宋倩，高爽，董昊，徐闖，孫旭東

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

圍產(chǎn)期是奶牛關(guān)鍵生理階段，此時(shí)奶牛機(jī)體由于泌乳所需能量急劇增加的同時(shí)，干物質(zhì)采食量（Dry matter intake，DMI）降低[1]。母牛難以從食物中獲取足夠的能量，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)入能量負(fù)平衡（Negative energy balance，NEB）狀態(tài)[2]。機(jī)體為了適應(yīng)NEB，將會(huì)進(jìn)行脂肪動(dòng)員，從而產(chǎn)生大量的脂肪酸以此滿足機(jī)體能量所需。過(guò)量游離脂肪酸在肝臟內(nèi)不完全氧化產(chǎn)生酮體，酮體過(guò)度累積導(dǎo)致奶牛酮病的發(fā)生，致使產(chǎn)奶量下降。奶牛乳腺上皮細(xì)胞是奶牛乳腺中合成以及泌乳的基本功能單位。奶牛乳腺上皮細(xì)胞功能紊亂導(dǎo)致乳腺組織功能障礙，泌乳量下降。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞功能異常，產(chǎn)奶量降低[3]。因此，闡明酮病奶牛乳腺上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制將為我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)提高奶牛產(chǎn)奶量提供幫助。

線粒體是產(chǎn)生能量的主要細(xì)胞器，為細(xì)胞提供所需能量[4]。因線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是裸露的，并與呼吸鏈和富含脂質(zhì)的線粒體膜緊密相連，使其較核DNA 對(duì)氧化損傷敏感性更高。線粒體DNA 異常引起線粒體功能障礙[5]。當(dāng)線粒體功能障礙時(shí)，導(dǎo)致ROS 生成異常，打破ROS穩(wěn)態(tài)，釋放的大量ROS 導(dǎo)致線粒體膜電位下降，致使線粒體損傷[6]。研究發(fā)現(xiàn)臨床酮病奶牛乳腺中存在線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激[7]。乙酰乙酸（Acetoacetic acid，ACAC）是奶牛體內(nèi)酮體主要成分之一。但ACAC 對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體功能的影響尚不清楚。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2（Nuclear factor E2-reated factor 2，Nrf2）是細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子[8]。在非反芻動(dòng)物中Nrf2 通過(guò)激活抗氧化基因保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[9]。除調(diào)節(jié)氧化還原的功能以外，Nrf2 也是重要的線粒體調(diào)節(jié)分子。Nrf2 可以通過(guò)直接和間接的方式調(diào)控過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體γ-γ 活化劑1-α（Peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（Mitochondrial transcription factor A，TFAM）、核呼吸因子-1（Nuclear respiratory factor-1，Nrf1）等線粒體生物合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)抗氧化細(xì)胞的保護(hù)反應(yīng)，使線粒體生物合成增加。研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病中，PGC-1α-Nrf-TFAM 途徑的激活導(dǎo)致mtDNA 和蛋白質(zhì)的合成以及生成新線粒體[10]。以上研究說(shuō)明Nrf2 可以調(diào)節(jié)線粒體功能，但尚不清楚Nrf2 是否參與ACAC 對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體損傷的影響。

因此，試驗(yàn)在奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T 添加不同濃度的ACAC 進(jìn)行處理，來(lái)誘導(dǎo)線粒體損傷；并添加10 μmol·L-1的SFN，檢測(cè)PGC-1α、TFAM、Nrf1與COⅠ-Ⅴ的基因表達(dá)情況，并檢測(cè)ROS 和mtDNA 的含量及線粒體膜電位和ATP 含量的變化，旨在探討ACAC 導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體損傷的調(diào)控機(jī)制，為防治酮病奶牛代謝異常導(dǎo)致的乳腺組織線粒體損傷提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要試劑及儀器

DMEM-F12 培養(yǎng)基（Hyclone 公司）；胎牛血清（CLARK 公司）；商業(yè)ATP 測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol 和RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；SYBR green plus（Roche，Norwalk，CT）；722N分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（7500 Real-Time PCR 系統(tǒng)Applied Biosystems）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 線粒體ROS 的測(cè)定

