余傳剛 李 濤 魏榮興 李 強(qiáng)

近代以來(lái)，犬在軍事戰(zhàn)爭(zhēng)、刑事偵查、消防安全、搶險(xiǎn)救災(zāi)和維穩(wěn)導(dǎo)盲等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。為維持品相、性能和血統(tǒng)等特征，在犬培育過(guò)程中常采用近交純繁的方式，促使犬遺傳病頻發(fā)，且發(fā)病后致死率和致殘率極高。目前，遺傳病已成為危害犬身心健康和工作質(zhì)量的重要因素，給養(yǎng)犬機(jī)構(gòu)的繁育工作和工作犬培訓(xùn)工作帶來(lái)嚴(yán)重阻力。遺傳病基因篩查技術(shù)可對(duì)犬遺傳病決定基因和關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)診斷，在發(fā)病前檢測(cè)出患病風(fēng)險(xiǎn)，做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)警、早處置，用相對(duì)較小的成本，解決關(guān)鍵問(wèn)題，從源頭上減少病犬產(chǎn)生，提高犬群質(zhì)量。

一、犬遺傳病基因篩查技術(shù)簡(jiǎn)介

犬遺傳病基因篩查技術(shù)是通過(guò)分析犬樣本細(xì)胞中的DNA 系列，檢測(cè)其是否存在相關(guān)的致病基因和突變位點(diǎn)。目前研究領(lǐng)域采用的遺傳病基因篩查技術(shù)主要有熒光定量PCR、基因芯片和高通量測(cè)序，實(shí)踐中需根據(jù)樣本遺傳信息、檢測(cè)成本和預(yù)期目標(biāo)等合理選擇，充分發(fā)揮犬遺傳病基因篩查的作用和價(jià)值。

熒光定量PCR 技術(shù)是在常規(guī)PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和成本低廉等特點(diǎn)，適合對(duì)已知致病基因或位點(diǎn)的單基因遺傳病進(jìn)行檢測(cè)，如犬的垂體性侏儒癥、擴(kuò)張型心肌病和肛門(mén)癤病等，但熒光定量PCR 可包含的基因數(shù)目受限，檢測(cè)病種相對(duì)較少。

基因芯片是利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在基片表面固定大量已知序列的核酸探針，通過(guò)與標(biāo)記樣品分子雜交，然后檢測(cè)探針?lè)肿有盘?hào)強(qiáng)度來(lái)獲取樣品分子數(shù)量和遺傳信息，從而確定待測(cè)樣本中是否存在目標(biāo)基因。基因芯片一次可固定數(shù)萬(wàn)個(gè)探針，一次性完成多個(gè)樣本多種遺傳病篩查，具有高通量、高效率和高自動(dòng)化的特點(diǎn)，在犬遺傳病篩查上具有獨(dú)特的運(yùn)用前景和商業(yè)價(jià)值。

高通量測(cè)序技術(shù)又被稱(chēng)為二代測(cè)序技術(shù)，其主要包含了Panel 測(cè)序、全外顯子組測(cè)序和全基因組測(cè)序。目前在遺傳疾病篩查實(shí)踐中運(yùn)用最廣的是Panel 測(cè)序，Panel 測(cè)序可由檢測(cè)機(jī)構(gòu)根據(jù)需要自由組合基因種類(lèi)、數(shù)量，并且一次檢測(cè)的基因和位點(diǎn)數(shù)量可從數(shù)種到數(shù)百種之多，具有針對(duì)性強(qiáng)、耗時(shí)較短和檢測(cè)成本較低等優(yōu)勢(shì)，但其也無(wú)法檢測(cè)未知致病基因和位點(diǎn)，同時(shí)相比致病基因的發(fā)現(xiàn)速度，存在一定滯后性。全外顯子組測(cè)序是利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA 捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的方法，其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)范圍廣和可檢測(cè)出未知致病基因，但不能獲得完整的基因組信息，檢測(cè)成本較高，還容易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性，目前該技術(shù)用于犬遺傳疾病篩查存在一定局限性。全基因組測(cè)序是檢測(cè)遺傳病的終極手段,可獲得個(gè)體全部遺傳性息，其中不僅包含已發(fā)現(xiàn)的致病基因和位點(diǎn)，還有未知基因和位點(diǎn)的變異信息，但其也存在著成本高、耗時(shí)長(zhǎng)且數(shù)據(jù)存儲(chǔ)分析難等問(wèn)題，目前將它大規(guī)模用于犬遺傳病基因篩查存在很大挑戰(zhàn)。

