存菌種。

1.2.2 菌種活化與培養(yǎng)

A.muciniphila:在超凈工作臺中,使用接種環(huán)蘸取保存管中的菌液,在BHI固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線后,在厭氧工作站中37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。挑取平板上的單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基過夜活化18 h,取2%(體積分?jǐn)?shù))接種量進(jìn)行培養(yǎng)24 h。

1.2.3 T-Akk標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取A.muciniphila細(xì)菌基因組DNA,嚴(yán)格按照說明書操作,提取的DNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆?。參考前人研究進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建[22],使用PrimeStar Max DNA Polymerase擴(kuò)增出A.muciniphila特異DNA序列,反應(yīng)采用50 μL體系,擴(kuò)增條件為1×PrimeStar Max Mix 25 μL,引物AM1與AM2各1 μL,模板200 ng,ddH2O補充至總體系50 μL,反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目標(biāo)條帶,純化后使用NanoDrop 8000超微量分光光度計測定DNA濃度,使用TOPO-Blunt Cloning Kit將擴(kuò)增目的基因插入TOPO載體,克隆反應(yīng)體系為10 μL,按照載體、目的片段摩爾比1∶3,室溫孵育5 min。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(JM109)感受態(tài)細(xì)胞,細(xì)菌恢復(fù)至正常生長狀態(tài)吸取菌液涂布抗生素平板。使用抗生素平板篩選陽性克隆菌落,挑取單一菌落至抗生素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h,提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行測序。利用NCBI中BLAST與SnapGene軟件比對測序結(jié)果與A.muciniphila基因組,并保存目標(biāo)菌種T-Akk大腸桿菌。

1.2.4 動物實驗造模

所有小鼠自由進(jìn)食,水與飼料充足。適應(yīng)1周后,將小鼠隨機(jī)分為3組:對照組(8只)、白酒組(8只)、酒精組(8只)分別給予無菌水、白酒以及食用酒精。為保證白酒組和乙醇組之間小鼠攝入的酒精劑量一致,使用酒精計測定白酒酒精含量后,按照設(shè)定的酒精含量計算稀釋倍數(shù),灌胃前使用無菌水將每種白酒和乙醇稀釋至相同酒精濃度。灌胃酒精劑量采用梯度增加的方式進(jìn)行:初始酒精劑量為每天3.2 g/kg,此后每5 d梯度增加0.6 g/kg,直至第20天達(dá)到5.6 g/kg,保持此劑量至實驗結(jié)束(圖1)。造模方法參考課題組前期研究[18,23]。

圖1 動物造模方案

1.2.5 實時熒光PCR

參考文獻(xiàn)[24]使用SYBR Green I作為熒光指示劑,PCR反應(yīng)體系采用20 μL,擴(kuò)增條件為ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,AM1與AM2各0.4 μL,模板1 μL,ddH2O補充體系至20 μL;反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。在72 ℃設(shè)置熒光信號采集。反應(yīng)結(jié)束設(shè)置65～95 ℃溶解曲線,溫度以0.5 ℃/5 s遞增。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

參考前人研究建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[25-26]。培養(yǎng)T-Akk大腸桿菌12 h,按照說明書使用Plasmid Mini-PREPS Kit提取T-Akk質(zhì)粒并測定DNA濃度,根據(jù)公式(1)計算拷貝數(shù),將拷貝數(shù)稀釋為101～109九個濃度梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光PCR實驗,各設(shè)3個平行樣,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(1)

式中:DNA質(zhì)量濃度,ng/μL;載體長度,bp;靶DNA長度,bp。

1.2.7 樣本收集與基因組提取

收集第1、3、5、8、12周白酒、酒精及對照組的小鼠糞便于凍存管,不立即使用則貯存于-20 ℃。精確稱取小鼠糞便質(zhì)量,使用TIANamp Stool DNA Kit提取基因組DNA?？瞻讓φ找詃dH2O代替模板DNA。每組設(shè)置3個生物學(xué)平行,每1個生物學(xué)平行設(shè)置3個技術(shù)平行。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

圖形制作均采用Origin 2023進(jìn)行繪制。數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,所有實驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 A.muciniphila模式菌株篩選

經(jīng)富集、分離、初篩培養(yǎng),選擇渾濁初篩管,使用AM1與AM2引物擴(kuò)增特異性片段,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性條帶(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除泳道3外,其余泳道均有陽性條帶,進(jìn)一步對陽性條帶進(jìn)行測序比對發(fā)現(xiàn),所有陽性條帶與A.muciniphilaATCC BAA-835的相似度均為100%,表明本研究所使用的C57BL/6 J小鼠腸道中的A.muciniphila為模式菌株ATCC BAA-835。