將MAC-T 細(xì)胞用2 μg·mL-1Mito-roGFP 質(zhì)粒（Addgene 質(zhì)粒#49437）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h。隨后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體ROS。通過(guò)計(jì)算405 nm 與488 nm熒光信號(hào)強(qiáng)度比值，分析線粒體ROS 含量。

1.3.2 ATP 含量的測(cè)定

使用商業(yè)ATP 檢測(cè)試劑盒。在95 ℃，用500 μL去離子水將MAC-T 細(xì)胞勻漿10 min 后，在沸水中孵化與基質(zhì)混合1 min，與底物溶液和催化劑混合，37 ℃孵化30 min，加入沉淀劑到混合物中，室溫1 500×g 離心5 min，上清液與顯色液室溫孵育2 min后，室溫下加入停止液5 min。吸光度在636 nm 處測(cè)定，將ATP 含量歸一化為蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用試劑盒（P1511；Applygen Technologies Inc.）檢測(cè)總蛋白濃度。

1.3.3 RNA 分離和實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）

細(xì)胞在六孔板中處理結(jié)束后，按照每孔1 mL 的量加入Trizol，用移液槍吹打數(shù)次，并收集細(xì)胞于無(wú)RNA 酶的EP 管中。按照加入氯仿抽提—離心—加入異丙醇沉淀—離心—酒精洗滌—離心的步驟提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)RNA 濃度，將1 μg RNA 樣品使用試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA（RR047A，TaKaRa Biotechnology）。反應(yīng)總體系（20 μL）：酶10 μL；上下游引物各1 μL；DEPC 水6 μL；DNA 模板2 μL；反應(yīng)程序見表1。使用SYBR green plus 試劑盒在7500 Real-Time PCR 系統(tǒng)檢查靶基因的表達(dá)量；在Excel 軟件中用2-ΔΔCT 方法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。引物合成依據(jù)Sun 等[12]研究中的引物合成方法，所用全部引物設(shè)計(jì)與合成來(lái)源于生工生物工程（上海）股份有限公司（見表2）。

表1 Real-time PCR 反應(yīng)程序Table 1 Real-time PCR reaction program

表2 Real-time PCR 分析所用引物Table 2 Gene-specific primers used for Real-time PCR

1.3.4 線粒體膜電位檢測(cè)

吸出每孔的培養(yǎng)液，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，加入1 mL 培養(yǎng)液。加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻，37 ℃孵育20 min。孵育期間按1 mL JC-1 染色緩沖液（5x）加入4 mL 蒸餾水比例，配制JC-1 染色緩沖液（1x），放置冰浴。37 ℃孵育結(jié)束后，吸去上清液，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次（冰浴），熒光顯微鏡下觀察。

響應(yīng)快捷化：①對(duì)當(dāng)班發(fā)生的變化情況必須詳細(xì)記錄發(fā)生時(shí)間、地點(diǎn)、影響范圍，按變化性質(zhì)與要求及時(shí)匯報(bào)，立即啟動(dòng)響應(yīng)程序；②對(duì)上一班延續(xù)的變化項(xiàng)目，要詳細(xì)跟蹤落實(shí)變化進(jìn)展情況，確保閉合管理；③發(fā)生瓦斯等有害氣體報(bào)警或超限時(shí)，必須在3分鐘之內(nèi)匯報(bào)上級(jí)部門并及時(shí)落實(shí)事故原因；④對(duì)所有變化環(huán)節(jié)響應(yīng)，全部規(guī)范時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)，要求所有響應(yīng)步驟全部在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成。

1.3.5 線粒體DNA 檢測(cè)

