孔斌雪，李 娜，馬靖福，竇佳欣，陳 濤，張沛沛，劉 媛，楊德龍,**

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

蔗糖是光合作用的產(chǎn)物，其作為最初的能量供體與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各種代謝途徑相關(guān)，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[1-2]。蔗糖參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、種子萌發(fā)、開花誘導(dǎo)、花青素合成、果實(shí)發(fā)育等一系列生理代謝過(guò)程[3]。蔗糖代謝研究對(duì)于了解植物生理具有重要意義。蔗糖合成酶(sucrose synthase，SUS)是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)蔗糖代謝的重要酶之一，在蔗糖運(yùn)輸?shù)綆?kù)器官之前將其分解[4]，首先在小麥胚芽中被發(fā)現(xiàn)[5]。SUS 在植物代謝過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，其活性與庫(kù)強(qiáng)度、生物量積累以及碳分配相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)：SUS 活性可影響水稻籽粒大小及產(chǎn)量[6]；玉米sh1突變體和豌豆rug4突變體胚乳的SUS 活性與野生型相比均有所下降，表現(xiàn)出籽粒干癟和粒質(zhì)量下降[7-8]；擬南芥SUS基因突變體葉片和莖中的SUS 活性與野生型相比下降15%[9]；SUS 受到RNAi 抑制后，馬鈴薯塊莖中的淀粉含量降低，導(dǎo)致干質(zhì)量下降，番茄中的蔗糖卸載能力也降低，座果數(shù)下降[10-11]。除參與廣泛的代謝過(guò)程外，SUS 還與非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)：SUS基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著氧氣含量的降低而增強(qiáng)[12-14]。SUS 也在熱應(yīng)激條件下植物的生理代謝中發(fā)揮作用[15-16]。

在高等植物中，SUS 由1 個(gè)小的多基因家族編碼。前人對(duì)多種植物的SUS基因家族成員進(jìn)行了鑒定和研究，結(jié)果顯示：擬南芥(Arabidopsis thaliana)[17]、水稻(Oryza sativa)[13]、煙草(Nicotiana sylvestris)[18]和巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)[19]有6 個(gè)SUS基因家族成員，石榴(Punica granatum)[20]和葡萄(Vitis vinifera)[21]有5 個(gè)SUS基因家族成員，亞洲棉(Gossypium arboreum)有7 個(gè)SUS基因家族成員[22]，楊樹(Populus trichocarpa)有15 個(gè)SUS基因家族成員[23]。前人對(duì)SUS基因家族的研究發(fā)現(xiàn)：SUS基因遵循基因家族進(jìn)化，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)保守但功能分化[24]。

小麥(Triticum aestivumL.)是全球最重要的糧食作物之一[25]，其產(chǎn)量受灌漿速率和灌漿持續(xù)期的影響[26]。小麥籽粒灌漿是蔗糖等光合產(chǎn)物向庫(kù)器官運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程[27]，是決定粒質(zhì)量、產(chǎn)量和品質(zhì)的重要時(shí)期。目前，僅有少數(shù)小麥SUS基因被鑒定，TaSUS1、TaSUS2和TaSUS3在發(fā)育的籽粒中表達(dá)，在整個(gè)小麥主要灌漿期均檢測(cè)到TaSUS的轉(zhuǎn)錄本[28-29]。研究還發(fā)現(xiàn)：水稻籽粒胚乳的SUS活性決定水稻籽粒庫(kù)強(qiáng)，對(duì)水稻籽粒灌漿過(guò)程起調(diào)節(jié)作用[30]，這表明小麥SUS基因家族在調(diào)節(jié)籽粒灌漿和產(chǎn)量方面可能起關(guān)鍵作用。本研究利用小麥全基因組序列信息鑒定小麥SUS基因家族成員，并對(duì)其生物信息學(xué)特征進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究小麥SUS基因家族調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，特別是在籽粒發(fā)育中的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥SUS 基因家族成員的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

