王宏宇，田志飄，劉紅線，鄭亮，3，于雯，吳志軍，Matthew Kay，高振秋，曹宏偉，耿榮慶，張華，，3，4

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶 163319；2.鹽城師范學院藥學院；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院；4.鹽城師范學院江蘇省腫瘤靶向納米診療材料工程研究中心）

2019 年暴發(fā)了由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus disease 2019，COVID-19），于2020 年流行至全球，給多個國家和地區(qū)人民的生命財產(chǎn)安全帶來巨大威脅[1-2]。截至2022 年9 月，全球報告的COVID-19病例數(shù)超過6 億，死亡人數(shù)超過650 萬，但疫苗接種率只有68%。而且SARS-CoV-2 基因組仍在不斷地變異，形成多種傳播力強的變異株，對研究高效的疫苗造成了嚴重的困難[3]。

SARS-CoV-2 屬于β 冠狀病毒，是一種有包膜的單股正鏈RNA 病毒[4]。SARS-CoV-2 基因組大約30 kb，包含一個5′-非翻譯區(qū)（5′-UTR）、3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）和十個單獨的蛋白質(zhì)編碼開放閱讀框（ORF）。病毒基因組可翻譯出非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural protein）、結(jié)構(gòu)蛋白（Structural protein）和輔助蛋白（Accessory protein）3 大類[5-6]。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白的ORF 序列位于基因組上游，形成兩個開放閱讀框（ORF1a 和ORF1b），并在蛋白酶作用下水解形成16 個非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1-Nsp16）[7-8]；結(jié)構(gòu)蛋白由核衣殼（N）蛋白、膜（M）蛋白、包膜（E）蛋白和刺突（S）蛋白組成，結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白的ORF 位于基因組下游[9-10]。SARS-CoV-2 的基因組比對其他β 冠狀病毒基因組發(fā)現(xiàn)，與SARS-CoV 具有79.5%的序列同一性，但顯然SARS-CoV-2 與SARS-CoV 是不同的，它被認為是一種感染人類的新型β 冠狀病毒[11-12]。

Nsp1 是冠狀病毒編碼的第一個病毒蛋白，基因位于ORF1a 的5′端[13]。Nsp1 基因組長540 bp，蛋白由180 個氨基酸組成，大小為19.78 kDa，等電點5.36[14]。Nsp1 是冠狀病毒的毒力決定因子，是病毒用來確保自身在宿主中復制和傳播的核心武器之一；在病毒生命周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用；對宿主細胞具有破壞性的作用，即對宿主基因表達的抑制和逃避細胞免疫反應[15]。而SARS-CoV Nsp1 通過抑制宿主蛋白翻譯的機制，主要是結(jié)合小核糖體亞基，并在起始過程的各個階段停止mRNA 翻譯，后與核糖體結(jié)合導致內(nèi)切核酸切割和隨后的宿主mRNA 降解[16]。但Nsp1 與病毒mRNA 的5’-UTR 中的保守區(qū)域之間相互作用，阻止病毒蛋白表達的關(guān)閉機制尚未研究清楚[17]?？傊?，Nsp1 抑制依賴于宿主表達的所有細胞抗病毒防御機制，包括干擾素抗病毒反應。先天免疫系統(tǒng)關(guān)鍵部分的關(guān)閉可能有助于有效的病毒復制和免疫逃避，它在削弱抗病毒免疫反應方面的核心作用，使Nsp1 蛋白成為潛在的治療靶點[18]。但目前，國內(nèi)外有關(guān)SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白結(jié)構(gòu)與功能方面的研究報道仍然較少。

