粟治勝 王曉江 李 正△ 劉 東

（1.重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院，重慶 400050；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400016）

香煙暴露是導(dǎo)致肺損傷的病理過程之一。吸煙使得繼發(fā)呼吸道細(xì)菌反復(fù)感染加劇，導(dǎo)致肺部疾病的發(fā)病率和死亡率不斷增高，嚴(yán)重威脅人們身體健康［1］。對(duì)煙霧型肺損傷進(jìn)行預(yù)防，并在發(fā)病機(jī)制中找尋延緩損傷的藥物是研究的關(guān)鍵問題。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路是一種多向性轉(zhuǎn)錄因子，與B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）均存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞中，可參與多種細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄，并在眾多疾病的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)與慢性炎癥作用下起調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的作用［2-3］。經(jīng)研究，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及肺泡血管床破壞可導(dǎo)致肺大皰產(chǎn)生繼而引發(fā)肺病，而慢性炎癥、蛋白水解、抗蛋白水解活性及氧化應(yīng)激等的失衡均可增加肺部內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［4］。紅景天苷（SDS）是紅景天中主要的藥物提取物，其藥理作用包括抗心肌缺血、延緩衰老、抗輻射、抗腫瘤血管新生、抗肝纖維化、抗炎抗氧化等，是中醫(yī)治療的常用藥材［5］。經(jīng)研究，SDS 具有抗活性氧、過氧化氫所致的血管內(nèi)皮功能障礙機(jī)制，對(duì)改善微重力環(huán)境誘導(dǎo)的肺部微血管內(nèi)皮功能障礙有效［6-7］。本文主要探究SDS調(diào)控Bcl-2、NF-κB 信號(hào)通路影響煙霧暴露大鼠氧化應(yīng)激及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制，意在為臨床研究提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，年齡41 d，體質(zhì)量（150±10）g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供，使用許可證號(hào)：SCXK（湘）2020-0025。所有大鼠均在肺病中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，動(dòng)物倫理編號(hào)：A2009029。

1.2 試藥與儀器

1）藥物：紅景天苷（中國生物制品檢驗(yàn)檢定所，批號(hào)：090818-20040），用時(shí)以0.02%的氯化鈉溶液溶解（pH7.0）。醋酸潑尼松（湖北奧翔醫(yī)藥化工有限公司，EP8.0）。2）試劑與儀器：Bcl-2、NF-κB（Abcam 公司，ab59348、ab16502）、Bax（CST 公司，#2772）、CD31 抗體（美國Santa Cruz公司，b59348），紅梅（軟黃）香煙（紅塔煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，每包含焦油量12 mg、煙氣煙堿量1.1 mg、煙氣一氧化碳量13 mg），二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，10023418），中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，10004160），電泳儀（北京市六一儀器廠，DYY-6C），伊紅染液（ASPEN 公司，AS1094），流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特，CytoFLEX），包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5），戊巴比妥鈉（湖北奧翔醫(yī)藥化工有限公司，EP8.0），切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）。

1.3 模型建立

除對(duì)照組10 只大鼠外，其余均依據(jù)文獻(xiàn)［8］建立煙霧暴露模型。將大鼠放在自制玻璃染毒箱的隔層上，自由進(jìn)食飲水及活動(dòng)，于玻璃箱下1/2處點(diǎn)燃香煙，每周進(jìn)行5 d，每天2 次，每次煙霧處理1 h，每次間隔5 h以上，香煙量為10支/次。連續(xù)干預(yù)30 d，當(dāng)大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呆滯等意識(shí)障礙，呼吸急促（雙側(cè)胸廓急速運(yùn)動(dòng)），低氧血癥（SaO2＜90%或動(dòng)脈分壓≤60 mmHg，1 mmHg ≈0.133 kPa），Micro-CT 檢測出現(xiàn)兩肺彌漫性滲出影為建模成功。

