蘇思雨，陳楠楠，趙志博，朱戰(zhàn)波，2，周玉龍，2，張澤財(cái)，2，劉宇，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心）

近年來，我國的畜禽集約化養(yǎng)殖模式發(fā)展迅速，致病微生物對(duì)于畜禽業(yè)健康發(fā)展的影響越來越大。由細(xì)菌和病毒引起的畜禽疫病不僅能嚴(yán)重影響畜禽健康及其相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量，造成畜牧業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]，還威脅著人類健康。因此，畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的疫病防控工作是至關(guān)重要的，其中消毒劑的廣泛使用發(fā)揮了重要作用。當(dāng)前畜禽業(yè)常用的消毒劑主要包括鹵素類、酸類、堿類、醇類、酚類、醛類、強(qiáng)氧化劑類以及季銨鹽類等[3]。其中，強(qiáng)氧化劑類消毒劑能快速殺菌，但其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易分解，甚至釋放有毒有害氣體。在日常生活中廣泛使用的含氯消毒劑對(duì)金屬具有腐蝕性，對(duì)人皮膚和黏膜有刺激性，釋放有毒氣體。另外，醇、酚和醛類消毒劑也存在易揮發(fā)，釋放有毒有害氣體以及遇明火易燃等安全問題。因此，低毒安全，對(duì)人和物品無腐蝕性的季銨鹽類消毒劑引起了人們的關(guān)注。

季銨鹽類化合物（Quatemary ammonium compounds，QACs）屬于陽離子表面活性劑，無色無味，無腐蝕性，刺激性低，可對(duì)畜禽的體表和飲水消毒，具有長效、高效、廣譜殺菌等特點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。畜禽生產(chǎn)中QACs 常用于環(huán)境消毒、器具消毒、體表消毒、術(shù)前手部消毒、創(chuàng)面消毒以及農(nóng)作物飼料的防霉[6]，在預(yù)防動(dòng)物疾病中發(fā)揮著重要作用[7]。此外，QACs 易吸附于物體表面，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且與防凍劑有較好的相容性，所以在長效抑菌和低溫消毒方面也有廣闊的應(yīng)用前景。QACs 按化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為單鏈季銨鹽和雙鏈季銨鹽，兩種季銨鹽的消毒殺菌機(jī)制基本相同，表現(xiàn)為QACs 溶解時(shí)解離出的季銨鹽陽離子吸附到表面有負(fù)離子的病原體上，破壞膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)膜的通透性，使蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)泄露，影響細(xì)胞的呼吸和糖代謝過程，引起蛋白質(zhì)變性，呈現(xiàn)殺菌作用[8]。而雙鏈季銨鹽與單鏈季銨鹽的不同，主要表現(xiàn)在雙鏈季銨鹽能夠干擾病原體合成核酸和蛋白質(zhì)的過程[9]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，QACs 能夠殺滅多種細(xì)菌和親脂病毒，如苯扎氯銨能夠有效殺滅大腸桿菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌及克雷伯菌等革蘭陰性菌，對(duì)鏈球菌、葡萄球菌、真菌、厭氧菌和霉菌也有殺滅作用[4]。此外，0.2%的苯扎氯銨溶液可在15 s內(nèi)殺滅新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）[10]，10 mg·L-1羥乙基/羥丙基季銨鹽對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率達(dá)到了100%，且毒性低[11-12]，烷基二甲基芐基氯化銨和雙癸基二甲基氯化銨消毒劑可在-18 ℃下殺滅脊髓灰質(zhì)炎病毒[13]。QACs 對(duì)真菌也有殺滅作用，研究發(fā)現(xiàn)以苯扎溴銨和六亞甲基四胺為主要成分的復(fù)合消毒劑，不僅可以殺滅大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，還能有效地殺滅黑曲霉孢子和白色念珠菌[14]。

試驗(yàn)旨在明確自主合成的季銨鹽表面活性劑氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide，C12cmpC）對(duì)黑龍江部分地區(qū)禽源病原菌和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）的殺滅或抑制活性，為基于季銨鹽表面活性劑消毒劑的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、病毒株和細(xì)胞

鵝源大腸桿菌（DQ207234、QE1-2-1、XH197291、QE1-3-1、YZE191205、QE191291、QS195313[15]）、雞巴氏桿菌（DQ203719）、雞鏈球菌（DQ205134）、雞金黃色葡萄球菌（DQ204741）分離株由實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。ATCC 標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸桿菌（ATCC10536）和金黃色葡萄球菌（ATCC6538）。CP 型BVDV（NADL 株），牛腎細(xì)胞（Madin-darby bovine kidney，MDBK）保存于黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心。