圖2 初篩菌液特異性片段擴(kuò)增

2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

以A.muciniphila基因組DNA為模板,使用引物對AM1/AM2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得一條與目的基因片段長度(329 bp)相符的特異性擴(kuò)增條帶(圖3),對目的片段進(jìn)行膠回收和純化,并測定DNA濃度,加入40 ng目的片段至10 μL克隆反應(yīng)體系中孵育。

圖3 目的基因片段擴(kuò)增

吸取菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR與10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果均為陽性(圖4-a)。4個陽性菌落測序結(jié)果均與A.muciniphila特異性片段一致(圖4-b),表明目標(biāo)片段成功插入TOPO載體中,T-Akk質(zhì)粒構(gòu)建完成。

a-陽性菌落鑒定結(jié)果;b-菌落測序結(jié)果(部分序列)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以數(shù)量級為101～109的T-Akk質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光定量PCR測定對應(yīng)Ct值。以DNA拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性關(guān)系為Ct=-3.361x+38.89,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1(圖5),線性關(guān)系良好,表明可進(jìn)一步用于腸道A.muciniphila定量分析。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 腸道A.muciniphila隨白酒和酒精干預(yù)的變化規(guī)律

通過以上方法對造模第1、3、5、8和12周小鼠糞便中的A.muciniphila進(jìn)行定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠糞便中A.muciniphila豐度趨于平穩(wěn),酒精組與白酒組小鼠糞便中A.muciniphila豐度隨造模時間呈現(xiàn)下降趨勢;且與酒精組相比,白酒組小鼠糞便中A.muciniphila數(shù)量下降趨勢較緩(圖6)。

圖6 小鼠糞便中A.muciniphila豐度隨時間變化規(guī)律

適應(yīng)期結(jié)束后(第1周),酒精組小鼠A.muciniphila的數(shù)量為[(5.56±0.30) lg(copies/mg)],白酒組小鼠A.muciniphila數(shù)量為[(5.40±0.22) lg(copies/mg)],略低于酒精組;造模結(jié)束后,酒精組與白酒組小鼠糞便中A.muciniphila數(shù)量均低于對照組,說明白酒和酒精攝入均會導(dǎo)致腸道A.muciniphila數(shù)量降低。酒精組小鼠A.muciniphila數(shù)量為[(4.41±0.06) lg(copies/mg)],白酒組小鼠A.muciniphila數(shù)量為[(4.61±0.17) lg(copies/mg)],略高于酒精組(圖6);酒精組下降比率高于白酒組(表1)。

表1 干預(yù)前后小鼠糞便中A.muciniphila豐度下降比率

綜上所述,在相同酒精攝入劑量條件下,白酒喂養(yǎng)與純酒精喂養(yǎng)相比能夠減緩A.muciniphila的損失程度,這與FANG等[18]研究結(jié)果相似,表明白酒中活性成分可能是通過保護(hù)酒精誘導(dǎo)的A.muciniphila豐度的降低,從而減輕腸道屏障功能的破壞和肝損傷。

3 結(jié)論

本研究通過純培養(yǎng)的方法篩選到了一株A.muciniphila模式菌株ATCC BAA-835,采用實時熒光定量PCR方法并使用重組質(zhì)粒T-Akk作為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線,并建立了腸道A.muciniphila的絕對定量方法,同時通過建立為期12周慢性白酒灌胃干預(yù)小鼠模型,測定了小鼠糞便中A.muciniphila的數(shù)量,探究了白酒干預(yù)對小鼠腸道中A.muciniphila數(shù)量的影響以及與酒精干預(yù)之間的差異。

本研究使用重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建,相比于傳統(tǒng)方式中使用A.muciniphila基因組為標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線更為簡便、快速。結(jié)果發(fā)現(xiàn),白酒與酒精攝入均會導(dǎo)致小鼠腸道A.muciniphila數(shù)量的降低;相同酒精攝入劑量條件下,白酒喂養(yǎng)與純酒精喂養(yǎng)相比能夠減緩A.muciniphila的損失程度,說明白酒中含有可以增加A.muciniphila數(shù)量的活性物質(zhì)。然而白酒中何種生物活性物質(zhì)保護(hù)了A.muciniphila數(shù)量的下降及其保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。本研究體現(xiàn)了挖掘白酒中生物活性物質(zhì)的價值與必要性,并為A.muciniphila作為下一代益生菌改善酒精引起的各種損傷提供了科學(xué)依據(jù)。