柳凱月，董亞尊，吳雙雙，馬一瑄，劉鴻雁，王北艷，于立權(quán)，宋佰芬，馬金柱

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）為黃病毒科瘟病毒屬的成員[1]，是牛病毒性腹瀉病的病原，會引起牛的流產(chǎn)、先天性缺陷、腸炎、呼吸系統(tǒng)疾病、不孕癥和乳房炎等癥狀[2-6]。BVDV 傳染性極強，呈世界性流行，嚴(yán)重阻礙了農(nóng)場養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，給各個國家的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

BVDV 是單股正鏈RNA 病毒，全基因組長約12.4 kb，共編碼11 種蛋白，包括4 種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。NS4B 是BVDV 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白之一。研究表明[7-8]，NS4B 是誘導(dǎo)膜交替的完整膜蛋白，可作為形成病毒復(fù)制復(fù)合物的支架[7-8]。BVDV NS4B蛋白顯著抑制RIG-I 樣受體（RLR）介導(dǎo)的干擾素-β（IFN-β）啟動子活性和內(nèi)源性MDA5 mRNA 水平，BVDV NS4B 蛋白直接與MDA5 的N 末端CARD 相互作用，定位于細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮免疫抑制功能[9]。此外，NS4B 蛋白能顯著抑制RIG-I 或Cardif 誘導(dǎo)的IFNβ 啟動子的激活，而STING 誘導(dǎo)的IFN-β 激活則被NS4B 蛋白抑制，這表明NS4B 蛋白在幫助BVDV 逃逸宿主免疫方面，也發(fā)揮著重要的作用[10]。

目前為止，關(guān)于牛病毒性腹瀉病毒NS4B 作用機制的研究報道較少。對BVDV ns4b 基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，該序列全長為1 041 bp，可編碼347 個氨基酸，且編碼的蛋白是疏水性的穩(wěn)定蛋白。同時成功克隆出BVDV ns4b 基因全長序列，構(gòu)建了p3×Flag-CMV10-ns4b 真核表達(dá)載體，并在HEK-293T 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。實驗為后續(xù)研究BVDV NS4B 蛋白在抗病毒反應(yīng)中所發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析軟件

使用 Prot-Param 在線分析軟件分析 BVDV ns4b 基因編碼的氨基酸組成、理論分子質(zhì)量、等電點等基本理化性質(zhì)；利用在線分析工具TExpasy 對BVDV NS4B 蛋白進(jìn)行親疏水性分析；采用SignalP-4.1 程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行信號肽預(yù)測；用SOPMA 在線程序?qū)VDV NS4B 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；通過SWISS MODEL 程序?qū)VDV NS4B 蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2 材料

PCR 試劑、內(nèi)切酶（NotⅠ和XbaⅠ）購于New England Biolabs 公司；大腸桿菌（Escherichia coli，E.Coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α 購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購于Omega 公司；pcDNA3.1-ns4b 重組質(zhì)粒由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院朱戰(zhàn)波教授惠贈；T4 連接酶購于TaKaRa 公司；p3×Flag-CMV10 載體質(zhì)粒購于長春庫美生物公司；LB 培養(yǎng)基購于海博生物公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）高糖培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素混合液購于美國HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA（0.25%）購于美國Gibco 公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；Ultra－Fection 3.0 高效轉(zhuǎn)染試劑購于北京四正柏生物公司；鼠源Flag 抗體、鼠源β-actin 抗體購于北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購于Cell Signaling Technology 公司；ECL 顯影液購于Biosharp 公司；HEK-293T 細(xì)胞由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫制劑與分子免疫實驗室保存。

1.3 目的基因獲得

根據(jù)GenBank 上提供的BVDV ns4b 基因序列（登錄號：NP_776269.1）設(shè)計特異性引物，并分別在上下游引物的5′端添加NotⅠ和XbaⅠ的酶切位點和保護(hù)性堿基，上游引物序列：5′-CCCGCGGCCGCTGCGTCGGGTGACGTGGAAAAAATC-3′（下劃線為NotⅠ酶切位點），下游引物序列：5′-CCGGCTCTAGAGCCAGGTTCCTTATTTTCCCTTGTGAGTCC-3′（下劃線為XbaⅠ酶切位點），引物由長春庫美生物公司合成。以pcDNA3.1-ns4b 重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR 反應(yīng)體系20 μL：5×Q5 Reaction Buffer 4 μL，2 mM dNTPs 2 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板1 μL，Q5 High-Fidelity DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 11.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min，96 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，72 ℃終止10 min。獲得的目的基因ns4b PCR 產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