1.2 主要試劑

氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide，C12cmpC）由齊齊哈爾大學(xué)郭祥峰教授團(tuán)隊(duì)合成（見表1）。甘氨酸購自鄭州市千盛化工原料有限公司；卵磷脂購自鄭州福宏生物科技有限公司；吐溫-80 購自江蘇省海安石油化工廠。營養(yǎng)瓊脂（NB）和營養(yǎng)肉湯（NA）購自青島海博生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；Penicillin-Streptomycin Solution 購自Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司；TB Green Premix Ex Taq II 購自TaKaRa 公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司；CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自Dojindo Laboratories 公司。

1.3 方法

1.3.1 抗細(xì)菌活性測(cè)定

1.3.1.1 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

依據(jù)VAH 方法7 和EN 14885[16-17]，通過微量稀釋法測(cè)定C12cmpC 對(duì)不同致病菌的最低抑菌濃度。用滅菌蒸餾水將C12cmpC 原液（濃度為2 000 mg·L-1）進(jìn)行二倍稀釋，得到8 個(gè)不同濃度的C12cmpC。用PBS 將指示菌濃度稀釋至5×105～5×106CFU·mL-1。使用96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)組：每孔添加80 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、10 μL C12cmpC 和10 μL 細(xì)菌懸液；空白對(duì)照組：每孔添加100 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；陽性對(duì)照組：每孔添加90 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和10 μL 細(xì)菌懸液。隨后將細(xì)胞板置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長狀況，確定最低抑菌濃度，試驗(yàn)做了3 次重復(fù)。

1.3.1.2 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定

參照德國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，微生物學(xué)（DGHH）方法和EN 14885[16-18]以及最低抑菌濃度試驗(yàn)方法，將不同濃度的C12cmpC 與相應(yīng)試驗(yàn)菌的懸液混合，吸取100 μL混合液加入到營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基中，用玻璃涂布棒涂抹均勻，37 °C 恒溫培養(yǎng)24 h。隨后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確定C12cmpC 的MBC，試驗(yàn)重復(fù)3 次，懸浮液細(xì)菌檢出量為1.0～5.0×108CFU·mL-1。

殺菌率=（對(duì)照組菌數(shù)-樣品組菌數(shù)）/對(duì)照組菌數(shù)×100%

1.3.1.3 時(shí)間殺菌試驗(yàn)

參照VAH 方法8 和EN 14885[16-17]，將不同稀釋度的C12cmpC 和試驗(yàn)菌混勻，置于20 ℃水浴中。將0.1 mL 細(xì)菌懸液和10 mL C12cmpC 混合，分別作用1、5、15、30 min。然后，立即吸取0.1 mL 混液與10 mL中和劑在試管中混勻，持續(xù)作用10 min，再取0.1 mL混合液與10 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基在試管中混勻，置于37 °C 下培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長狀況，試驗(yàn)做3次重復(fù)。

1.3.2 抗病毒活性測(cè)定

1.3.2.1 C12cmpC 對(duì)細(xì)胞生長狀況的影響

待接種于24 孔板的MDBK 細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)到80%時(shí)，加入各試驗(yàn)濃度的C12cmpC 溶液，混合均勻。終濃度分別為1、2.5、5、10、20 mg·L-1。另設(shè)置一個(gè)不加C12cmpC 的對(duì)照組。隨后將細(xì)胞板在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12、24、48、72 h，分別在顯微鏡下觀察各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長狀況。

1.3.2.2 C12cmpC 對(duì)細(xì)胞活性的影響

根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書的操作步驟，設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)組，每組分別含有1、2.5、5、10、20 mg·L-1C12cmpC 溶液的MDBK 細(xì)胞。設(shè)置2 個(gè)對(duì)照組，分別為無細(xì)胞組和不添加C12cmpC 溶液組。每個(gè)組設(shè)有5 個(gè)重復(fù)孔，將96 孔板置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h。然后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS 輕緩地洗滌細(xì)胞2 次，添加100 μL DMEM 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，輕敲細(xì)胞板混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱5%、CO2條件下避光孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組溶液的OD450值，計(jì)算各試驗(yàn)組的細(xì)胞存活率。

