張銘洋 張喜悅 趙格 曲志娜 高宏偉 孫敏 程慧敏 徐佳微 王君瑋 鄒明

摘要：產(chǎn)氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）是一種重要的人獸共患病原菌，α－毒素是其分子生物學(xué)檢測的主要靶標(biāo)。 試驗選?。茫欤穑澹?引物及探針建立微滴式數(shù)字ＰＣＲ（ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｔｉａｌ ＰＣＲ，ｄｄＰＣＲ）方法，最佳引物濃度０.８５ μｍｏｌ/ Ｌ，探針濃度為０.３ μｍｏｌ/ Ｌ，退火溫度為６０ ℃。 利用建立的ｄｄＰＣＲ 方法檢測單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌的ＤＮＡ，結(jié)果均為陰性，表明該方法具有較好的特異性。 合成產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因，制成ＤＮＡ 標(biāo)準(zhǔn)品，選?。?個稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進行重復(fù)試驗，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于５％，證明該方法具有較好的重復(fù)性。 采用７ 個稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進行重復(fù)檢測，計算出該方法的檢測限為１２.３９ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，定量限為３３.９７ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。 通過對６８ 份臨床樣品進行檢測，證實該方法可用于臨床，且用于檢測質(zhì)粒ＤＮＡ 時無明顯的基質(zhì)效應(yīng)。 應(yīng)用ｄｄＰＣＲ 方法對標(biāo)準(zhǔn)品進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗，并聯(lián)合９ 家實驗室進行定值，最終獲得了國家市場監(jiān)督管理總局頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書（ＧＢＷ（Ｅ）０９１２３７）。 α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法的建立和ＤＮＡ 標(biāo)準(zhǔn)物的研制，為產(chǎn)氣莢膜梭菌分子生物學(xué)檢測試劑的標(biāo)準(zhǔn)化奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌；ｄｄＰＣＲ；α－毒素基因；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；特異性；靈敏度；可重復(fù)性；定值

中圖分類號：Ｓ８５２.６１文獻標(biāo)識號：Ａ文章編號：１００１－４９４２（２０２４）０１－０１５６－０８

微滴式數(shù)字ＰＣＲ （ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ，ｄｄＰＣＲ）是近年來迅速發(fā)展起來的一項定量分析技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對靶基因的精準(zhǔn)定量檢測。 數(shù)字ＰＣＲ 的概念由Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ 等[１] 首次提出，他們在檢測大腸癌患者的Ｋ－ＲＡＳ 基因突變時，進行了微升級的ＰＣＲ 擴增，分別用不同熒光檢測突變基因和正?；?，通過計算突變基因和正?；虻谋壤贸鐾蛔兟?。 隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展與優(yōu)化，ＰＣＲ 技術(shù)從普通ＰＣＲ 逐漸發(fā)展為熒光定量ＰＣＲ，目前的ｄｄＰＣＲ 屬于第三代ＰＣＲ。 ｄｄＰＣＲ 技術(shù)通過對樣品進行微滴化處理，經(jīng)ＰＣＲ 擴增后對所有微滴進行逐個檢測，有熒光信號的判讀為１，無熒光信號的判讀為０，再根據(jù)泊松分布原理和陽性微滴的數(shù)量與比例可得出目的分子的起始拷貝數(shù)。 與傳統(tǒng)ＰＣＲ 及熒光定量ＰＣＲ 相比，ｄｄＰＣＲ具有樣本需求量低、絕對定量以及高靈敏度、高重復(fù)性、高耐受性等優(yōu)勢[２－４] 。 目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物、致病菌、病毒、食品安全等領(lǐng)域。

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ） 廣泛分布于土壤、污水、飼料和動物腸道中，可導(dǎo)致動物的壞死性腸炎、腸毒血癥，以及人類的腹瀉和食物中毒等疾病[１－２] 。 近年來，關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌分子生物學(xué)診斷方法的報道較多，但多為傳統(tǒng)的ＰＣＲ 和熒光定量ＰＣＲ 方法，使用的靶基因均為α－毒素基因。 隨著產(chǎn)氣莢膜梭菌分子生物學(xué)檢測試劑的廣泛應(yīng)用，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)的需求也越來越強烈。 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以滿足檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的需求，因此，本研究旨在建立產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 檢測方法，并應(yīng)用于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)。