將獲得的PCR 產(chǎn)物和p3×Flag-CMV10 表達(dá)載體分別用NotⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切條件是37 ℃、2 h。載體酶切體系組成：10×buffer 2 μL、NotⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、Xba Ⅰ內(nèi)切酶0.5 μL、p3×Flag-CMV10 1 μg、去離子水加至20 μL。目的片段酶切體系組成：10×buffer 2 μL、NotⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、XbaⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、ns4b 1 μg、去離子水加至20 μL。純化后的酶切載體和目的片段采用T4 連接酶在恒溫器中16 ℃過夜連接。連接體系組成：T4 連接酶1 μL、10×buffer 1 μL 載體50 ng、目的片段37.5 ng、去離子水加至10 μL，最后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中并涂布在含有氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。挑取大小飽滿的單一菌落，于37 ℃搖床培養(yǎng)8～12 h 后，用Omega 試劑盒按照操作說明書提取質(zhì)粒，并采用PCR 擴增和酶切的方法驗證獲得的重組質(zhì)粒是否正確。PCR 擴增方法如上所述。重組質(zhì)粒酶切體系：NotⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、XbaⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、重組質(zhì)粒1 μg、10×buffer 2 μL、去離子水加至20 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將驗證正確的重組質(zhì)粒郵寄長春庫美公司測序，測序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為p3×Flag-CMV10-ns4b。

1.5 HEK-293T 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出HEK-293T 細(xì)胞，在37 ℃水浴鍋中輕輕晃動至細(xì)胞融化，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至5 ml DMEM 高糖培養(yǎng)基中，室溫下1 000 rpm 離心5 min。離心后，棄去上清，用5 ml 含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基吹懸細(xì)胞團，置于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5 % CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶底部80%～90%融合度，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)、傳代及凍存。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞

將HEK-293T 細(xì)胞以5×104cell·mL-1的密度鋪板在24 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至培養(yǎng)孔底部70%左右融合度時，用UltraFection 3.0 試劑轉(zhuǎn)染。首先棄掉培養(yǎng)基，每孔加入500 μL 新鮮的DMEM 培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞30 min，期間準(zhǔn)備UltraFection 3.0/DNA復(fù)合物：將0.5 μg p3×Flag-CMV10-ns4b 和0.5 μg p3×Flag-CMV10 質(zhì)粒分別加入至 25 μL 的無血清培養(yǎng)基中，漩渦震蕩混勻；將1.5 μL UltraFection 3.0試劑加入至25 μL 無血清培養(yǎng)基中，旋渦震蕩混勻；將后者加入前者中，漩渦震蕩混勻10 s，室溫下孵育10 min，最后將上述Ult-raFection 3.0/DNA 混合物加入每孔中，輕柔晃動使其分散均勻，37 ℃培養(yǎng)6 h 后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.7 Western blot 鑒定目的蛋白表達(dá)

制取蛋白樣品：棄掉原有的完全培養(yǎng)基，用提前預(yù)冷的PBS 清洗細(xì)胞3 次，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，向每孔中加入RIPA 裂解液50 μL 裂解細(xì)胞30 min。裂解完成后，4 ℃條件下12 000 g 離心10 min，收集上清裂解液，經(jīng)BCA 試劑盒蛋白定量后，加入6×Loading Buffer，100 ℃沸水浴處理10 min，隨后12 000 g離心5 min。蛋白采用5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)束后將凝膠濕轉(zhuǎn)NC 膜。轉(zhuǎn)膜條件：電壓100 V，時間42 min。將NC 膜放入3% BSA封閉液中室溫下孵育2 h。洗膜之后，采用鼠源Flag抗體（1∶2 000）和鼠源β-actin 抗體（1∶2 000）分別4度過夜孵育，之后，用羊抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG（1∶3 000）抗體室溫孵育2 h，每次孵育結(jié)束后用1×TBST 洗膜3 次，每次10 min，最后顯影曝光，保存結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV NS4B 的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 BVDV ns4b 編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測及分析

預(yù)測和分析BVDV ns4b 編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的原子數(shù)是5 458，分子式為C1748H2752N444O505S9；分子量為38.4 kDa；理論等電點為7.95；含有347 個氨基酸，帶正電荷（Arg+Lys）的氨基酸殘基總數(shù)為37，帶負(fù)電荷（Asp+Glu）的氨基酸殘基總數(shù)為36；脂肪指數(shù)為98.16；不穩(wěn)定指數(shù)為31.51，屬于穩(wěn)定性蛋白。

2.1.2 蛋白信號肽預(yù)測

運用SignalP-4.1 程序預(yù)測BVDV ns4b 氨基酸序列，結(jié)果顯示，NS4B 蛋白不存在信號肽，因此推測，該蛋白不屬于分泌蛋白（圖1）。