1.3.2.3 C12cmpC 抗BVDV 病毒效果

參照EN 14885[16]方法，選取濃度為5 mg·L-1的C12cmpC 與BVDV 分別作用1、5、30、60 min。隨后，從各試驗(yàn)孔吸取50 μL 混合液加入到MDBK 細(xì)胞中。設(shè)置3 個(gè)對(duì)照組，分別為MDBK 細(xì)胞組，MDBK細(xì)胞+C12cmpC 組以及BVDV+MDBK 細(xì)胞組。將細(xì)胞板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，Trizol 法提取RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green 法和CFX96 Touch Real-Time PCR 系統(tǒng)檢測(cè)分析MDBK細(xì)胞中BVDV mRNA 的表達(dá)水平，反應(yīng)體系參照TaKaRa 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒操作說明書。BVDV 的引物序列為5′-GAG TAC AGG GTA GTC GTC AG-3′和5′-CTC TGC AGC ACC CTA TCA GG-3′[19]。β-actin 引物序列為5′-CGC ACC ACT GGC ATT GTC AT-3′和5′-TCC AAG GCG ACG TAG CAG AG-3′[19]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的詳細(xì)反應(yīng)條件為95 ℃30 s，95 ℃10 s，56 ℃30 s，72 ℃15 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3 次重復(fù)，差異基因的表達(dá)分析參照2-ΔΔCt方法。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 6.0 中的One-way ANOVA、Two-way ANOVA 以及Student’s unpaired t-test分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 時(shí)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，* 代表P＜0.05，** 代表P＜0.01，***代表P＜0.001，所有數(shù)值表示均為平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 C12cmpC 的MIC 試驗(yàn)結(jié)果

C12cmpC 的MIC 檢測(cè)結(jié)果表明，C12cmpC 對(duì)鵝大腸桿菌（DQ207234）、鵝大腸桿菌（YZE191205）和雞鏈球菌（DQ205134）的MIC 均為500 mg·L-1，對(duì)其余7 株分離株的MIC 均為250 mg·L-1。對(duì)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 10536）和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 6538）的MIC 均為31.25 mg·L-1，低于10 株 分離株（見表2）。

2.2 C12cmpC 的MBC 及時(shí)間殺菌試驗(yàn)結(jié)果

C12cmpC 的MBC 及時(shí)間殺菌檢測(cè)結(jié)果表明，C12cmpC 對(duì)鵝大腸桿菌（QS195313）的殺菌效果最好，500 mg·L-1的C12cmpC 作用1 min 可達(dá)到99.9%的殺菌率。500 mg·L-1的C12cmpC 作用5 min 時(shí)，對(duì)鵝大腸桿菌（QE191291）、雞巴氏桿菌（DQ203719）和雞金黃色葡萄球菌（DQ204741）的殺菌率為99.9%（見表3）。

表3 氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺的最低殺菌濃度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results of the minimum bactericidal concentration of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide

2.3 C12cmpC 對(duì)MDBK 細(xì)胞生長狀態(tài)的影響

選擇不同濃度的C12cmpC 處理MDBK 細(xì)胞，分別在作用12、24、48、72 h 時(shí)，顯微鏡下觀察各試驗(yàn)組MDBK 細(xì)胞的生長狀態(tài)。結(jié)果顯示（圖1），在相同作用時(shí)間點(diǎn)，C12cmpC 的濃度越高，MDBK 細(xì)胞的生長狀態(tài)越差。此外，同一濃度C12cmpC 作用MDBK 細(xì)胞的時(shí)間越長，細(xì)胞的生長狀態(tài)越差。依據(jù)檢測(cè)結(jié)果，選擇1、2.5、5、10、20 mg·L-1作為下一步細(xì)胞活性檢測(cè)所用的C12cmpC 濃度參考范圍。

圖1 不同濃度氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺作用不同時(shí)間時(shí)MDBK 細(xì)胞的形態(tài)（100×）Fig.1 Morphology of MDBK cells treated with different concentrations of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide for different time（100×）

2.4 C12cmpC 對(duì)MDBK 細(xì)胞活性的影響

選取濃度為1、2.5、5、10、20 mg·L-1的C12cmpC溶液作用MDBK 細(xì)胞，不加C12cmpC 的MDBK 細(xì)胞為對(duì)照。各試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)72 h，通過CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MDBK 細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，當(dāng)C12cmpC 濃度為10 mg·L-1（P＜0.001）和20 mg·L-1（P＜0.001）時(shí)，MDBK 細(xì)胞的存活率顯著下降。依據(jù)結(jié)果（圖2），選定5 mg·L-1為C12cmpC 對(duì)MDBK 細(xì)胞的最大安全濃度。

圖2 不同濃度氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺對(duì)MDBK 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of chlorinated-Ndodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide on survival rate of MDBK cells

2.5 C12cmpC 抗BVDV 活性檢測(cè)

選取5 mg·L-1的C12cmpC 與BVDV 分別作用1、5、30、60 min。處理后的病毒液加入MDBK 細(xì)胞中培養(yǎng)72 h，qRT-PCR 檢測(cè)BVDV mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果如圖3 所示，C12cmpC 處理后BVDV mRNA的表達(dá)水平顯著降低（1 min，P＜0.05；5 min，P＜0.05；30 min，P＜0.01；60 min，P＜0.01）。