從Ensemble Plants 數(shù)據(jù)庫(kù)[31]下載小麥全基因組數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)序列和注釋文件，鑒定小麥SUS基因家族的成員。從PFAM 數(shù)據(jù)庫(kù)[31]下載SUS保守結(jié)構(gòu)域HMMER 文件(PF00862)，并將其作為查詢序列用于搜索小麥蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的SUS基因家族成員(閾值≤1×10-10)。為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步通過(guò)NCBI-CDD、Inter Pro 和SMART 數(shù)據(jù)庫(kù)[32-34]驗(yàn)證其是否具有SUS 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)上述結(jié)果，剔除重復(fù)基因和不含SUS 結(jié)構(gòu)域的基因，然后使用MEGA 軟件[35]對(duì)擬南芥、水稻和小麥SUS基因家族蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并在EvolView[36]網(wǎng)站美化系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

1.2 小麥SUS 基因的染色體定位與序列分析

利用Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得TaSUS基因在染色體上的位置，利用TBtools 軟件進(jìn)行定位。利用 MEME Suite 在線工具[37]分析TaSUS基因家族成員的保守結(jié)構(gòu)域，參數(shù)motif 數(shù)量設(shè)置為10，使用 TBtools 軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖和motif 圖。利用TBtools 軟件提取TaSUS基因編碼區(qū)上游2 000 bp序列，并提交到PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)[38]確定順式作用元件的種類和數(shù)量。通過(guò)ExPASY 在線工具[39]預(yù)測(cè)最終得到的TaSUS基因家族成員的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量。亞細(xì)胞定位通過(guò)Gpos-mPLoc 在線工具[40]進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 小麥SUS 基因復(fù)制及共線性分析

片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)對(duì)基因家族擴(kuò)張非常重要[41]，為分析不同物種間SUS基因家族的共線性，從Ensemble Plants 數(shù)據(jù)庫(kù)[31]下載不同物種的基因組信息，并采用TBtools 中的One Step MCScanX 模塊進(jìn)行共線性分析以及可視化。

1.4 小麥SUS 基因的表達(dá)模式分析

從小麥表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)expVIP[42]下載小麥品種中國(guó)春的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析TaSUS基因在其籽粒、根、莖、葉和穗5 個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄水平?；虮磉_(dá)量熱圖利用TBtools 軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaSUS 基因家族成員的鑒定與命名

從小麥全基因組中鑒定到24 個(gè)SUS基因(表1)，命名為TaSUS1～TaSUS24。小麥SUS 蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量在560～1 074 之間，分子質(zhì)量為63.61～118.27 ku，理論等電點(diǎn)為5.69～8.69，除Ta-SUS2、TaSUS4、TaSUS6、TaSUS19、TaSUS21和TaSUS24 外，其他TaSUS 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都小于7，呈酸性。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明：除TaSUS17 和TaSUS22 位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜外，其他TaSUS 蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)。TaSUS基因家族成員均含有SUS 結(jié)構(gòu)域。

表1 小麥SUS 基因家族的理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of SUS gene family in wheat

2.2 TaSUS 基因的系統(tǒng)進(jìn)化

由TaSUS基因與6 個(gè)擬南芥AtSUS基因、6 個(gè)水稻OsSUS基因的蛋白序列構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)可知：SUS基因家族可被分為3 個(gè)亞家族。其中，Ⅰ類基因20 個(gè)，包括擬南芥基因4 個(gè)、水稻基因4 個(gè)和小麥基因12 個(gè)；Ⅱ 類基因13 個(gè)，包括擬南芥基因2 個(gè)、水稻基因2 個(gè)和小麥基因9 個(gè)；Ⅲ 類基因只包含3 個(gè)小麥基因。部分小麥SUS基因家族成員與水稻的遺傳關(guān)系比其與擬南芥更密切。

圖1 小麥、擬南芥和水稻SUS 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of SUS gene family in wheat,Arabidopsis and rice