１ 材料與方法

１.１ 供試菌株及樣品

產(chǎn)氣莢膜梭菌（ＡＴＣＣ１３１２４）、單核細胞增生李斯特菌（ＡＴＣＣ１９１１１）、沙門氏菌（ＡＴＣＣ１４０２８）、大腸桿菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、腸球菌（ＡＴＣＣ２９２１２）、金黃色葡萄球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）、彎曲桿菌（ＡＴＣＣ３３５５９）均由國家獸醫(yī)微生物菌（毒）種保藏中心動物衛(wèi)生與流行病學(xué)分中心保存。 產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性病料由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心致病微生物監(jiān)測室保存。

１.２ 試劑和儀器

ｄｄＰＣＲ 探針法超預(yù)混液（不含ｄＵＴＰ）、微滴發(fā)生油購自北京匯力宏業(yè)生物科技有限公司。α－毒素基因、引物和探針序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 微滴式數(shù)字ＰＣＲ 檢測系統(tǒng)（伯樂ＱＸ２００，美國）。

１.３ 試驗設(shè)計與方法

１.３.１ ｄｄＰＣＲ 方法的建立 參照Ｇｒａｕ－Ｒｏｍａ[５] 、Ｘｕ[６] 等的方法分別合成２ 對引物和探針（表１）。

分別使用上述２ 對引物建立ｄｄＰＣＲ 方法并進行反應(yīng)條件優(yōu)化。 引物和探針分別設(shè)置４ 個濃度梯度，其中１０ μｍｏｌ/ Ｌ 引物加樣量設(shè)置為：１.３、１.５、１.７、１.９ μＬ；１０ μｍｏｌ/ Ｌ 探針加樣量設(shè)置為：０.３、０.６、０.９、１.２ μＬ。 退火溫度設(shè)置為５６、５８、６０、６２ ℃。通過比較ｄｄＰＣＲ 的檢測拷貝數(shù)、微滴生成數(shù)、微滴分布狀態(tài)、微滴熒光信號的強度確定最佳反應(yīng)條件。

１.３.２ 特異性、重復(fù)性、檢出限和定量限試驗 分別以產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌的ＤＮＡ 為模板， 用產(chǎn)氣莢膜梭菌α － 毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法檢測以評價其特異性。 選?。?個濃度梯度（１０１、１０２、１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ） 的標(biāo)準(zhǔn)品ＤＮＡ為模板，在間隔第７ 天和第１４ 天分別進行重復(fù)試驗，每個濃度設(shè)３ 個重復(fù)，記錄各次試驗的拷貝數(shù)，并分析組內(nèi)和組間的變異系數(shù)，以檢測該方法的重復(fù)性。 參考?分析方法檢出限和定量限的評估?（ＧＢ/ Ｔ ２７４１５—２０１３）[７] 中的方法進行檢出限（ＩＤＥ）和定量限（ＩＱＥ）的測定。 以７ 個濃度梯度（１０－１、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品ＤＮＡ 為模板，每個梯度重復(fù)檢測９ 次，用產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因的ｄｄＰＣＲ 方法對其擴增，評估方法的檢出限、定量限和動態(tài)范圍。

１.３.３ ｄｄＰＣＲ 方法的臨床應(yīng)用及基質(zhì)效應(yīng)評估

取實驗室保存的６８ 份臨床陽性病料，其中產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性病料３８ 份，沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌陽性病料各５ 份，提?。模危?作為臨床樣本進行產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法鑒定。 依據(jù)?基質(zhì)效應(yīng)與互通性評估指南?（ＷＳ/ Ｔ３５６—２０１１）[８] 中的方法對制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行基質(zhì)效應(yīng)與互通性評估驗證。 選取產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床陽性樣本２０ 份，濃度在１０２ ～ １０４ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ間隨機分布。 準(zhǔn)備５ 份制備樣本，將制備樣本與臨床樣本隨機穿插排列，使用ｄｄＰＣＲ 方法測定所有樣本。

１.３.４ 候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備 通過ＮＣＢＩ 網(wǎng)站Ｂｌａｓｔ 比對，合成具有代表性的產(chǎn)氣莢膜梭菌α－ｔｏｘｉｎ 基因（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２７７７２４.１） 片段，克隆至ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ 質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ １０ 感受態(tài)細胞。 經(jīng)擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒備用。 應(yīng)用ＫｐｎⅠ（ＮＥＢ，美國）對質(zhì)粒進行線性化處理，反應(yīng)體系為２ μＬ ｃｕｔｓｍａｒｔ、３ μＬ ＫｐｎⅠ、５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ、１０ μＬ質(zhì)粒（５３.６５ ｎｇ/ μＬ），３７ ℃水?。?ｈ。 回收后的線性化質(zhì)粒，稀釋后分裝作為候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，－８０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１.３.５ 候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的鑒定及檢驗 對產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因質(zhì)粒進行常規(guī)ＰＣＲ 鑒定、雙酶切和測序鑒定，并對其進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗，鑒定方法參照文獻[９]進行。