1.4 分組與給藥

將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、SDS 10 mg/kg、SDS 40 mg/kg、SDS 70 mg/kg、PNS 組，每組10 只。依據(jù)文獻(xiàn)［9］，SDS 高、中、低劑量組分別按70、40、10 mg/kg給予混懸液2 mL灌胃，并均以0.02%的氯化鈉溶液溶解（pH7.0）；醋酸潑尼松（PNS）組大鼠給予混懸液3.6 mg/kg灌胃；對(duì)照組與模型組大鼠每日采用等量生理鹽水灌胃。各組均每日給藥1次，連續(xù)21 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA） 將大鼠用1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg 經(jīng)腹腔注射麻醉后，抽取尾部靜脈血2 mL 行SOD 檢測，將血清于37 ℃下水浴30 min，波長500 nm 處行蒸餾水凋零，酶標(biāo)儀測每孔OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)［（對(duì)照OD 值-測定OD 值）÷對(duì)照OD值］÷50%×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×檢測樣本前的稀釋倍數(shù)計(jì)算SOD 值。取大鼠血清，按照說明書將配好的試劑混勻于90 ℃水浴，冷卻30 min，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，酶標(biāo)儀500 nm 處測每孔OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依據(jù)［（對(duì)照OD 值-空白OD 值）÷標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值］×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 mol/mL）×檢測樣本前的稀釋倍數(shù)計(jì)算MDA值。

1.5.2 HE染色 采用戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠后，取肺組織樣品10 mg 經(jīng)梯度濃度酒精脫水，放置于二甲苯中透明，石蠟包埋、切片、脫蠟，使用10%中性甲醛固定，依次梯度酒精脫水后沖洗，烘烤后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，封片后于顯微鏡下觀察拍照。

1.5.3 肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 將經(jīng)免疫磁珠純化分離得到的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞接種在培養(yǎng)板上，靜置培養(yǎng)24 h，37 ℃PBS 漂洗3次，4 ℃4%多聚甲醛溶液固定15 min，加一抗兔抗大鼠CD31 抗體，4 ℃孵育過夜，PBS 代替一抗，與FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG 37 ℃孵育30 min，DAPI 作用10 min，沖洗甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5.4 流式細(xì)胞儀檢測肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 取肺組織微血管段碾碎研磨，加0.25%胰蛋白酶消化2 h，得細(xì)胞懸液，取流式管加200 μL 細(xì)胞懸液，5 μL Annexin V-FITC 避光反應(yīng)15 min，加5 μL PI 染液及200 μL 1 m×Tris Buffer 緩沖液，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5.5 免疫印跡檢測Bcl-2、NF-κB、磷酸化NF-κB、Bcl-2相關(guān)X因子（Bax）蛋白表達(dá) 取大鼠肺組織提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，取50 μg 蛋白樣品行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜封閉過夜，兔多克隆抗體Bcl-2（1∶3 000）、NF-κB（1∶5 000）、p-NF-κB（1∶3 000）、Bax（1∶2 000）、β-actin（1∶2 000），孵育1 h，TBS 洗滌，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育2 h，TBS洗滌后浸液、曝光、顯影后觀察結(jié)果。

1.5.6 PCR 檢測Bcl-2、NF-κB、p-NF-κB、Bax mRNA表達(dá) Trizol 法提取總RNA，取1 μL 總RNA，按RTPCR試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，條件：50 ℃30 min、90 ℃5 min、40 ℃5 min，cDNA 產(chǎn)物PCR 擴(kuò)增，引物及反應(yīng)條件。見表1。150 V 下3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并照相，分析電泳條帶灰度值，以各組與β-actin 灰度值比表示該組Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB 相對(duì)表達(dá)量，PCR產(chǎn)物量以光密度×面積表示。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以“n、%”表示。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 建模后大鼠Micro-CT檢測表達(dá)

Micro-CT 檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肺部未見明顯炎癥改變，模型組大鼠肺部炎癥大面積分布于兩肺且水腫、出血嚴(yán)重，見圖1。

圖1 Micro-CT檢測結(jié)果

2.2 各組大鼠血清中SOD、MDA表達(dá)比較

見表2。藥物干預(yù)后，SDS 70 mg/kg組的SOD 升高及MDA 降低最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且模型組與SDS 10 mg/kg 組比較無明顯差異（P＞0.05），SDS 40 mg/kg 組與PNS 組比較無明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清中SOD、MDA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠血清中SOD、MDA表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與SDS 70 mg/kg組比較，▲P ＜0.05。下同。

MDA（nmol/mg）5.54±0.08 22.91±5.52*22.89±5.49*▲16.38±3.33*#▲9.25±1.49*#16.40±3.32*#▲組 別對(duì)照組模型組SDS 10 mg/kg組SDS 40 mg/kg組SDS 70 mg/kg組PNS組n 10 10 10 10 10 10 SOD（U/mg）218.35±36.83 113.02±19.02*109.85±18.96*▲152.63±12.96*#▲174.12±15.11*#150.59±13.05*#▲