采用凝膠電泳法獲得DNA 完整數(shù)據(jù)。采用I2S rRNA 和親環(huán)蛋白A 以及PrimeStar Max DNA 聚合酶（RO45A：TaKaRa 生物技術(shù)有限公司）擴(kuò)增mtDNA 和核DNA（nDNA）。評(píng)估m(xù)tDNA 產(chǎn)物的相對(duì)數(shù)量。隨后，用DNA 凝膠試劑盒（DOOS6；Beyotime 生物技術(shù)研究所）純化pcr 產(chǎn)物。用阿伏伽德羅常數(shù)和模板DNA 的平均分子量計(jì)算每微升mtDNA 或nDNA 的拷貝數(shù)。

阿伏伽德羅常數(shù)是6.02×1023，C=濃度（ng·μL-1），Mwt=堿基對(duì)×660。根據(jù)拷貝數(shù)，將PCR 產(chǎn)物稀釋10 次，從108倍到103copics·μL-1。采用SYBR Green定量RT-PCR 試劑盒（TaKaRa 生物技術(shù)有限公司），使用Applied 生物系統(tǒng)公司的7500 Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRI-PCR）。采用循環(huán)閾值和濃度自然對(duì)數(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算mtDNA 或nDNA 的拷貝數(shù)。mtDNA 的相對(duì)拷貝數(shù)換算為nDNA的相對(duì)拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對(duì)各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，各組間的顯著性差異用字母表示（P＜0.05），數(shù)據(jù)表示形式為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACAC 對(duì)線粒體活性氧和線粒體膜電位的影響

與0 mmol·L-1ACAC 對(duì)照組相比，1.2 和1.8 mmol·L-1ACAC 處理組的MAC-T 細(xì)胞中線粒體ROS 含量顯著升高（圖1（A），P＜0.05），而與對(duì)照組相比，1.2 和1.8 mmol·L-1ACAC 組線粒體膜電位顯著降低（圖1（B），P＜0.05）。

圖1 ACAC 對(duì)ROS 和線粒體膜電位的影響Fig.1 Effects of ACAC on ROS and mitochondrial membrane potential

2.2 ACAC 對(duì)線粒體呼吸鏈和ATP 含量的影響

與對(duì)照組0 mmol·L-1ACAC 相比，1.2 和1.8 mmol·L-1ACAC 處理組COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ以及COⅤ的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（圖2（A）（B）（C）（D）和（E），P＜0.05）。與對(duì)照組相比，1.2 和1.8 mmol·L-1ACAC 處理組的ATP 含量顯著降低（圖2（F），P＜0.05）。

圖2 ACAC 對(duì)線粒體呼吸鏈和ATP 含量的影響Fig.2 Effects of ACAC on mitochondrial respiratory chain and ATP content

2.3 ACAC 對(duì)線粒體DNA 和NFE2L2 基因表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，1.2 和1.8 mmol·L-1ACAC 處理組NFE2L2、PGC-1α、Nrf1 以及TFAM 的mRNA 表達(dá)量顯著降低（圖3（A）（B）（C）和（D），P＜0.05）。與對(duì)照組相比，1.2 和1.8 mmol·L-1ACAC 處理組mtDNA 含量變化顯著降低（圖3（E），P＜0.05）。

圖3 ACAC 對(duì)線粒體含量和NFE2L2 基因表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of ACAC on mitochondrial content and NFE2L2 gene expression

2.4 SFN 預(yù)處理緩解了ACAC 誘導(dǎo)的線粒體含量下調(diào)

與DMSO 組相比，ACAC+DMSO 處理組Nrf2 的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（圖4（A），P＜0.05）。與ACAC+DMSO 處理組相比，ACAC+SFN 處理組Nrf2 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（圖4（A），P＜0.05）。與DMSO 組相比，ACAC+DMSO 處理組PGC-1α、Nrf1以及TFAM 的mRNA 表達(dá)量顯著降低（圖4（B）（C）和（D），P＜0.05）。與ACAC+DMSO 處理組相比，ACAC+SFN 處理組的PGC-1α、Nrf1 以 及TFAM 的mRNA 表達(dá)量顯著升高（圖4（B）（C）和（D），P＜0.05）。與DMSO 組相比，ACAC+DMSO 處理組的mtDNA 含量顯著降低（圖4（E），P＜0.05）。與ACAC+DMSO 組相比，ACAC+SFN 組mtDNA 含量顯著升高（圖4（E），P＜0.05）。