１.３.６ 定值 選擇９ 家具備認(rèn)可資質(zhì)的實驗室，對候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行聯(lián)合定值。 對測得的數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗、組內(nèi)可疑值檢驗、組間等精度檢驗以及各組平均值之間的ｔ 檢驗，并計算樣品的不確定度，對候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，并通過有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評估實驗室定值的穩(wěn)定性[７，９] 。

２ 結(jié)果與分析

２.１ ｄｄＰＣＲ 方法的建立

分別使用２ 對引物建立ｄｄＰＣＲ 方法，結(jié)果Ｃｌｐｅｒ 引物探針具有更好的特異性，故在本研究中，使用該引物探針進行目標(biāo)基因的擴增。 對引物和探針的濃度進行優(yōu)化，結(jié)果１０ μｍｏｌ/ Ｌ 引物的用量為１.７ μＬ、１０ μｍｏｌ/ Ｌ 探針的用量為０.６μＬ，即反應(yīng)濃度分別為０.８５ μｍｏｌ/ Ｌ 和０.３ μｍｏｌ/ Ｌ時，ｄｄＰＣＲ 檢測拷貝數(shù)最多，微滴分布狀態(tài)、微滴熒光信號的強度也均較好（圖１Ａ）。 退火溫度優(yōu)化結(jié)果顯示，６０ ℃ 時特異性最好，且信號強度較強（圖１Ｂ）。最終建立的ｄｄＰＣＲ 方法，主要包括微滴生成、ＰＣＲ 擴增和微滴讀取３ 個步驟。 ①微滴生成。 反應(yīng)體系為ｓｕｐｅｒｍｉｘ １０ μＬ、上、下游引物（１０ μｍｏｌ/ Ｌ） 各１.７ μＬ、探針（１０ μｍｏｌ/ Ｌ） ０.６μＬ、模板１ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ５.０ μＬ，加入至微滴生成卡的ｓａｍｐｌｅ 孔；在微滴生成卡的ｏｉｌ 孔中加入７０ μＬ微滴生成油；將生成卡放入微滴生成儀，生成微滴。 ②ＰＣＲ 擴增。 將生成的微滴轉(zhuǎn)移至９６ 孔板，蓋膜后放入熱封儀封膜；將封好膜的９６ 孔板放入ＰＣＲ 儀進行擴增；ＰＣＲ 擴增程序為：５０ ℃ ２ｍｉｎ；９５ ℃ １０ ｍｉｎ；９５ ℃ ３０ ｓ，６０ ℃ １ ｍｉｎ，４０ 個循環(huán)；９８ ℃ １０ ｍｉｎ，４ ℃ ６０ ｍｉｎ。 ③微滴讀取。 擴增完畢后將９６ 板轉(zhuǎn)移至ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ 微滴讀取儀上進行微滴讀取。 在以上確定的反應(yīng)條件下，陰、陽性微滴劃分閾值劃定在熒光強度為２ ０００的位置。

加樣說明參見表２。

２.２ 特異性、重復(fù)性、檢出限和定量限結(jié)果

分別以單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌的ＤＮＡ 為模板，用建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法檢測，結(jié)果均為陰性（圖２），表明特異性較好。

選?。?個濃度梯度（１０１、１０２、１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的標(biāo)準(zhǔn)品ＤＮＡ 為模板，分別在第１、７、１４ 天進行重復(fù)試驗，每個梯度設(shè)３ 個平行，記錄各次試驗的拷貝數(shù)，并統(tǒng)計分析組內(nèi)和組間的變異系數(shù)。 結(jié)果３個梯度標(biāo)準(zhǔn)品的組內(nèi)變異系數(shù)為０.７３％ ～３.１７％，組間變異系數(shù)為３.３６％ ～４.２７％（表３），重復(fù)性和重現(xiàn)性較好。

采用７ 個濃度梯度（１０－１、１００、１０１、１０２、１０３、１０４ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ 和１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因質(zhì)粒ＤＮＡ 進行檢測。 每個稀釋度３個重復(fù)。 結(jié)果（圖３）表明，ｄｄＰＣＲ 反應(yīng)產(chǎn)生的微滴數(shù)量超過１０ ０００ 個，當(dāng)稀釋度為１０１ ～１０４時，產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因拷貝數(shù)與濃度之間呈良好的線性關(guān)系，可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖４）。 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為ｙ＝ ４.３１９ｘ＋１４.５３，Ｒ２ ＝ ０.９９９，計算得出檢出限為１２. ３９ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， 定量限為３３. ９７ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