圖1 BVDV NS4B 蛋白信號肽預(yù)測Fig.1 Signal peptide prediction of BVDV NS4B

2.1.3 BVDV NS4B 蛋白親疏水性預(yù)測

運用ExPASY 工具里面的ProtScale 對BVDV ns4b的氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析，結(jié)果顯示，BVDV NS4B 蛋白氨基酸序列最低分值是-2.767（位于第132 位氨基酸），親水性最強，最高分值是2.422（位于第285 位氨基酸），疏水性最強?？傮w看來，該蛋白整條肽鏈大部分為疏水區(qū)域，表現(xiàn)為疏水性，因此，BVDV NS4B 蛋白是疏水性蛋白（圖2）。

圖2 BVDV NS4B 蛋白親疏水性預(yù)測Fig.2 Hydrophobicity prediction of BVDV NS4B

2.1.4 BVDV NS4B 蛋白磷酸化位點預(yù)測

利用Netphos 3.1 Server 在線軟件對該蛋白磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，BVDV NS4B 蛋白有49 個位點可能會被磷酸化（圖3）。

2.1.5 BVDV NS4B 蛋白糖基化位點預(yù)測

利用NetNGlyc 1.0 對BVDV NS4B 蛋白糖基化位點預(yù)測分析，結(jié)果顯示，NS4B 蛋白存在6 個N-糖基化位點，分別位于第57、120、155、158、255 和277位氨基酸處（圖4）。

圖4 BVDV NS4B 蛋白N-糖基化位點預(yù)測Fig.4 N-glycosylation site prediction of BVDV NS4B protein

2.1.6 BVDV NS4B 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運用SOPMA 在線程序?qū)VDV NS4B 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，BVDV NS4B 的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋（66.57%），其余還有無規(guī)則卷曲（17.29%）、延伸（10.66%）和β-轉(zhuǎn)角（5.48%）（圖5）。

圖5 BVDV NS4B 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of BVDV NS4B

2.1.7 BVDV NS4B 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SWISS MODEL 程序?qū)VDV NS4B 蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，NS4B 蛋白含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，與其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致（圖6）。

圖6 BVDV NS4B 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Tertiary structure prediction of BVDV NS4B

2.2 目的基因擴增結(jié)果

利用特異性引物進(jìn)行BVDV ns4b 基因擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，在1 000 bp 處左右出現(xiàn)明顯條帶，結(jié)果與預(yù)期基因片段大小相符，表明目的基因擴增正確（圖7）。

圖7 BVDV 的ns4b 基因PCR 擴增產(chǎn)物Fig.7 PCR products of ns4b gene of BVDV

2.3 表達(dá)載體構(gòu)建及驗證

2.3.1 PCR 方法鑒定

利用獲得的重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 為模板進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示在1 000 bp 左右有明顯條帶，擴增片段大小與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 構(gòu)建正確（圖8）。

圖8 重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 的PCR 鑒定Fig.8 PCR identification of recombinant plasmid p3×Flag-CMV10-ns4b

2.3.2 酶切鑒定

用NotⅠ、XbaⅠ內(nèi)切酶進(jìn)一步驗證PCR 方法鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b，酶切產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3 所示，分別在6 400 bp 和1 000 bp 處左右出現(xiàn)了明顯條帶，大小與目的片段1 041 bp 相符，表明重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 構(gòu)建正確（圖9）。

圖9 重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 酶切鑒定Fig.9 Digestion identification of recombinant plasmid p3×Flag-CMV10-ns4b

2.3.3 重組表達(dá)載體序列比對分析

將上述鑒定正確的p3×Flag-CMV10-ns4b 重組質(zhì)粒郵寄庫美生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast 比對分析，結(jié)果顯示，測序結(jié)果與目的基因序列一致，與NCBI 上公布的BVDV NADL 株同源性為100%，表明重組表達(dá)載體p3×Flag-CMV10-ns4b 構(gòu)建成功（圖10）。

圖10 p3×Flag-CMV10-ns4b 與BVDV NADL株ns4b 序列比對Fig.10 Sequence comparison between p3×Flag-CMV10-ns4b and ns4b of BVDV NADL strain

2.4 Western blot 檢測目的蛋白表達(dá)

利用Western blot 方法，檢測重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 在HEK-293T 細(xì)胞中的表達(dá)情況，先后利用鼠源抗Flag 標(biāo)簽抗體與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 孵育，檢測NS4B 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示在38.4 kDa 處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期蛋白大小相符。表明重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 在HEK-293T 細(xì)胞中成功表達(dá)（圖11）。

