黃雄挺,郭紫晶,周 瀧,陳勁松,張志東,李彥敏

西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041

0 引言

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是生豬生產(chǎn)國最常見的病毒性疾病之一。自20世紀(jì)80年代暴發(fā)以來,PRRS對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。根據(jù)遺傳和抗原分析,豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)分為2種主要基因型:PRRSV-1(歐洲型)和PRRSV-2(美洲型)[3-4]。PRRS于1995年在中國首次報(bào)道,命名為CH-1a,證實(shí)了PRRSV在中國的存在[5]。2006年,中國暴發(fā)了一種病因不明的“高熱”疾病?；旧纤怯赏蛔兊腜RRSV病毒引起的,后來被命名為高致病性PRRSV(HP-PRRSV)。該變異具有獨(dú)特的NSP2中30(1+29)個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失的特征,并已成為該領(lǐng)域優(yōu)勢的流行毒株[6]。NADC30株于2008年首次在美國被發(fā)現(xiàn),其特征是NSP2缺失131(111+1+19)個(gè)氨基酸[7]。NADC30-like株在2013年傳入中國,近年來傳播迅速,廣泛流行至今[8]。

PRRSV是一種小的、包膜的單股正鏈RNA病毒。PRRSV根據(jù)最新分類新歸為屬于動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)、動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、尼多病毒目(Nidovirales),至少含有11個(gè)開放閱讀框(ORFs)[9-10]。其中非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2與結(jié)構(gòu)蛋白GP5基因的變異最大,Nsp2是PRRSV基因組中最異質(zhì)和可變的編碼蛋白,在田間菌株中,Nsp2編碼區(qū)存在自然的替換、插入和缺失,研究發(fā)現(xiàn)所有HP-PRRSV毒株在Nsp2中具有相同的不連續(xù)30aa缺失,這種獨(dú)特的遺傳模式最初被認(rèn)為與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[11-12],因而該區(qū)域常作為區(qū)分不同亞型PRRSV的鑒別區(qū)域[13]。GP5是由ORF5基因編碼的囊膜糖蛋白,歐洲型GP5蛋白約有201aa,而美洲型為200 aa,由于其變異性和免疫學(xué)特性,其已成為分析PRRSV遺傳變異的主要目標(biāo)蛋白[14]。因此,Nsp2與GP5基因是監(jiān)測遺傳變異和開展鑒別診斷試驗(yàn)的理想標(biāo)記物。PRRSV因其較高的突變率和重組率,具有復(fù)雜的遺傳多樣性[15]。中國豬群中多種PRRSV譜系共存,包括譜系1、3、5和8,促進(jìn)了不同譜系之間的PRRSV重組[16-17]。PRRSV重組不僅會(huì)導(dǎo)致新的PRRSV基因型的產(chǎn)生,還會(huì)引起致病性的變化[18]。近年的監(jiān)測發(fā)現(xiàn),我國PRRSV的重組不僅發(fā)生在野毒之間,而且會(huì)有野毒與減毒活疫苗的重組,這些重組可導(dǎo)致新變種的發(fā)展,導(dǎo)致對(duì)豬的替代致病性,為現(xiàn)有疫苗預(yù)防和控制PRRS帶來了新的挑戰(zhàn)[19-20]。本研究通過分析陜西、河南2地養(yǎng)殖場采集的PRRSV陽性樣品中Nsp2和GP5基因的遺傳變異,了解現(xiàn)階段陜西、河南2地PRRSV的流行特點(diǎn),為制定有效的防控措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

2020—2022年,從陜西和河南的豬場采集了252份肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、血液和精液樣本,這些樣本來自出現(xiàn)高熱、呼吸困難和流產(chǎn)癥狀的疑似感染PRRSV的豬只。

1.1.2 主要試劑

GeneRed 核酸染料,DL-2000標(biāo)記染料,購自天根生化科技(北京)有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,購自TaKaRa;TRIZOL提取試劑,50×TAE均購自賽默飛公司。