Ａ０８、Ｂ０８、Ｃ０８ 的ＤＮＡ 濃度為１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，Ｄ ０８、Ｅ０８、Ｆ０８的ＤＮＡ濃度為１０４ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ，Ｇ０８、Ｈ０８ 的ＤＮＡ 濃度為１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｂ０９、Ｃ０９、Ｄ０９ 的ＤＮＡ 濃度為１０２ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｅ０９、Ｆ０９、Ｇ０９ 的ＤＮＡ 濃度為１０１ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｈ０９、Ｄ１０、Ｅ１０ 的ＤＮＡ 濃度為１００ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｆ１０、Ｇ１０、Ｈ１０ 的ＤＮＡ 濃度為１０－１ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

２.３ 候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備與鑒定

將提取的ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ 質(zhì)粒進行雙酶切和ＰＣＲ 鑒定，結(jié)果均可見大小為１ １４６ ｂｐ 的片段，符合預(yù)期（圖５Ａ、Ｃ）。 電泳鑒定線性化質(zhì)粒，僅見１ 條條帶且大小正確，證實酶切完全（圖５Ｂ）。將質(zhì)粒交由公司進行測序，結(jié)果其序列與大腸產(chǎn)氣莢膜梭菌α－ｔｏｘｉｎ 完全一致。 證明產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因質(zhì)粒ＤＮＡ 候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因序列正確。

２.４ 臨床樣品的驗證及基質(zhì)效應(yīng)評價

對６８ 份臨床陽性病料進行檢測，結(jié)果３８ 份產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性病料的拷貝數(shù)均高于１ ０００（熒光值均高于２ ０００），其他非特異性菌株陽性病料的拷貝數(shù)均為零（熒光值均低于２ ０００）。 證明建立的ｄｄＰＣＲ 方法可用于臨床樣品的檢測。測定的結(jié)果采用線性回歸分析方法進行分析，參考?基質(zhì)效應(yīng)與互通性評估指南?[８] 中的方法，計算樣本測定值雙側(cè)９５％置信區(qū)間。 結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測定均值在臨床樣本９５％置信區(qū)間內(nèi)（圖６），表明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

２.５ 候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢驗

對２０ 管候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行均勻性檢驗，采用單因素方差分析法（Ｆ 檢驗法）對結(jié)果進行分析，結(jié)果Ｆ<Ｆα，表明樣品是均勻的。 經(jīng)穩(wěn)定性檢驗，樣品可在－２０ ℃條件下穩(wěn)定儲存１８ 個月，基因含量未發(fā)生顯著變化；將樣品置于４ ℃保存８ ｄ，結(jié)果樣品的檢測值無顯著變化，表明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在４ ℃運輸條件下可穩(wěn)定保持。 模擬反復(fù)凍融，結(jié)果樣品凍融３０ 次，基因含量未發(fā)生顯著變化。

２.６ 定值

聯(lián)合９ 家實驗室應(yīng)用ｄｄＰＣＲ 方法進行定值。應(yīng)用ＳＰＳＳ 軟件，對定值數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，結(jié)果顯示數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布；應(yīng)用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ做出正態(tài)分布的直方圖，擬合正態(tài)曲線（圖７）。對組內(nèi)數(shù)據(jù)可疑值檢驗，結(jié)果各組所有最大值和最小值之差的絕對值｜ｖｉ ｜均小于l（α，ｎ）ｓ，證實組內(nèi)沒有可疑值。 對各組數(shù)據(jù)進行等精度檢驗，計算出Ｃ 值為０.１８，實驗室取α 為０.０５，數(shù)據(jù)組數(shù)９，重復(fù)測定次數(shù)９，查科克倫檢驗臨界值Ｃ（α，ｍ，ｎ） 為０.２７；結(jié)果Ｃ≤Ｃ（α，ｍ，ｎ） ，表明各組數(shù)據(jù)為等精度。 對平均值最大組及平均值最小組之間的數(shù)據(jù)進行ｔ 檢驗，ｔ 值為２.７４，查ｔ 值表ｔα為２.７８，ｔ<ｔα，證明各組平均值之間無顯著差異[７] 。