圖4 SFN 緩解ACAC 誘導(dǎo)Nrf2 表達(dá)下降及線粒體含量下調(diào)Fig.4 SFN alleviates ACAC-induced Nrf2 expression and mitochondrial content down-regulation

2.5 SFN 預(yù)處理緩解了ACAC 誘導(dǎo)的線粒體損傷

與DMSO 組相比，ACAC+DMSO 處理組MAC-T細(xì)胞中的ROS 含量顯著升高（圖5（A），P＜0.05），線粒體膜電位顯著降低（圖5（B），P＜0.05）。與ACAC+DMSO 處理組相比，ACAC+SFN 處理組的MAC-T 細(xì)胞中的ROS 的含量顯著降低（圖5（A），P＜0.05），而線粒體膜電位顯著升高（圖5（B），P＜0.05）。與DMSO組相比，ACAC+DMSO 處理組的COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的mRNA 表達(dá)量顯著降低（圖5（C），P＜0.05）。與ACAC+DMSO 組相比，ACAC+SFN 預(yù)處理組COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的mRNA 表達(dá)量顯著增加（圖5（C），P＜0.05）。與DMSO 組相比，ACAC+DMSO 處理組的ATP 含量顯著降低（圖5（D），P＜0.05）。與ACAC+DMSO 處理組相比，ACAC+SFN 處理組的ATP 含量顯著增加（圖5（D），P＜0.05）。

圖5 SFN 緩解ACAC 誘導(dǎo)線粒體損傷Fig.5 SFN alleviates ACAC-induced mitochondrial damage

3 討論

奶牛酮病發(fā)生的主要誘因之一是NEB[11]。嚴(yán)重的能量負(fù)平衡會(huì)導(dǎo)致奶牛代謝紊亂，誘導(dǎo)奶牛體內(nèi)產(chǎn)生大量的游離脂肪酸和酮體。研究發(fā)現(xiàn)，代謝紊亂可以誘發(fā)酮病奶牛乳腺組織線粒體損傷，產(chǎn)生大量的ROS，并導(dǎo)致產(chǎn)奶量降低[12]。因此，闡明代謝應(yīng)激導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體損傷的分子機(jī)制，對(duì)防治酮病奶牛乳腺上皮細(xì)胞功能紊亂至關(guān)重要。研究結(jié)果顯示，高濃度ACAC 通過(guò)抑制Nrf2 表達(dá)，誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體損傷，導(dǎo)致線粒體ROS 蓄積，因此推測(cè)Nrf2 可能是防止代謝應(yīng)激導(dǎo)致酮病奶牛乳腺組織線粒體損傷的治療靶點(diǎn)。

線粒體是由核基因組和線粒體基因組共同調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)細(xì)細(xì)胞器[13]。線粒體生物發(fā)生異常，導(dǎo)致線粒體功能障礙打破細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。線粒體是產(chǎn)生ROS 的主要場(chǎng)所。因線粒體DNA 裸露導(dǎo)致線粒體更易受到ROS 攻擊[14]，引起線粒體功能紊亂，致使細(xì)胞氧化損傷。已有研究證明，ACAC 誘導(dǎo)奶牛肝細(xì)胞氧化應(yīng)激[15]。研究結(jié)果表明，高濃度的ACAC處理，導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞中線粒體ROS 含量升高。以上結(jié)果說(shuō)明代謝應(yīng)激導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷。細(xì)胞損傷時(shí)ROS 增加，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，導(dǎo)致線粒體功能障礙。研究證實(shí)，高濃度NEFA處理奶牛肝細(xì)胞ROS 含量增加，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，致使線粒體損傷[16]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的ACAC 處理，導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞中線粒體膜電位降低。這些結(jié)果表明，ACAC 通過(guò)誘導(dǎo)線粒體ROS 增加，導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞中線粒體膜電位降低，致使奶牛乳腺上皮細(xì)胞功能障礙。線粒體是產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞提供90%的能量[17]。線粒體主要通過(guò)細(xì)胞器內(nèi)膜中的5 個(gè)多亞基復(fù)合物（COⅠ-Ⅴ）進(jìn)行氧化磷酸化合成ATP[18]。前人研究顯示，提高小鼠體內(nèi)ATP 合成底物使用效率與功能活性，使得乳汁合成速率提高[19]。研究中高濃度的ACAC 導(dǎo)致COⅠ-Ⅴ的基因表達(dá)降低，并且ATP 含量降低。Song 等[7]研究表明，酮病奶牛誘乳腺組織線粒體活性氧增加和ATP 降低，導(dǎo)致線粒體功能障礙，產(chǎn)奶量下降。因此推測(cè)，代謝應(yīng)激可能通過(guò)導(dǎo)致線粒體損傷，減少能量產(chǎn)生，抑制乳腺上皮細(xì)胞的泌乳能力。