1.1.3 主要儀器

梯度PCR、恒溫振蕩器、微波爐(GALANZ)、水平電泳儀。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,鯤鵬基因(北京)科技有限責(zé)任公司;智能型多功能核酸蛋白圖像工作站,廣州博鷺騰生物科技有限公司;超聲破碎儀,Branson公司;高速冷凍離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

鑒于中國現(xiàn)在常流行的PRRSV 譜系較為復(fù)雜,根據(jù)GenBank中PRRSV代表毒株VR-2332(登錄號(hào)為AY150564) 使用 NCBI 軟件選擇了保守區(qū)域,并使用Primer Premier 5.0軟件為PRRSV的Nsp2基因、ORF5基因區(qū)域設(shè)計(jì)病毒特異性引物,上海生物工程有限公司合成。引物具體信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.2 樣品處理及核酸提取

取適量樣本在組織研磨儀中充分研磨,反復(fù)凍融3次,于離心機(jī)上6 000 r/min 離心,取200 μL上清液;直接取血清及精液200 μL,用TRIZOL試劑法提取病毒RNA,同時(shí)提取 PRRSV陽性對(duì)照樣品的RNA,使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄,所有方法按照說明書操作,將得到的核酸于-80 ℃保存,備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并使用表1所列的引物對(duì)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增系統(tǒng):2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上游和下游引物10 μ mol/L,cDNA 模板2 μL,ddH2O補(bǔ)充至25 μL。以ddH2O作為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共37個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析

從GenBank中選擇26株不同基因型、不同譜系PRRSV ORF5基因和Nsp2基因(見表2)序列作為參考序列,包括PRRSV-1型3株、PRRSV-2 型23株,其中譜系1毒株5株,譜系3,5,8毒株各6株[21]。利用MEGA11軟件通過鄰接法分析遺傳變異,構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

表2 參考毒株信息Table 2 Reference strain information

2 結(jié)果

2.1 樣品PCR檢測

經(jīng)檢測,252份樣品中檢測出陽性樣品39份,陽性率為15.6%(見表3);在39份陽性樣品中擴(kuò)增出10條Nsp2基因全長和5條ORF5基因長,其中GP-10與Nsp2-1為同一株,如表4、表5所示。

表3 PRRSV 樣品陽性率統(tǒng)計(jì)Table 3 PRRSV sample positive rate statistics

表4 Nsp2陽性樣本信息Table 4 Information of Nsp2 positive samples

表5 GP5陽性樣本信息Table 5 Information of GP5 positive samples

2.2 序列比對(duì)與遺傳進(jìn)化分析

2.2.1 ORF5基因與Nsp2基因序列比對(duì)

經(jīng)核苷酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn):從陜西與和河南地區(qū)獲取的5株P(guān)RRSV毒株與GenBank中26株參考毒株P(guān)RRSV ORF5基因的核苷酸序列同源性為79.7%～99.7%,5株P(guān)RRSV ORF5基因序列與PRRSV-2型和PRRSV-1型的同源性分別為79.7%～99.7%、57.9%～63.2%。10株P(guān)RRSV毒株與GenBank中26株P(guān)RRSV參考毒株的Nsp2基因之間的核苷酸序列同源性為38.2%～92.2%,與PRRSV-2型和PRRSV-1型參考毒株的同源性分別為38.2%～92.2%、48.2%～50.7%。以VR-2332經(jīng)典株ORF5基因與Nsp2基因序列作為參考,5株ORF5基因與VR-2332株的同源性為85.3%～99.7%,其基因含611個(gè)堿基,其中,GP5-10、GP5-7與GP5-5株的ORF5基因在第83、170、與443位堿基出現(xiàn)T堿基突變?yōu)镃堿基,在第197位堿基由A/C堿基突變?yōu)門堿基,在第413位堿基由C堿基突變位T堿基,在第558位堿基有T堿基突變?yōu)锳堿基;在5株 PRRSV ORF5 基因中,僅有GP5-5株在第31～38位連續(xù)插入8位堿基。而Nsp2-1、Nsp2-2與Nsp2-3株在第39位堿基由A/G突變?yōu)镃,在第62、375位堿基由C/G突變?yōu)锳,在第77位堿基由A突變?yōu)門;Nsp-1與Nsp2-2在第155位堿基由C突變?yōu)門,在第498位堿基由T/G/A突變?yōu)镃。由此可見,ORF5基因與Nsp2基因核苷酸序列存在不同程度的變異,相比于ORF5基因,Nsp2基因總體變異更大。