研究從NCBI 網(wǎng)站上獲取SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 毒株Nsp1 基因序列，通過設(shè)計引物及密碼子優(yōu)化后，合成該基因。利用PCR 技術(shù)擴增得到Nsp1基因，將基因連接到真核表達載體pEGFP-N1 后，轉(zhuǎn)染至HEK-293T 和HeLa 細胞，利用Western Blot 技術(shù)檢測重組載體pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 的表達情況；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，經(jīng)嘌呤霉素標記細胞中正在合成的蛋白，利用Western Blot 技術(shù)檢測嘌呤霉素信號及考馬斯亮藍染色檢測總蛋白。Western Blot 結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白成功在HEK-293T 和HeLa 細胞中表達，并且發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒的表達能夠抑制細胞中正在合成的蛋白質(zhì)數(shù)量。這些結(jié)果說明，pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 重組表達載體構(gòu)建成功，驗證了SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白具有抑制宿主蛋白質(zhì)翻譯的功能，為以后更深入研究SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白的功能及特性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 生物公司，含10%的胎牛血清（FBS）、100 μg·mL-1青霉素和鏈霉素；人胚胎腎上皮細胞（HEK-293T）、人宮頸癌細胞（HeLa）和pEGFP-N1 載體由實驗室保存；重組質(zhì)粒pET-28a-SARS-CoV-2-Nsp1 由國家蛋白質(zhì)科學研究（上海）設(shè)施購買（對全球開放）；感受態(tài)細胞DH5α（DE3）購自上海昂羽生物有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司；DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega 公司；2×Hieff PCR Master Mix購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；ExFect Transfection Reagent、PCR 試劑盒、一步克隆同源重組試劑盒購于諾唯贊公司；考馬斯亮藍（R250）、鼠抗GFP 單克隆抗體和小鼠抗β-Actin 單克隆抗體購自碧云天生物技術(shù)公司；小鼠puromycin 抗體購自Merck 公司；DNA Marker 購自南京普諾恩生物技術(shù)有限公司；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG 購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)已發(fā)表在NCBI 網(wǎng)站上的SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1（NC_045512）毒株基因序列合成Nsp1基因。并利用Nsp1 基因序列和實驗室保存的pEGFP-N1 載體通過Primer5.0 軟件序列設(shè)計具有特異性的上游引物和下游引物，通過無縫克隆技術(shù)設(shè)計引物序列，經(jīng)擎科生物技術(shù)公司進行密碼子優(yōu)化后，合成得到基因的上游引物和下游引物，其中上游引物：5′-GCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGATGGAGAGCCTTGTCCCTGGTTTCA-3′（EcoRⅠ），下游引物：5′-TGGATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCCCTCCGTTAAGCTCACGCATGAGT-3′（XhoⅠ），引物合成由擎科生物（南京）公司完成。

1.3 擴增目的基因

將國家蛋白質(zhì)科學研究（上海）設(shè)施提供的重組質(zhì)粒pET-28a-SARS-CoV-2-Nsp1 作為模板與引物混合，并通過PCR 擴增反應獲取目的基因：模板1 μL，2×Hieff PCR Master Mix 25 μL，上游引物0.2 μL，下游引物0.2 μL，ddH2O 13.6 μL 組合體系20 μL。PCR 程序設(shè)定：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s（35 次循環(huán)）；72 ℃終延伸10 min；反應結(jié)束后，將產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳得到目的條帶，通過膠回收試劑盒純化后，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

用EcoRⅠ和XhoⅠ對pEGFP-N1 載體進行雙酶切，37 ℃水浴過夜，回收、純化雙酶切后的載體片段。將擴增好的目的基因產(chǎn)物和雙酶切好的載體片段按物質(zhì)的量6∶1 加入體系，并添加ExnaseⅡ和5×CEⅡBuffer 進行連接，37 ℃水浴30 min 后得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物通過感受態(tài)細胞DH5α 進行轉(zhuǎn)化，搖菌后離心，并加入液體LB 混勻涂布平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，在平板中挑取單菌落，加液體LB 培養(yǎng)基和氨芐霉素后，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒雙酶切鑒定，經(jīng)驗證后取20 μL送由擎科生物（南京）公司進行測序，對比序列正確后命名為pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Western Blot 檢測

