張中懷，高遠，蘭卓，邱陽元，邱鴻宇，安琪，高俊峰，王春仁

（1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.臺州學院生命科學技術學院）

馬作為家畜的重要組成部分，是推動人類文明進步的重要載體，在人類社會發(fā)展史上發(fā)揮了其他家養(yǎng)動物無法比擬的作用[1]。馬體內的寄生線蟲不僅數(shù)量大，而且種類多，是影響馬匹健康的重要因素，其中數(shù)量最大的一類線蟲就是圓線科（Strongylidae）線蟲，又稱為馬圓線蟲。這類線蟲呈世界性分布，在我國馬群中也普遍存在[2-5]。當馬圓線蟲大量寄生時會造成宿主的貧血、消瘦，甚至死亡，給養(yǎng)馬業(yè)帶來嚴重的經濟損失[6]。

馬圓線蟲主要包括盅口亞科（Cyathostominae）和圓線亞科（Strongylinae），共涉及19 個屬和64 個種[7]。近年來，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，人們對于圓線科線蟲的分子分類和親緣關系有了更深入的了解，也改變了對傳統(tǒng)分類的認識。線粒體DNA 具有結構簡單、在細胞中大量存在、多為母系遺傳、缺少重組和內含子以及較高的進化速率等特點，因此作為一種分子標記被廣泛用于隱存種確定、分子進化、種群遺傳、物種鑒定和不同分類水平上的系統(tǒng)發(fā)生關系研究[8-10]。Gao 等[9]基于線粒體全基因組數(shù)據(jù)證明，基于形態(tài)學而被歸類為圓線亞科的三齒線蟲與盅口亞科線蟲親緣關系更近。通過對來自不同地點微小杯冠線蟲線粒體基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，微小杯冠線蟲是一個至少有三個不同種的復雜種[10]。

雖然馬的圓線蟲有64 種，但開展分子研究的并不多。因此，研究對新分離的黑龍江省大慶市馬腸道的長傘杯冠線蟲（Cylicostephanus longibursatum）、冠狀冠環(huán)線蟲（Coronocyclus coronatus）、細口杯環(huán)線蟲（Cylicocyclus leptostomus）、拉氏杯口線蟲（Poteriostomum ratzii）、麥氏副杯口線蟲（Parapoteriostomum mettami）和無齒圓形線蟲（Strongylus edentatus）6 種圓線蟲的線粒體細胞色素c 氧化酶亞基Ⅰ（cox1）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基Ⅰ（nad1）和核糖體大亞基（rrnL）進行擴增、測序和比較分析，然后以三個基因串聯(lián)序列為標記基因，采用貝葉斯法（Bayesian inference，BI）法構建進化樹來探討圓線科線蟲間的親緣關系，為進一步研究圓線科線蟲的分類及遺傳進化關系提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 蟲體來源

在大慶某屠宰場收集馬腸道糞便，反復水洗沉淀收集蟲體，再通過生理鹽水清洗3 次，置于顯微鏡下觀察，參照文獻進行形態(tài)學鑒定，將初步鑒定的長傘杯冠線蟲、冠狀冠環(huán)線蟲、細口杯環(huán)線蟲、拉氏杯口線蟲、麥氏副杯口線蟲和無齒圓形線蟲保存于70%酒精中備用。為保證蟲體鑒定的準確性，再以6種蟲體的DNA 為模板，擴增其ITS 序列（引物見表1），通過序列分析鑒定到種。

表1 引物信息及PCR 擴增條件Table 1 Primer information and PCR amplification conditions

1.2 DNA 的提取及目的基因的擴增

1.2.1 DNA 的提取

蟲體DNA 根據(jù)組織基因提取試劑盒（天根公司，北京）說明書進行提取。每種線蟲取蟲體1 條，在蒸餾水中反復沖洗3 次，加入200 μL GA 緩沖液和20 μL 蛋白酶K，置于56 ℃水浴鍋中2～3 h，直到蟲體完全溶解，期間要每隔30 min 搖晃一次。待蟲體完全溶解后取出，加入200 μL GB 緩沖液，混勻后于70 ℃水浴鍋中放置10 min，然后于4 ℃放置3 min，取出后加入-20 ℃的無水乙醇200 μL，充分顛倒混勻后瞬離。將上述所有的液體加入試劑盒內的吸附柱中，12 000 r·min-1離心30 s，棄廢液。然后加入500 μL GD 緩沖液，12 000 r·min-1離心30 s，棄廢液；再加入700 μL PW 緩沖液，12 000 r·min-1離心30 s，棄廢液，此步驟需重復一次。加完緩沖液后，12 000 r·min-1離心2 min，然后置于室溫3 min，晾干殘余的液體。將吸附柱置于1.5 mL 離心管中，加入100 μL 的洗脫液TE，室溫放置3 min 后12 000 r·min-1離心2 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的基因的克隆及測序