圖3 氯化－N－十二烷基吡啶－1－乙酰胺對(duì)BVDV mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of N-dodecyl-2-（piridin-1-ium）acetamide on the expression level of BVDV mRNA

3 討論

消毒劑的使用在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的疫病防控中占據(jù)至關(guān)重要的地位，消毒效果的好壞直接影響?zhàn)B殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。季銨鹽類消毒劑因其低毒性、低腐蝕性、高效且廣譜抑菌等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，對(duì)多種細(xì)菌的殺滅作用和抗病毒功能也被逐漸發(fā)現(xiàn)。苯扎氯銨是季銨鹽類消毒劑的第一代產(chǎn)品，當(dāng)濃度為1 000 mg·L-1時(shí)，作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌2 min，可以殺滅99.8%和99.9%的細(xì)菌[20]。同樣為單鏈季銨鹽類消毒劑的十八烷基三甲基氯化銨對(duì)大腸桿菌的MIC 為125 mg·L-1[21]。雙鏈季銨鹽類消毒劑雙癸基二甲基氯化銨對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 均為400 mg·L-1[22]。研究中C12cmpC 對(duì)大腸桿菌（ATCC 10536）和金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）標(biāo)準(zhǔn)株的MIC 均為31.25 mg·L-1，以62.5 mg·L-1的濃度作用1 min 時(shí)，即可達(dá)到99.9%以上的殺菌率，C12cmpC 對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值更小。然而，試驗(yàn)中C12cmpC 對(duì)10 株分離菌株的殺菌活性低于標(biāo)準(zhǔn)菌株。后續(xù)臨床試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況相應(yīng)地提高濃度進(jìn)行檢測(cè)與分析。

季銨鹽消毒劑主要通過作用于生物膜來發(fā)揮作用，可殺滅有囊膜的病毒[23]。BVDV 含有囊膜，是影響?zhàn)B牛業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要病毒[24]。研究發(fā)現(xiàn)，C12cmpC 對(duì)BVDV 作用1 min，可以顯著抑制BVDV 復(fù)制，具有抗BVDV 的作用。此外，程晶等[25]在探究多種消毒劑對(duì)非洲豬瘟病毒的滅活作用中發(fā)現(xiàn)，季銨鹽消毒劑苯扎溴銨對(duì)豬原代肺泡巨噬細(xì)胞的最高安全濃度為2.5 mg·L-1。Verena 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，苯扎氯銨對(duì)斑馬魚肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞活力的半數(shù)效應(yīng)濃度分別為8.5×10-4mg·L-1和2.74×10-3mg·L-1。試驗(yàn)中C12cmpC 對(duì)MDBK 細(xì)胞的最大安全濃度為5 mg·L-1。在保證較高的抗病毒活性下避免了C12cmpC 對(duì)MDBK 細(xì)胞活性的不良影響，這為后續(xù)深入探索C12cmpC 抗病毒作用提供了依據(jù)。

目前，季銨鹽類消毒劑已經(jīng)發(fā)展到了第七代，僅通過改變季銨鹽類化合物的結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)消毒劑的殺菌效果越來越難，并且這種方式的研發(fā)成本也相對(duì)較高。將季銨鹽類消毒劑復(fù)配其他種類消毒劑，制備新型復(fù)合消毒劑逐漸成為消毒劑開發(fā)領(lǐng)域新的發(fā)展趨勢(shì)[9]。多種消毒劑成分的復(fù)配，不僅能夠彌補(bǔ)單一消毒劑組分殺菌效果不足的缺點(diǎn)，也能通過產(chǎn)生協(xié)同作用增強(qiáng)復(fù)合消毒劑的殺菌效果。劉歡等[27]在評(píng)估一種季銨鹽和醛類的復(fù)合消毒劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合消毒劑不僅能夠減弱醛類的毒性和刺激性，還能提高殺菌效果，并且能殺滅新城疫病毒和豬瘟病毒。此外，由于季銨鹽類化合物屬于陽離子表面活性劑，不能與陰離子表面活性劑和氧化劑同時(shí)使用，也不能接觸拮抗劑和有機(jī)物[28]?？傊?，開發(fā)低毒、高效、殺菌作用持久的季銨鹽類表面活性劑消毒劑，對(duì)于畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的臨床消毒具有重要意義。

4 結(jié)論

季銨鹽類表面活性劑氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺（C12cmpC）對(duì)禽源致病菌（大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌）和牛病毒性腹瀉病毒均有殺滅作用，研究結(jié)果為C12cmpC 的臨床應(yīng)用和新型季銨鹽類消毒劑的開發(fā)提供了依據(jù)。