二、犬遺傳病基因篩查研究應(yīng)用

目前大部分品種的犬都有遺傳病高發(fā)傾向，尤其是在純種犬中。犬遺傳病涵蓋了呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、皮膚骨骼、腫瘤癌癥、心腦血管、眼部疾病等方方面面。如德國(guó)牧羊犬的髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良、癲癇、胃脹氣、胰腺功能不全和皮膚??；吉娃娃犬的肛門(mén)囊炎、心臟病、干性角膜結(jié)膜炎、肺動(dòng)脈狹窄和軟骨發(fā)育不全；貴賓犬的白內(nèi)障、青光眼、進(jìn)行性視網(wǎng)膜萎縮、甲減和隱睪；羅威納犬的幼年白內(nèi)障、肘關(guān)節(jié)發(fā)育不良、瓣膜下狹窄、髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良和肥厚性心肌病等。

近年來(lái)，經(jīng)過(guò)世界各地犬類(lèi)研究人員的不懈努力，大量犬遺傳疾病的決定基因和關(guān)鍵變異位點(diǎn)被成功定位解析。如2019 年白靜等人針對(duì)已報(bào)道的與犬髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良顯著相關(guān)的15 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析，確定COL6A3（CFA25:51040259）、FN1（CFA37:25095511）和COL1A2（rs22356416）三個(gè)基因位點(diǎn)可作為篩選髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良（CHD）病犬的基因標(biāo)記；特發(fā)性癲癇（IE）是犬常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，早在2012 年Seppa¨ la¨ EH 等人已證實(shí)ADAM23 是一種導(dǎo)致比利時(shí)牧羊犬患IE 的風(fēng)險(xiǎn)基因，2017 年Koskinen LLE 等人通過(guò)對(duì)8 個(gè)犬種的全基因組關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步支持ADAM23 在多個(gè)犬種中作為特發(fā)性癲癇常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)基因的作用，2020 年Belanger J M 等人為進(jìn)一步探索影響比利時(shí)牧羊犬IE 的其他基因座，通過(guò)GWAS 分析確定了CFA14 和CFA37上兩個(gè)相互作用的基因座，強(qiáng)化了之前關(guān)于CFA37 基因座(ADAM23)參與的發(fā)現(xiàn)，并表明CFA14 上的另一個(gè)相互作用基因座與犬的IE 相關(guān);患擴(kuò)張型心肌?。―CM）的犬通常會(huì)有呼吸急促、運(yùn)動(dòng)不耐受、嗜睡、厭食、咳嗽和干嘔等癥狀，是犬類(lèi)心臟病中常見(jiàn)病癥，2012 年Meurs K M 等人證實(shí)杜伯文犬家族性擴(kuò)張型心肌病與PDK4 基因中剪接位點(diǎn)缺失有關(guān)，2017 年Taggart K 等人證明了PDK4 在營(yíng)養(yǎng)利用率較低時(shí)引起細(xì)胞凋亡，促使心臟重塑，最終導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病。

大量犬遺傳病決定基因和關(guān)鍵變異位點(diǎn)的解析定位使犬進(jìn)行遺傳病普遍篩查不再是難題，通過(guò)將這些已發(fā)現(xiàn)的基因、位點(diǎn)進(jìn)行整合，合理設(shè)計(jì)引物，可快速高效檢測(cè)出個(gè)體有無(wú)相關(guān)的遺傳病。目前國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)的檢測(cè)產(chǎn)品問(wèn)世，如深圳深知生物科技有限公司研發(fā)了一款犬類(lèi)多重遺傳病篩查試劑盒，可同時(shí)檢測(cè)髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良、肘關(guān)節(jié)發(fā)育不良、白血病和漸進(jìn)性視網(wǎng)膜萎縮等71個(gè)疾病位點(diǎn)信息；美國(guó)偉思寵物基因檢測(cè)（Wisdom Panel）開(kāi)發(fā)了一款基因檢測(cè)芯片，其不僅可對(duì)犬祖源信息、性狀特征進(jìn)行檢測(cè)，還能針對(duì)犬的29 種遺傳病進(jìn)行篩查。

三、討論與展望

隨著基因檢測(cè)技術(shù)不斷創(chuàng)新以及遺傳病基因篩查相關(guān)研究不斷開(kāi)展，犬遺傳病的決定基因和關(guān)鍵位點(diǎn)被不斷識(shí)別定位，大批量進(jìn)行犬遺傳病的早期檢測(cè)成為可能。遺傳病基因篩查技術(shù)的運(yùn)用推廣能極大降低因遺傳病給養(yǎng)犬機(jī)構(gòu)繁育和工作犬培訓(xùn)工作造成的人力、財(cái)力、物力和時(shí)間上的損失，減少后期資源浪費(fèi)，以相對(duì)較少的成本，解決關(guān)鍵問(wèn)題。相信在遺傳病基因篩查技術(shù)輔助下，犬遺傳病高發(fā)現(xiàn)象能得到有效遏制。