圖11 Western blot 鑒定目的蛋白表達(dá)Fig.11 Identification of target protein expression by western blot

3 討論

1946 年，美國紐約州的Olafson 等[11]首次發(fā)現(xiàn)BVDV，隨后在各個國家被陸續(xù)報道。1980 年，李佑民等[12]分離出1 株與國外報道相同的BVDV，這是我國首次報道該病毒，并命名為184V 株。此后，此病毒正式傳入我國，在我國牛群中廣泛流傳。近年來，牛病毒性腹瀉病/黏膜病（Bovine Viral Diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）在北京、河北、江蘇等20 多個省、市和自治區(qū)均有報道，并有多個省份血清陽性率有逐年上升的趨勢[13]。

按照BVDV 分離培養(yǎng)過程中能否穩(wěn)定繁殖并引起細(xì)胞病變，BVDV 可以分為致細(xì)胞病變型（CP）和非致細(xì)胞病變型（NCP）兩種生物型[14]。依據(jù)BVDV 的全基因組5′端非翻譯區(qū)核酸序列（5′-UTR）和抗原性的不同，國際病毒分類委員會將BVDV 分為2 種基因型，即BVDV-Ⅰ型和BVDV-Ⅱ型[15]。如今，我國牛群最主要感染的為BVDV-Ⅰ型，北美洲、西班牙主要流行BVDV-Ⅱ型[16]。BVDV 基因組含有一個大的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），該蛋白前體能夠大概形成11 種成熟的蛋白質(zhì)，它們在整個基因組上的排列為（從N 端到C 端）NH2-Npro-capsid-Erns-E1-E2-P7 -NS2 -NS3 -NS4A -NS4B -NS5A -NS5B-COOH，其 中，Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B 為非結(jié)構(gòu)蛋白，其他為結(jié)構(gòu)蛋白，參與BVDV 囊膜和外殼[17-18]的組成。隨著對BVDV 基因組結(jié)構(gòu)以及功能研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)BVDV 的非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的形成，在誘導(dǎo)機體產(chǎn)生天然免疫方面發(fā)揮重要作用[19-24]。近幾年，有研究表明BVDV 基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B 能夠介導(dǎo)細(xì)胞膜重排的過程[25]。NS4B 蛋白在CP 型和NCP 型兩種生物型病毒之間的定位沒有差異，NS4B 蛋白對病毒的復(fù)制起著重要的作用，若BVDV NS4B 區(qū)域中第15 位密碼子從酪氨酸突變?yōu)榘氚彼?，可使CP 型的BVDV 轉(zhuǎn)化為NCP 型的BVDV，表明NS4B 蛋白參與BVDV逃逸宿主免疫，這表明此位氨基酸突變是研究BVDV疫苗的一個新作用靶點。因此，BVDV NS4B 重組質(zhì)粒的構(gòu)建對后續(xù)的功能研究具有重要的作用。

由于NS4B 蛋白在BVDV 形成和抗宿主免疫過程發(fā)揮重要作用，因此，采用Prot-Param、TExpasy、SignalP-4.1 等生物信息學(xué)軟件對BVDV ns4b 的理化性質(zhì)以及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測和分析，結(jié)果表明BVDV NS4B 是含有347 個氨基酸的穩(wěn)定性蛋白，不是分泌性蛋白；NS4B 蛋白有6 個N-糖基化位點，整條肽鏈大部分為疏水區(qū)域，表現(xiàn)為疏水性蛋白；NS4B蛋白是多磷酸化蛋白，具有49 個磷酸化位點，提示這些磷酸化位點可能參與BVDV 與宿主代謝的調(diào)控過程。另外，NS4B 蛋白結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成。上述這些分析結(jié)果為進(jìn)一步研究BVDV NS4B 蛋白的特性與生物學(xué)功能提供了參考。此外，研究通過PCR 的方法獲得BVDV ns4b 基因，將目的基因ns4b 插入到真核表達(dá)載體p3×Flag-CMV10 中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體p3×Flag-CMV10-ns4b，并將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞中，Western blot 結(jié)果表明，p3×Flag-CMV10-ns4b 能夠在細(xì)胞中表達(dá)NS4B 蛋白，大小為38.4 kDa，與預(yù)期大小相符，表明p3×Flag-CMV10-ns4b 在HEK-293T 細(xì)胞中能夠成功表達(dá)。為今后研究NS4B 蛋白在BVDV 形成和抗宿主免疫反應(yīng)中的作用奠定了基礎(chǔ)，同時對進(jìn)一步預(yù)防BVDV 感染具有重要意義。