將HEK-293T 細胞接種于24 孔板中，在細胞的匯合度達到80%時，用ExFect Transfection Reagent進行轉(zhuǎn)染試驗，將板中500 μL10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液更換為400 μL 無血清DMEM 培養(yǎng)液，再將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合加到對應的孔中，轉(zhuǎn)染后4～6 h，將無血清DMEM 培養(yǎng)液更換為500 μL10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，放置恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中。取出細胞板置于冰盒上，吸棄孔中舊培養(yǎng)液，并用已滅菌的PBS 沖洗2 次，在孔中加入40 μL 的RIPA 裂解液裂解30 min。用槍頭刮下細胞，并收集在EP 管中，4 ℃、12 000 g 離心10 min 后收集上清，再按比例加入5×Loading Buffer，100 ℃煮沸10 min，恢復室溫后12 000 g 離心10 min，將所得的混合物經(jīng)15% SDSPAGE 膠分離。電泳結(jié)束后通過濕轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)印PVDF 膜上，置于5%脫脂奶粉孵育2 h，用TBST 緩沖液洗膜，再用一抗小鼠抗GFP 標簽單克隆抗體搖床孵育2 h，TBST 緩沖液洗膜2 h，用二抗山羊抗小鼠辣根酶標記IgG，稀釋倍數(shù)1∶3 000，搖床孵育2 h，再次用TBST 緩沖液洗膜2 h，配制曝光液，上機曝光拍照，觀察其表達情況。

1.6 考馬斯亮藍染色

將HEK-293T 細胞接種于24 孔板中，同上述操作經(jīng)轉(zhuǎn)染、換液、培養(yǎng)后取出細胞板，PBS 沖洗后加RIPA 裂解液裂解30 min。收集細胞后于4 ℃離心10 min，吸取上清，再加入5×Loading Buffer，100 ℃煮沸10 min 后12 000 g 離心10 min，將所得的蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE 膠分離，將膠塊放在考馬斯亮藍染色液中，置于搖床10～16 min，100 ℃煮沸至膠塊脫去浮色，將其置于曝光機器后拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nsp1 基因的擴增

研究以國家蛋白質(zhì)科學研究（上海）設(shè)施提供的pET-28a-SARS-CoV-2-Nsp1 重組質(zhì)粒作為模板，經(jīng)PCR 擴增得到目的基因，大小為540 bp 的Nsp1 基因片段，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 SARS-CoV-2 Nsp1 基因的獲取Fig.1 Acquisition of SARS-CoV-2 Nsp1 Gene

2.2 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 的構(gòu)建

利用EcoRⅠ和XhoⅠ兩種酶，經(jīng)過雙酶切鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。在37 ℃水浴鍋中反應2 h，將真核載體pEGFP-N1 及重組真核質(zhì)粒pEGFPN1-SARS-CoV-2-Nsp1 雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果對比重組質(zhì)粒雙酶切得到大小約為4 700 bp 和540 bp 的載體和目的條帶，符合預期，結(jié)果如圖2 所示。重組質(zhì)粒經(jīng)公司測序結(jié)果顯，SARS-CoV-2 Nsp1 成功連接到真核載體pEGFP-N1上，表明重組真核質(zhì)粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 構(gòu)建成功。

圖2 重組載體pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 vector by double enzyme digestion analysis

2.3 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白在HEK-293T 細胞中表達

在鋪有HEK-293T 細胞的24 孔板中轉(zhuǎn)染大約800 ng 的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1，培養(yǎng)24 h，經(jīng)RIPA 裂解及收集細胞。通過SDSPAGE 凝膠分離，使用小鼠抗GFP 單抗、山羊抗小鼠二抗檢測載體pEGFP -N1 及重組表達載體pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 的表達情況，且利用小鼠抗β-Actin 單克隆抗體檢測其細胞內(nèi)參表達情況。結(jié)果如圖3 所示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的樣品中出現(xiàn)與預期大小一致的條帶，對照組未觀察到相關(guān)條帶，說明SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白在HEK-293T 細胞中成功表達。