2.3 TaSUS 蛋白保守結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)

由圖2 可知：每個(gè)TaSUS 蛋白序列都包含多個(gè)(4～10 個(gè))保守基序(motif)，其中motif1、mo-tif2、motif3 和motif8 保守分布于TaSUS 蛋白序列；同屬于第Ⅲ亞組的TaSUS7、TaSUS8 和TaSUS9 的motif 較為特異，motif 長(zhǎng)且分散。這表明同一家族中的小麥TaSUS 蛋白高度保守，并且在進(jìn)化過(guò)程中，不同亞群中的成員可能發(fā)生了功能分化?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示：除TaSUS12基因只含有9 個(gè)外顯子外，其余基因外顯子數(shù)量為12～17個(gè)；18 個(gè)TaSUS基因具有完整的非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，但TaSUS1和TaSUS12基因的3′和5′端均沒有UTR，TaSUS17、TaSUS20、TaSUS22和TaSUS23的3′端不含UTR；同一亞組的TaSUS基因結(jié)構(gòu)分布相對(duì)保守。

圖2 小麥SUS 基因家族的蛋白保守基序和基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Protein conserved motif and gene structure of SUS gene family in wheat

2.4 TaSUS 基因的染色體定位和共線性

染色體定位結(jié)果顯示：除1、5 號(hào)染色體外，TaSUS基因在其他染色體均有分布，其中，4A、7A 和7D 染色體上各有3 個(gè)TaSUS基因，3、6 號(hào)染色體上僅各有1 個(gè)TaSUS基因；共線性分析鑒定出20 對(duì)片段重復(fù)基因，且7 號(hào)染色體上的片段重復(fù)基因占比最多(8 個(gè))，每一對(duì)片段重復(fù)基因都位于相同的TaSUS亞組，且小麥SUS基因家族中不存在串聯(lián)重復(fù)基因 (圖3a)。物種間水稻、擬南芥和小麥SUS基因的共線性分析結(jié)果(圖3b)顯示：1 對(duì)TaSUS基因與AtSUS基因具有共線性，16 對(duì)TaSUS基因與OsSUS基因具有共線性，說(shuō)明小麥SUS基因家族與水稻SUS基因家族親緣關(guān)系較近，可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖3 SUS 基因家族在小麥染色體上的定位(a)以及物種間的共線性(b)Fig.3 Location on the chromosomes of wheat (a) and synteny among species (b) of SUS genes family

2.5 TaSUS 基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件

TaSUS基因的啟動(dòng)子區(qū)共鑒定出45 種順式作用元件，可分為激素響應(yīng)元件(hormone responsive elements，HRE)、光響應(yīng)元件(light responsive elements，LRE)、脅迫響應(yīng)元件(stress responsive elements，SRE)、組織特異性元件(tissue specific elements，TSE)和其他響應(yīng)元件(other responsive elements，ORE)(圖4)。植物激素、光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件存在于所有TaSUS基因的啟動(dòng)子區(qū)，其中，激素相關(guān)的順式作用元件有生長(zhǎng)素(auxin，IAA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)和赤霉素(gibberellin，GA)。在小麥SUS基因家族成員中，有80%的成員都包含ABA 相關(guān)的作用元件ABRE 以及MeJA 相關(guān)的作用元件CGTCA-motif 和TGACGmotif；LRE 在24 個(gè)TaSUS基因啟動(dòng)子中普遍存在；每個(gè)TaSUS基因啟動(dòng)子都包含1～8 個(gè)SRE，對(duì)低溫、缺氧、干旱等脅迫做出響應(yīng)；在TSE中，有RY-element、CAT-box 和GCN4_motif 順式作用元件，分別與種子、分生組織和胚乳發(fā)育相關(guān)；TaSUS基因啟動(dòng)子中還包含ORE，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律調(diào)控、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)和MYB 結(jié)合位點(diǎn)。說(shuō)明TaSUS基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著多種作用。

圖4 TaSUS 基因中的順式作用元件Fig.4 Cis-acting elements in TaSUS genes

2.6 TaSUS 基因的表達(dá)模式

由圖5 可知：大多數(shù)TaSUS基因在小麥穗中顯著表達(dá)，在葉、莖和根中的相對(duì)表達(dá)量較低，Ta-SUS3、TaSUS5和TaSUS6在小麥籽粒中顯著表達(dá)。

圖5 小麥 SUS 基因在不同組織中的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of SUS gene in different tissues of wheat