2.2.2 氨基酸序列比對(duì)

經(jīng)氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn):從陜西與和河南地區(qū)獲取的5株P(guān)RRSV毒株與GenBank中26株P(guān)RRSV參考毒株的ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為60.9%～99.5%;5株P(guān)RRSV毒株ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為64.9%～99.5%;10株P(guān)RRSV毒株與GenBank中26株P(guān)RRSV參考毒株的Nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為79.4%～91%;10株P(guān)RRSV毒株Nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為92.7%～97.8%;5株P(guān)RRSV ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列與參考毒株P(guān)RRSV-2型PRRSV-1型的同源性分別為64%～99.5%、30%～35%,10株P(guān)RRSV Nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列與PRRSV-1型參考毒株的同源性為36.6%～38.9%。以VR-2332株ORF5和Nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列作為參考,如圖1框選區(qū)域,在誘騙表位V27～N30區(qū),獲取的5株P(guān)RRSV 有GP5-10、GP5-7和GP5-5株在第28位發(fā)生 L→S 突變;在中和表位 S37 ～ L45 區(qū),GP5-10、GP5-7和GP5-5株第37位發(fā)生缺失,僅有99L株在地42位發(fā)生Y→C 突變;在非中和表位V180～P200區(qū),GP5-10、GP5-7和GP5-5株分別在180位、182位以及195 位發(fā)生K→R、L→S和E→R突變。

圖1 ORF5基因的氨基酸序列分析Figure 1 Amino acid sequence analysis derived from ORF5 gene

如圖2框選區(qū)域,在誘騙表位V27～N30區(qū),Nsp2-3株在第30位發(fā)生 I→T突變;在中和表位 S37 ～ L45 區(qū),Nsp2-1、Nsp2-2、Nsp2-3均未發(fā)生突變;在非中和表位V180～P200區(qū),Nsp2-3株分別在184位和196 位發(fā)生R→W和N→D突變。

圖2 Nsp2基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析Figure 2 Amino acid sequence analysis derived from Nsp2 gene

2.2.3 遺傳進(jìn)化分析

基于對(duì)PRRSV的ORF5基因序列(600 bp)建立遺傳進(jìn)化樹,見圖3。

圖3 PRRSV GP5基因遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果Fig.3 Phylogenetic tree construction results based on PRRSV ORF5 gene

由圖3可知:5株GP5基因PRRSV毒株均在PRRSV-2型在同一簇,其中有3株為PRRSV-2型第1譜系毒株,2株為PRRSV-2型第5譜系的毒株。譜系1中的3株毒株為GP5-HN1-5、GP5-HN1-7、GP5-HN1-10與代表毒株NADC30親緣關(guān)系最近;另外譜系5的2株毒株GP5-704-99 L-SX1、GP5-704-100 L-SX1與代表VR2332親緣關(guān)系最近。