圖3 Western Blot 技術(shù)檢測重組質(zhì)粒在HEK-293T 細胞中的表達Fig.3 Detection of the expression of recombinant plasmids in HEK-293T cells by Western Blot

2.4 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白在HeLa 細胞中表達

在鋪有HeLa 細胞的24 孔板中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1，同2.3 中操作方法，收集細胞后，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離，使用小鼠抗GFP 單抗和山羊抗小鼠二抗孵育，檢測其細胞表達情況。結(jié)果如圖4 所示，得到同樣結(jié)果，說明SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白在HeLa 細胞中成功表達。

圖4 Western Blot 技術(shù)檢測重組質(zhì)粒在HeLa 細胞中的表達Fig.4 Detection of the expression of recombinant plasmids in HeLa cells by Western Blot

2.5 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白抑制HEK-293T 細胞蛋白合成

將pEGFP-N1 質(zhì)粒及重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 轉(zhuǎn)染至鋪有HEK-293T 細胞的24 孔板中，培養(yǎng)一段時間，加入嘌呤霉素處理1 h，對細胞中正在合成的蛋白質(zhì)進行標記。同2.3 中操作方法，收集細胞后，通過Western blot 技術(shù)和考馬斯亮藍染色檢測。如圖5、6 顯示，考馬斯亮藍染色顯示在總蛋白量不變的情況下，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞中正在合成的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯減少。結(jié)果說明，SARSCoV-2 Nsp1 蛋白具有抑制宿主蛋白質(zhì)翻譯的功能。

圖5 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白抑制HEK-293T細胞總蛋白合成Fig.5 Inhibition of SARS-CoV-2 Nsp1 protein on protein synthesis in HEK-293T cells

圖6 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白抑制HEK-293T 細胞蛋白合成Fig.6 Inhibition of SARS-CoV-2 Nsp1 protein on protein synthesis in HEK-293T cells

2.6 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白抑制HeLa 細胞蛋白合成

將pEGFP-N1 質(zhì)粒及重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 轉(zhuǎn)染至鋪有HeLa 細胞的24 孔板中，培養(yǎng)一段時間，加入嘌呤霉素處理1 h，使細胞中正在合成的蛋白質(zhì)進行標記。同2.3 中操作方法，收集細胞后，通過Western blot 技術(shù)檢測。結(jié)果如圖7所示，隨著重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細胞，細胞中正在合成的蛋白質(zhì)數(shù)量減少。結(jié)果說明，SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白具有抑制宿主蛋白質(zhì)翻譯的功能。

圖7 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白抑制HeLa 細胞蛋白合成Fig.7 Inhibition of SARS-CoV-2 Nsp1 protein on protein synthesis in HeLa cells

2.7 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白抑制外源蛋白的合成

在鋪有HeLa 細胞的24 孔板中，轉(zhuǎn)入pDsRed2-C1 質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 及pEGFP-N1 載體轉(zhuǎn)染至細胞中共同培養(yǎng)24 h。同2.3 中操作方法，收集細胞后，通過Western blot 技術(shù)檢測。結(jié)果如圖8 所示，隨著重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細胞，細胞中外源轉(zhuǎn)入質(zhì)粒合成的蛋白質(zhì)表達減少。結(jié)果說明，SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白具有抑制外源蛋白質(zhì)翻譯的功能。

圖8 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白抑制外源蛋白的合成Fig.8 Inhibition of SARS-CoV-2 Nsp1 protein on the synthesis of foreign proteins