參考先前文獻報道[6，11]設計引物擴增6 種線蟲cox1、nad1 和rnnL 基因，引物序列由北京擎科生物工程技術有限公司合成。PCR 反應的總體系為25 μL，具體如下：1 μL DNA 模板，2.5 μL ExTaq buffer（pH 8.5），2 μL dNTP mixture（2.5 mM），0.5 μL 引 物（10 pmol·mL-1）和0.2 μL ExTaq DNA 酶（5 U·mL-1）。擴增程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min（表1）。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)成像。取含有目的片段的凝膠置于1.5 mL 離心管中，并標注相應的編號，按照膠回收試劑盒（天根）說明書的步驟進行膠回收，純化后的DNA 產物與PMD-18T 載體在16 ℃連接12 h 后用于克隆，將克隆陽性菌液委托吉林庫美測序公司進行測序。

1.3 序列分析

測得的目的序列利用DNAstar 5.0 軟件中的Editseq 程序進行序列編輯，從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲取其他圓線科線蟲相應基因序列（表2）。對A+T 含量和AT 斜率進行計算，用ClustalX 1.83 軟件和DNAstar 5.0 中的Align 程序進行DNA 同源序列排列，并人工核對校正。所得序列與GenBank 中23 種馬圓線蟲的線粒體cox1、nad1 和rrnL 基因序列兩兩進行比較，分析蟲體間的基因相似性。

表2 序列分析和進化分析用圓線科線蟲信息Table 2 Information of family strongylidae used in sequences and phylogenetic analysis

1.4 進化分析

以葉氏夏伯特線蟲（Chabertia erschowi）為外群，cox1、nad1 和rrnL 基因序列串聯(lián)，利用mafft7.0-37軟件[12]進行比對，比對后利用在線軟件Gblocks（http：//molevol.cmima.csic.es/castresana/ Gblocks_server.html）[13]的默認值去除序列的基因間隔和模糊區(qū)域，用Clustal X 1.83 軟件[14]進行格式的轉換，采取BI 法，選取已有基因序列的23 種馬圓線蟲與研究中的6 種線蟲（表2）構建進化樹，探討馬圓線蟲間的親緣關系。

2 結果與分析

2.1 蟲體鑒定

研究所6 種線蟲的核糖體ITS 序列與GenBank中長傘杯冠線蟲（KM085359.1）、冠狀冠環(huán)線蟲（JN786950.2）、細口杯環(huán)線蟲（KP693432.1）、拉氏杯口線蟲（KP693434.1）、麥氏副杯口線 蟲（KP693435.1）和無齒圓形線蟲（KP693438.1）的基因相似性分別為99.76%、99.07%、98.45%、99.88%、99.88%和99.36%。因此，研究所鑒定的蟲體準確，可以進行后續(xù)試驗。

2.2 序列分析

研究測得的6 種線蟲的線粒體基因cox1 序列長度均為1 578 bp；無齒圓形線蟲的nad1 核苷酸序列長度為879 bp，其余5 種線蟲的核苷酸序列長度均為873 bp；6 種線蟲的rnnL 序列全長均不同，分別為長傘杯冠線蟲（976 bp）、冠狀冠環(huán)線蟲（974 bp）、細口杯環(huán)線蟲（980 bp）、拉氏杯口線蟲（978 bp）、麥氏副杯口線蟲（973 bp）和無齒圓形線蟲（959 bp）。cox1 基因與其他23 種圓線科線蟲比較發(fā)現(xiàn)，除蝶狀盅口線蟲（Cyathostomum pateratum）的核苷酸序列長度為1 575 bp，氨基酸為524 個外，其余圓線科線蟲的核苷酸序列長度和氨基酸數(shù)量均為1 578 bp 和525個。nad1 核苷酸序列長度除了圓形屬線蟲核苷酸序列稍長（876～879 bp）和氨基酸（291、292 bp）稍多外，其余線蟲的核苷酸均為873 bp，氨基酸為290 個。而所有圓線科rnnL 序列長度則不規(guī)律，大小在959～983 bp之間（表2）。這6 種線蟲的cox1 的A+T 含量在67.55%～69.71% 之間，AT 斜率在-0.28 與-0.24 之間；nad1 的A+T 含量在71.36%～73.83% 之間，AT 斜率在-0.33 與-0.29 之間；rnnL 的A+T 含量在80.88%～82.59%之間，AT 斜率在-0.04 與-0.03 之間。這些圓線科線蟲的三種線粒體基因均呈AT 偏好。