２.７ 不確定度評定

用ｕＡ，ｒｅｌ表示相對Ａ 類不確定度，經(jīng)計算ｕＡ，ｒｅｌ為２.１％。 用ｕＢ，ｒｅｌ 表示Ｂ 類相對不確定度，經(jīng)計算ｕＢ，ｒｅｌ為３.２％。 用ｕｂｂ，ｒｅｌ表示均勻性差異帶來的不確定度，經(jīng)計算為２.３％。 用Ｕｌｔｓ和Ｕｓｔｓ分別表示長期和短期不確定度，經(jīng)計算分別為６.６０％和３.４２％。將各分量合成得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成相對不確定度ｕＣＲＭ，ｒｅｌ 為８.６７％，擴展相對不確定度ｕＣＲＭ，ｒｅｌ為１７.３４％，擴展不確定度ｕＣＲＭ為０.５９×１０３ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。 綜合確定制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值為（３.４３±０.４３）×１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

２.８ 比對與驗證

購置中國計量科學(xué)研究院制備的豬繁殖與呼吸障礙綜合征標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用ｄｄＰＣＲ 方法對其進行測定。 ３ 次的結(jié)果分別為９.４１×１０８、９.３８×１０８、９.４２×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，經(jīng)分析，該值符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)說明書上的定值（標(biāo)準(zhǔn)值９.４×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，擴展不確定度０.９×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）。 證明本研究建立的ｄｄＰＣＲ 方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值正確。

３ 討論與結(jié)論

產(chǎn)氣莢膜梭菌分布廣泛，對人類和動物的健康造成嚴(yán)重危害。 該菌可產(chǎn)生多種毒素，其中Ａ型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的α－毒素是動物和人食源性感染的主要毒素型。 研究表明，α－毒素能夠突破血腦屏障、侵害延髓、破壞呼吸系統(tǒng)及心臟的傳導(dǎo)系統(tǒng)，最終引發(fā)動物“猝死癥”[１０] 。 產(chǎn)氣莢膜梭菌可跟據(jù)其產(chǎn)生的４ 種主要毒素（α、β、ε、ι）分為５ 種毒素型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。 其中α－毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的主要致死毒素，是一種多功能磷脂酶，幾乎所有產(chǎn)氣莢膜梭菌都能產(chǎn)生α－毒素。Ｙｏｎｏｇｉ 等[１１] 建立了用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌各種毒素的多重ＰＣＲ 檢測方法；ｖａｎ Ａｓｔｅｎ 等[１２] 針對α、β、ε 等毒素建立了多重ＰＣＲ 檢測方法；Ｓｈａｎ￣ｎｏｎ 等[１３] 建立了用于檢測城市污水中特定病原菌的熒光定量ＰＣＲ 檢測方法；Ｈａｎａｂａｒａ 等[１４] 建立了用于檢測人類糞便中食源性致病菌的熒光定量ＰＣＲ 檢測方法；另有其他眾多關(guān)于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的報道[１５－２２] ，他們使用的靶基因均為α－毒素基因。

ｄｄＰＣＲ 方法是一種對核酸分子進行絕對定量的檢測技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于病原檢測領(lǐng)域，尤其適用于對低拷貝、低含量病原早期的精準(zhǔn)檢測，可有效彌補普通熒光定量ＰＣＲ 方法的不足。ｄｄＰＣＲ 將反應(yīng)體系分散為上萬個微滴，微滴經(jīng)ＰＣＲ 擴增后，利用微滴檢測儀對每個微滴進行檢測，最后根據(jù)泊松分布原理，直接計算陽性微滴的個數(shù)，從而實現(xiàn)直接定量核酸濃度。 本研究建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法，具有較好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，與Ｌｉ[２３－２４] 、Ｃｏｒ￣ｂｉｓｉｅｒ[２５] 、Ｄｕｐａｓ[２６] 等的報道一致。ｄｄＰＣＲ 檢測中，ＤＮＡ 濃度過高會超出儀器的檢測范圍，無法直接用于檢測；而ＤＮＡ 濃度過低則會對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。 為保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，以更好地應(yīng)用于臨床，本研究制備了濃度相對較低（１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ） 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。 ｄｄＰＣＲ 為直接定量方法，其對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果是全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會評價其可信度的主要指標(biāo)。 本研究利用建立的ｄｄＰＣＲ 方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行定值，并獲得了國家市場監(jiān)督管理總局頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書（ＧＢＷ（Ｅ） ０９１２３７）。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)成功，可促進產(chǎn)氣莢膜梭菌診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化，減少檢測誤差，確保檢驗人員的檢測能力，規(guī)范試劑盒的管理。

相較于其他定值方法，ｄｄＰＣＲ 法對技術(shù)人員和試劑等要求更高，但隨著技術(shù)進步和試劑成本的逐步降低，本研究建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 檢測方法，必將具有廣闊的應(yīng)用前景。

參 考 文 獻：

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