表3 各組大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡表達(dá)比較（%，±s）

表3 各組大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡表達(dá)比較（%，±s）

組 別對(duì)照組模型組SDS 10 mg/kg組SDS 40 mg/kg組SDS 70 mg/kg組PNS組n 10 10 10 10 10 10凋亡率3.61±0.25 40.02±10.02*39.83±10.03*▲27.09±8.96*#▲16.12±5.21*#27.10±9.05*#▲

2.3 各組大鼠肺組織HE染色

對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完好；模型組肺組織損傷嚴(yán)重；藥物干預(yù)后，各組肺損傷均有所緩解，其中SDS 70 mg/kg 組肺泡間隔增厚減輕，水腫、細(xì)胞增生、腔內(nèi)分泌物均改善，管周及肺泡壁有極少炎性細(xì)胞浸潤，見圖2。

圖2 各組肺組織形態(tài)（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡表達(dá)比較

藥物干預(yù)后，SDS 70 mg/kg 組的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡降低最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且模型組與SDS 10 mg/kg 比較無明顯差異（P＞0.05），SDS 40 mg/kg 與PNS 組比較無明顯差異（P＞0.05）。見表3、圖3。

圖3 各組大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡表達(dá)

2.5 各組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB mRNA表達(dá)比較

見表4。藥物干預(yù)后，SDS 70 mg/kg 組的Bax、NFκB、p-NF-κB mRNA 降低，Bcl-2 mRNA 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但模型組與SDS 10 mg/kg 組比較無明顯差異（P＞0.05），SDS 40 mg/kg 組與PNS 組比較無明顯差異（P＞0.05）。

表4 各組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB mRNA表達(dá)比較（±s）

組 別對(duì)照組模型組SDS 10 mg/kg組SDS 40 mg/kg組SDS 70 mg/kg組PNS組n 10 10 10 10 10 10 Bcl-2 1.00±0.00 0.09±0.04*0.10±0.04*▲0.29±0.08*#▲0.52±0.10*#0.30±0.09*#▲Bax 1.00±0.00 4.14±1.25*4.12±1.23*▲3.05±1.08*#▲1.83±0.66*#3.02±1.03*#▲NF-κB 1.00±0.00 3.82±0.55*3.79±0.56*▲2.32±0.38*#▲1.68±0.21*#2.29±0.35*#▲p-NF-κB 1.00±0.00 3.75±0.52*3.69±0.46*▲2.30±0.30*#▲1.71±0.20*#2.25±0.32*#▲

2.6 各組大鼠肺組織Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB 蛋白表達(dá)比較

藥物干預(yù)后，SDS 70 mg/kg 組的Bax、NF-κB、p-NF-κB 降低，Bcl-2 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且模型組與SDS 10 mg/kg 組比較無明顯差異（P＞0.05），SDS 40 mg/kg 組與PNS 組比較無明顯差異（P＞0.05），見表5、圖4。

圖4 各組Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB蛋白條帶

表5 各組Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別對(duì)照組模型組SDS 10 mg/kg組SDS 40 mg/kg組SDS 70 mg/kg組PNS組n 10 10 10 10 10 10 Bcl-2 1.00±0.00 0.21±0.04*0.25±0.04*▲1.82±0.29*#▲2.23±0.73*#1.83±0.30*#▲Bax 1.00±0.00 4.22±1.27*4.20±1.26*▲3.10±1.11*#▲1.91±0.70*#3.13±1.13*#▲NF-κB 1.00±0.00 3.87±0.58*3.84±0.56*▲2.37±0.38*#▲1.73±0.23*#2.35±0.39*#▲p-NF-κB 1.00±0.00 3.79±0.50*3.75±0.47*▲2.26±0.32*#▲1.68±0.20*#2.24±0.35*#▲