將這6 種線蟲的cox1、nad1 和rnnL 基因序列與GenBank 中其他23 種馬圓線蟲進行相似性分析發(fā)現(xiàn)，馬圓線科線蟲間的相似性分別為83.4%～97.9%，79.0%～98.5%和78.8%～98.9%。在cox1 基因分析中，無齒圓形線蟲與馬圓形線蟲（Strongylus equinus）的相似性最高，為97.9%，鋸齒三齒線蟲（Triodontophorus serratus）和細口杯環(huán)線蟲最低，為83.4%；在nad1基因中，無齒圓形線蟲與馬圓形線蟲相似度最高，為97.3%，鋸齒三齒線蟲和普通圓形線蟲（Strongylus vulgaris）相似性最低，為79.0%；在rnnL 中，無齒圓形線蟲與馬圓形線蟲相似性最高，為98.9%，無齒圓形線蟲與異齒杯口線蟲（Poteriostomum imparidentatum）相似性最低，為79.5%。特別值得注意的是，短尾三齒線蟲（Triodontophorus brevicauda）的cox1 基因與同亞科馬圓形線蟲的相似性為86.0%，而與盅口亞科的小唇片冠環(huán)線蟲（Coronocyclus labratus）的相似性為88.1%；在nad1 的相似性分析中，短尾三齒線蟲與普通圓形線蟲的相似性為80.3%，而與盅口亞科的隱匿杯環(huán)線蟲（Cylicocyclus insignis）為89.0%；對rnnL 的分析也是如此，短尾三齒線蟲與普通圓形線蟲的相似性為82.2%，與盅口亞科的隱匿杯環(huán)線蟲為84.3%。比較分析還發(fā)現(xiàn)，三齒屬線蟲與盅口亞科的相似性總體要高于同亞科的圓線屬。

2.3 進化分析

以串聯(lián)的線粒體cox1、nad1 和rrnL 基因為標記，構建的系統(tǒng)進化樹見圖1。進化樹形成了兩大分支，一個分支為圓形屬線蟲，另一個分支包括盅口亞科所有線蟲和三齒屬線蟲。在圓線屬的分支中，無齒圓形線蟲與馬圓形線蟲聚集一起，再與普通圓形線蟲相聚，說明前兩者關系更近。在另一大分支中，3 種三齒線蟲形成一獨立分支，而其他盅口亞科線蟲形成另一分支。在盅口亞科分支中，所有的杯環(huán)屬線蟲均在一個分支中，雖然其中含有冠狀冠環(huán)線蟲，仍然認為其為單系；大唇片冠環(huán)線蟲（Coronocyclus labiatus）和小唇片冠環(huán)線蟲與兩種杯冠線蟲（長傘杯冠線蟲和高氏杯冠線蟲）及盅口屬形成姊妹支；5 條微小杯冠線蟲單獨分支與長傘杯冠線蟲和高氏杯冠線蟲離的很遠，因此推測杯冠屬和冠環(huán)屬應為復系；在盅口亞科線蟲的最外側，是麥氏副杯口線蟲、拉氏杯口線蟲和異齒杯口線蟲形成一個小分支，但同屬并沒有聚集在一起。

圖1 基于線粒體cox1，nad1 和rnnL 串聯(lián)序列通過BI 法構建的6 種線蟲與其他圓線科線蟲的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of six worms with other strongylidae nematodes reconstructed by BI method based on combined mitochondrial genes cox1，nad1 and rnnL sequences

3 討論

傳統(tǒng)的馬圓線蟲間的親緣關系研究以形態(tài)學為主，同屬間的關系自然要近于不同屬間，但在分類過程中可存在一些人為因素。隨著科技的發(fā)展，分子生物學研究更具科學性，基于基因序列信息從分子層面反應物種進化過程中的異同，從而盡可能完整的還原物種的進化過程，體現(xiàn)它們間的親緣關系[15-16]。線粒體基因組及其單獨基因，特別是一些保守的基因，如cox1、nad1 在寄生蟲分類學、種群遺傳學和系統(tǒng)學研究中有著廣泛的應用[8-9，16]。也有許多學者利用串聯(lián)的線粒體基因對寄生蟲進行遺傳和分類探究，Wang 等[17]通過對來自黑龍江、吉林、陜西和云南四省的40 條羊仰口線蟲（Bunostomum trigonocep-halum）的線粒體cox1，cytb，nad1 和nad5 基因序列進行序列分析和進化分析，結果表明不同地區(qū)的羊仰口線蟲基因間存在著較低的種內變異，沒有明顯的地理區(qū)分；Lavikainen 等[18]利用串聯(lián)的線粒體基因cox1 和nad1 基因序列對來自加拿大、土耳其、俄羅斯等國的Taenia crassiceps，Taenia hydatigena，Taenia martis，Taenia ovis krabbei 等絳蟲進行進化分析，結果與以前采用單獨基因的結果一致；Duan 等[19]對來自黑龍江、內蒙古的短尾三齒線蟲（Triodontophorus brevicauda）和日本三齒線蟲（Triodontophorus nipponicus）的線粒體cox1、cytb 和nad5 基因序列進行遺傳變異分析，并通過三個序列串聯(lián)進行進化分析，證明這些基因是序列分析和進化分析的良好基因標記。