Nrf2 是細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，在線粒體生物發(fā)生也發(fā)揮著重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2激活有助于在應(yīng)激條件下保持線粒體形態(tài)和功能[21]。線粒體生物發(fā)生涉及線粒體和核轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。PGC-1α 是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄共激活因子。TFAM負(fù)責(zé)mtDNA 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。Nrf1 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，控制涉及線粒體呼吸功能的靶基因。在非反芻動(dòng)物中，PGC-1α 的增加，誘導(dǎo)Nrf1 和Nrf2 的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致TFAM 激活，產(chǎn)生TFAM 蛋白質(zhì)因子。TFAM 蛋白質(zhì)因子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體內(nèi)，與線粒體DNA 結(jié)合，刺激線粒體生物發(fā)生。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高濃度ACAC 處理組PGC-1α、TFAM、Nrf1 以及Nrf2的基因表達(dá)量與mtDNA 含量顯著降低。在非反芻動(dòng)物中的研究表明，抑制PGC-1α、Nrf1、Nrf2 和TFAM的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體生物合成的減少以及細(xì)胞代謝的改變[22]。因此，以上結(jié)果都說(shuō)明ACAC 通過(guò)抑制Nrf2 表達(dá)，導(dǎo)致的乳腺上皮細(xì)胞線粒體功能障礙。

蘿卜硫素（Sulforaphane，SFN）是一種異硫氰酸酯植物化學(xué)物質(zhì)，具有抗氧化作用[23]。SFN 作為Nrf2 的激活劑，廣泛應(yīng)用到線粒體功能障礙性疾病治療中[24]。研究發(fā)現(xiàn)SFN 可以通過(guò)激活Nrf2，促進(jìn)線粒體生物發(fā)生、降低線粒體ROS 產(chǎn)生，緩解線粒體功能紊亂[25]。在研究中，SFN 預(yù)處理顯著增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞中Nrf2 的基因表達(dá)水平，緩解ACAC 對(duì)線粒體生物發(fā)生關(guān)鍵分子PGC-1α、TFAM 和Nrf1 mRNA 表達(dá)及mtDNA 含量的抑制作用。此外，SFN 預(yù)處理緩解了ACAC 誘導(dǎo)的線粒體ROS 含量的升高和線粒體膜電位升降低、COⅠ-Ⅴ的基因表達(dá)水平降低以及ATP含量降低。因此，以上結(jié)果表明通過(guò)SFN 激活Nrf2，能有效緩解高濃度ACAC 誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體損傷。

4 結(jié)論

綜上所述，數(shù)據(jù)表明ACAC 通過(guò)抑制Nrf2 的表達(dá)水平，抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞線粒體生物發(fā)生、降低能量生成，誘導(dǎo)ROS 蓄積。而SFN 通過(guò)增加Nrf2的基因表達(dá)，緩解ACAC 誘導(dǎo)的線粒體損傷。研究證實(shí)，過(guò)量的ACAC 可以抑制Nrf2，并誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞MAC-T 線粒體功能障礙。