3 討論

SARS-CoV-2 引起的高發(fā)病率和高死亡率的急性呼吸道疾?。–OVID-19）迅速蔓延至全球，已成為全世界人類健康最嚴重的威脅之一，引起了公眾的極大關(guān)注。世界衛(wèi)生組織（WHO）宣布COVID-19 為全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件[19]。從疾病表現(xiàn)來看，SARSCoV-2 感染可以是無癥狀的，而COVID-19 的范圍從輕微的流感樣疾病到危及生命的并發(fā)癥。SARSCoV-2 不僅會影響呼吸道，導致肺炎，還會影響胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)或心血管系統(tǒng)[20-21]。目前，COVID-19 的研究仍處于初步階段，還需要進一步系統(tǒng)性的研究。而且迄今為止，世界上還沒有出現(xiàn)較為有效地針對SARS-CoV-2 變異毒株的特定藥物或疫苗，僅能進行對癥治療，但科學家們正在積極研制幾種抗病毒藥物。盡管正在探索更多的治療選擇，但依舊沒有統(tǒng)一的治療方法可用。只能不斷推進公共衛(wèi)生防預措施，通過使用個人防護設(shè)備和遏制措施來限制病毒傳播。盡管這些策略對于減少病毒的傳播至關(guān)重要，但它們對社會經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生極大的不利影響，堅持這些預防策略很難維持社會發(fā)展和進步[22-23]。然而，考慮到廣大人群的流動性，預計隨后還會出現(xiàn)大流行波[24]。因此，研究SARS-CoV-2 的檢測方法仍然是遏制和緩解COVID-19 策略的重要組成部分，從每次疫情中吸取的教訓都可能有助于為未來的大流行做好準備。由于SARS-CoV-2 的不斷進化，演變出具有單核苷酸多態(tài)性變體和許多譜系，這些變化使得對SARS-CoV-2 的研究更加困難[25-26]。所以迫切的需要深入研究病毒，了解其致病性和毒力機制，以制定更有效的預防和治療策略。

在過去的二十年中，三種高致病性人類冠狀病毒（CoV），包括嚴重急性呼吸綜合征（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征（MERS-CoV）和SARS-CoV-2 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白1（Nsp1）都表現(xiàn)出共同的生物學功能[27]。Nsp1 作為α 和β 冠狀病毒編碼一種獨特的蛋白質(zhì)，既能抑制宿主免疫反應，又能降低宿主細胞中的全局基因表達水平。Nsp1 作為冠狀病毒的關(guān)鍵致病因子，通過多種機制阻礙宿主蛋白表達的同時，逃避其自身被抑制，允許病毒RNA 的翻譯。越來越多的文獻研究了抑制冠狀病毒Nsp1 誘導的免疫反應和抑制蛋白質(zhì)合成的數(shù)據(jù)，旨在深入探究SARS-CoV-2 Nsp1 更多和更具體的生物學功能,有利于加深對病毒的了解，開發(fā)更有效的疫苗[28]。

試驗利用真核表達載體pEGFP-N1 將Nsp1 基因標記，EGFP 作為突變型綠色熒光蛋白（GFP），即使在高溫、極端pH 和變性劑等條件下都能穩(wěn)定、持續(xù)發(fā)出熒光[29]。除此之外，pEGFP-N1 載體不影響細胞的形態(tài)和生長，所以研究將載體選為pEGFP-N1 載體[30]。試驗中，通過引物設(shè)計及PCR 擴增出SARSCoV-2 Nsp1 基因，通過同源重組酶將其連接至pEGFP-N1 載體，構(gòu)建了pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 真核重組質(zhì)粒，并成功在HEK-293T 細胞和HeLa 細胞中表達。經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞、HeLa 細胞及嘌呤霉素標記等試驗操作，發(fā)現(xiàn)Nsp1 蛋白能抑制宿主蛋白質(zhì)及外源蛋白的翻譯水平。研究通過成功構(gòu)建pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1 真核重組質(zhì)粒及抑制宿主蛋白和外源蛋白翻譯功能，為下一步深入SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)。