研究獲得了長傘杯冠線蟲、冠狀冠環(huán)線蟲、細口杯環(huán)線蟲、拉氏杯口線蟲、麥氏副杯口線蟲和無齒圓形線蟲的線粒體基因cox1、nad1 和rrnL 序列。這6種線蟲的三段線粒體基因序列與其他23 種圓線科線蟲相比，cox1 和nad1 基因序列長度基本一致（蝶狀盅口線蟲、無齒圓形線蟲、馬圓形線蟲和普通圓形線蟲除外），而rrnL 在長度上差異較大，這與典型后生動物線粒體cox1、nad1 和rrnL 基因的長度特點一致[9-10，20]。研究6 種線蟲的cox1、nad1 和rrnL基因序列的A+T 含量與目前已經被鑒定的大多數(shù)線蟲相似[9-10]，而A+T 含量的百分比明顯高于吸蟲，如華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）（cox1：59.04%；rrnL：59.12%；nad1：62.13%）[21]。這6 種線蟲rrnL 基因的A+T 含量的百分比大于cox1 和nad1 基因，類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在前人研究的其他線蟲線粒體基因中，并且AT 斜率也與其他圓線科線蟲相似[18，21-22]。在這三段不同基因的相似性比較分析中，無齒圓形線蟲總是與馬圓形線蟲的相似性最高。麥氏副杯口線蟲，拉氏杯口線蟲和異齒杯口線蟲與其他線蟲的相似性均不高，這與Gao 等[9，23]的研究結果一致。更為重要的是，研究分析發(fā)現(xiàn)，cox1 和rrnL 基因序列比較分析中，29 種蟲體的相似性雖然有高有低，但總體來看，三齒屬線蟲與同亞科圓線蟲間的相似性要低于盅口亞科，而nad1基因比較中，三齒屬線蟲與圓線蟲間的相似性均低于或等于盅口亞科。

研究基于線粒體cox1、nad1 和rrnL 基因序列構建了馬圓線科線蟲的進化樹，對蟲體間的親緣關系進行探討。在盅口亞科中，冠狀冠環(huán)線蟲與杯環(huán)屬的線蟲聚集在一起，與杯環(huán)屬關系更近，研究結果與Zhang 等[24]以核糖體大亞基D3+區(qū)的序列信息構建的21 種馬的圓線蟲進化樹結果相似，其結果也顯示冠狀冠環(huán)線蟲與杯環(huán)屬的線蟲在同一分支內，因此冠狀冠環(huán)線蟲確實是一個比較特殊的蟲體，也進一步證明冠環(huán)屬為復系。5 條微小杯冠線蟲（已被證明是復合種）單獨分支，而長傘杯冠線蟲和高氏杯冠線蟲卻聚集在一起，兩組間距離卻很遠，這與Gao 等[10]利用線粒體全基因組和Huang 等[25]基于核糖體ITS序列探究30 種馬圓線蟲的進化關系分析的結果一致，因此支持微小杯冠線蟲是復雜種的觀點，認為杯冠屬為復系。麥氏副杯口線蟲和異齒杯口線蟲先聚集，再與拉氏杯口線蟲形成一小分支，研究結果與Tombak 等[26]利用ITS 基因序列結果不同，可能是他的分析中還有真臂副杯口線蟲（Parapoteriostomum euproctus）的原因，因此更多的圓線蟲相關基因被擴增應用十分重要。同時認為，副杯口屬線蟲、杯口屬線蟲與其他盅口亞科線蟲關系更遠。研究發(fā)現(xiàn)，三種三齒線蟲并沒有與同亞科的圓線屬聚集在一起，而是與盅口亞科蟲體在一起，研究結果與Gao 等[9]基于線粒體全基因組研究結果相似，因此研究結果也支持三齒屬線蟲屬于盅口亞科的假說。

研究首次擴增了長傘杯冠線蟲、冠狀冠環(huán)線蟲、細口杯環(huán)線蟲、拉氏杯口線蟲、麥氏副杯口線蟲和無齒圓形線蟲的線粒體基因cox1、nad1 和rrnL 的序列，并通過序列分析和進化分析探討了馬圓線科線蟲間的親緣關系，為馬圓線蟲的分類學、群體遺傳學和系統(tǒng)學研究提供基礎資料。