3 討 論

肺病時(shí)期代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧引發(fā)脂質(zhì)過氧化，使氧化應(yīng)激平衡被破壞，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而影響組織功能［10］。本研究中，藥物干預(yù)后，SDS 70 mg/kg 組的SOD 升高及MDA 降低最為顯著，提示高濃度的SDS對(duì)改善煙霧暴露大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有一定功效。經(jīng)研究，氧化應(yīng)激是由機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化因子相互作用產(chǎn)生氧化中間產(chǎn)物而引起的反應(yīng)。在肺病中氧化應(yīng)激發(fā)生與SOD、MDA 失衡相關(guān)，可通過啟動(dòng)多種基因的活性促進(jìn)惡性生物學(xué)行為，大量中性粒細(xì)胞浸潤促使過多氧化中間產(chǎn)物生成，推動(dòng)氣道炎癥，進(jìn)而對(duì)肺造成損害［11-12］。SDS具有降血壓、提高免疫力、抗氧化、消炎等多種藥理學(xué)作用，臨床可用于治療冠心病、糖尿病等。王艷等［13］在SDS 對(duì)機(jī)械通氣致小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用研究中表示，SDS 可通過降低肺內(nèi)活性氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和MDA，并通過水解過氧化氫和調(diào)節(jié)SOD 抑制過量活性氧自由基，維持肺內(nèi)活性氧自由基平衡，改善肺損傷時(shí)期氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果與之類似。

研究發(fā)現(xiàn)，肺損傷時(shí)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞能以細(xì)胞凋亡方式出現(xiàn)，但其引發(fā)凋亡的機(jī)制可受多因素調(diào)控［14］。本研究中，藥物干預(yù)后，SDS 70 mg/kg 組的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡降低最為顯著，表示SDS 對(duì)肺損傷大鼠的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有一定抑制作用。相關(guān)研究表示，在煙熏慢性氣道炎癥環(huán)境下，會(huì)使炎癥因子和凋亡執(zhí)行蛋白升高，導(dǎo)致肺部氣道黏膜腫脹、彌漫性肺氣腫、肺組織氣道及毛細(xì)血管內(nèi)皮凋亡產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)肺部疾病與肺損傷加重［15］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表示，SDS 對(duì)肝臟、心血管和神經(jīng)具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是由其抗氧化、抗炎的藥理作用所引起的。高全清等［16］在通過SDS 改善血管內(nèi)皮舒縮功能實(shí)驗(yàn)研究中表示，SDS 可使肺部炎癥因子和促凋亡執(zhí)行蛋白顯著下降，進(jìn)而改善慢性氣道炎癥導(dǎo)致的氣道黏膜腫脹，逆轉(zhuǎn)了肺泡隔之間血管稀薄及肺泡間隔擴(kuò)大的融合趨勢，降低了肺組織氣道與毛細(xì)血管內(nèi)皮凋亡。本研究與之結(jié)果相類似。

肺組織是機(jī)體合成多種效應(yīng)分子的主要部位之一且過程與Bcl-2、Bax、NF-κB 等信號(hào)通路具有一定相關(guān)性［17］。本研究中，藥物干預(yù)后SDS 70 mg/kg 組的Bax、NF-κB、p-NF-κB 降低及Bcl-2 升高最為顯著，表示SDS對(duì)煙霧暴露大鼠的Bcl-2、Bax、NF-κB表達(dá)具有一定調(diào)節(jié)作用。經(jīng)研究，肺病發(fā)生時(shí)可使Bax、NF-κB信號(hào)通路被激活，Bcl-2 表達(dá)被抑制，活化的Bax、NFκB 發(fā)生核易位直接激活目的基因，使凋亡執(zhí)行蛋白升高，加速了肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮凋亡［18］。李倩等表示，SDS 可能通過甲基化讓SOCS3 基因啟動(dòng)子沉默，使凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)變成抗凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)，阻止凋亡執(zhí)行蛋白激活，改善慢性氣道炎癥，抑制了肺泡壁組織及毛細(xì)血管內(nèi)皮凋亡。SDS通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、NF-κB 信號(hào)通路比值以降低肺部自噬水平，并通過阻斷肺部特異位點(diǎn)上酪氨酸或絲氨酸磷酸化抑制下游激酶活化及肺泡巨噬細(xì)胞病理效應(yīng)以降低肺損傷機(jī)制［19］。

綜上所述，SDS 可改善煙霧暴露大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)及肺組織病理結(jié)構(gòu)，降低大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平，其作用機(jī)制可能與調(diào)控經(jīng)典凋亡相關(guān)信號(hào)通路Bax/Bcl-2及炎性相關(guān)因子NF-κB水平有關(guān)，但現(xiàn)階段對(duì)于SDS 具體作用機(jī)制尚未完全掌握，期望在日后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充。