基于對(duì)PRRSV的Nsp2基因序列分析并繪制遺傳進(jìn)化樹,見圖4。

由圖4可知:10株Nsp2基因PRRSV毒株均在PRRSV-2型第1譜系的毒株,與NADC30株的親緣關(guān)系最近。

3 討論

自2006年HP-PRRSV暴發(fā)以來,國內(nèi)學(xué)者對(duì)于PRRSV流行及遺傳變異情況的研究從未間斷,由于PRRSV遺傳變異的多樣性,PRRSV仍未能得到有效控制[22]。本研究通過對(duì)2020—2022年收集來自陜西省與河南省2地豬場豬群中的252份疑似感染PRRSV的豬樣品進(jìn)行檢測,陽性樣品有39例,總陽性率為15.6%。其中,擴(kuò)增出10條Nsp2基因、5條ORF5基因,5株ORF5基因PRRSV毒株均在PRRSV-2型在同一簇,3株為PRRSV-2型譜系1毒株(GP5-5、GP5-7、GP5-10)與代表毒株NADC30親緣關(guān)系最近,2株為PRRSV-2型譜系5的毒株(99L、100L)與NADC30代表毒株的親緣關(guān)系最近,其中有1株Nsp2基因與ORF5基因來自于同一株。說明陜西和河南地區(qū)發(fā)生了第1譜系和第5譜系毒株的混合流行,其中GP5-10與Nsp2-1、Nsp2-2、Nsp2-3均為河南豬場樣本,這提示河南地區(qū)豬場可能同時(shí)存在多種譜系毒株,GP5-10與Nsp2-1來自同一樣品皆屬于譜系1,推測該豬場毒株可能還未發(fā)生重組。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),本研究擴(kuò)增的Nsp2基因序列數(shù)量多ORF5基因,推測可能是樣品中ORF5基因的含量過低或核酸發(fā)生降解,或是ORF5基因發(fā)生突變,導(dǎo)致檢測靈敏性降低。韋麗麗[23]采用RT-PCR方法對(duì)91份PRRSV陽性樣品的Nsp2與ORF5基因特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增,只獲得18條Nsp2基因序列和48條ORF5基因序列,與本研究的結(jié)果類似。因此,研究并開發(fā)更高效、精準(zhǔn)、低成本的檢測方法對(duì) PRRSV 臨床檢測與診斷具有重要應(yīng)用價(jià)值。

通過對(duì)10條Nsp2基因5條ORF5基因的核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)5株P(guān)RRSV ORF5基因序列與PRRSV-2型和PRRSV-1型的同源性分別為79.7%～99.7%、57.9%～63.2%,10株P(guān)RRSV Nsp2基因與PRRSV-2型和PRRSV-1型參考毒株的同源性分別為38.2%～92.2%、48.2%～50.7%,10條Nsp2基因序列5條ORF5基因序列均有不同程度的突變,這也表明PRRSV遺傳變異是復(fù)雜多樣的,位于高變區(qū)的Nsp2基因和ORF5基因的突變和重組仍然是PRRSV廣泛流行的最主要原因,因而對(duì)特異性疫苗的研制和PRRSV的防控難度也是與日俱增。

我國Ⅱ型PRRSV目前屬于多種PRRSV亞型共存的狀態(tài),PRRS廣泛流行至今,仍沒有研發(fā)出理想的疫苗。田間毒株的多樣性及頻繁變異增加了PRRS的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷和疫苗控制的難度,且不同地區(qū)PRRSV毒株之間存在較大的抗原性差異[24-25],國內(nèi)通常大規(guī)模使用弱毒PRRSV疫苗對(duì)養(yǎng)殖場進(jìn)行免疫,但低劑量疫苗存在安全問題,可能出現(xiàn)病毒毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象,為疾病防控帶來了難度和挑戰(zhàn)[26]。因此,實(shí)時(shí)監(jiān)測 PRRSV 株系的基因突變動(dòng)態(tài),探索其基因變異和重組模式,可以為該疾病的防控提供更科學(xué)的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

陜西和河南地區(qū)豬場存在譜系1和譜系5毒株的混合流行,但在河南豬場同一樣品的Nsp2基因與ORF5基因均在譜系1,推測該豬場目前還未發(fā)生毒株重組的現(xiàn)象,PRRS依然是我國豬場中普遍存在且最具威脅的傳染病之一。