3 討論

SUS基因家族對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，但鮮有小麥中SUS基因的鑒定與功能研究。本研究共鑒定到24 個(gè)TaSUS成員，明顯多于其他植物，其原因可能是小麥作為六倍體物種，基因組龐大，同源基因較多。前人研究表明：片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)是植物中常見的基因復(fù)制事件，在基因家族擴(kuò)展過(guò)程中扮演重要角色[43]。在鑒定到的24 個(gè)TaSUS基因中，有20 對(duì)基因存在片段復(fù)制，說(shuō)明在小麥SUS基因家族擴(kuò)增過(guò)程中重復(fù)事件發(fā)揮了重要作用，分析其原因可能是小麥SUS基因家族成員較多。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明：36 條 SUS 蛋白序列分為Ⅰ、Ⅱ 和Ⅲ組，這與其他植物中SUS的報(bào)道[2-3,17]一致，且Ⅰ組中的基因數(shù)量最多，Ⅲ組中不包含OsSUS和AtSUS基因，表明小麥中亞家族Ⅰ比其他基因組擴(kuò)展得多。

SUS 蛋白一般是平均分子質(zhì)量約為90 ku(約800 個(gè)氨基酸)的同源四聚體[2]，如水稻OsSUS1-6[13]、擬南芥AtSUS1-5[17]和石榴PsSUS1-4[20]，但其他SUS 異構(gòu)體的分子質(zhì)量則不同，如葡萄VvSS5 分子質(zhì)量為102.7 ku[21]，擬南芥AtSUS6分子質(zhì)量為106.86 ku[17]，甘蔗SoSuSy4 分子質(zhì)量為106.81 ku[3]。本研究表明：大多數(shù)小麥SUS 蛋白分子質(zhì)量約為90 ku，且都含有酸性氨基酸，有少數(shù)蛋白的分子質(zhì)量大于100 ku，其物理化學(xué)性質(zhì)與其他植物相似。已有研究表明：SUS Ⅰ和SUS Ⅱ基因有15 個(gè)外顯子，而SUS Ⅲ基因因存在3′端延伸有17 個(gè)外顯子[24]。本研究發(fā)現(xiàn)：小麥SUS家族基因的外顯子為 9～17 個(gè)，表明小麥進(jìn)化過(guò)程中SUS基因家族外顯子存在增加或缺失。

基因表達(dá)模式分析可在一定程度上用于預(yù)測(cè)基因參與的生理過(guò)程[21,44-45]。本研究發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)TaSUS基因在小麥穗中顯著表達(dá)，TaSUS3、Ta-SUS5和TaSUS6在小麥籽粒中顯著表達(dá)，表明TaSUS基因可能在調(diào)節(jié)小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用；TaSUS12基因雖未在小麥品種中國(guó)春的組織中表達(dá)，但其可能在其他小麥品種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。SUS基因?qū)麑?shí)發(fā)育的調(diào)節(jié)作用已在其他植物中得到證實(shí)，如：VvSS3在營(yíng)養(yǎng)組織漿果中高表達(dá)，對(duì)調(diào)節(jié)漿果中的糖積累起關(guān)鍵作用[21]；在17 個(gè)PbrSUS基因中，有8 個(gè)在梨幼果中的表達(dá)量較高，且其表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟逐漸降低[46]；MdSUS1.1/1.2主要在幼果和成熟果實(shí)中表達(dá)，在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中MdSUS2.1的表達(dá)量達(dá)到最高[47]；AtSUS2在擬南芥的成熟種子中特異性表達(dá)[17]。本研究表明：TaSUS基因在小麥穗和籽粒中的表達(dá)水平高于葉、莖和根，說(shuō)明SUS可能參與調(diào)節(jié)籽粒發(fā)育過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究共鑒定到24 個(gè)TaSUS基因，可分為3 個(gè)不同的亞組。同一家族中的小麥TaSUS 蛋白高度保守，推測(cè)TaSUS基因可能參與小麥的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)。下一步研究可致力于對(duì)TaSUS基因的過(guò)表達(dá)和抑制分析，確定TaSUS在籽粒發(fā)育中的特定功能。