韓 丹 王 倩 陳天陽 蔡靜雯 鄭佳萍 徐 童 尹成偉

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

急性胰腺炎（AP）是胰腺的嚴(yán)重炎癥，表現(xiàn)為腹痛和胰酶升高，可引起局部或全身并發(fā)癥，發(fā)病率和死亡率高［1］。AP 患者常發(fā)生腸屏障功能障礙，該并發(fā)癥會加重AP的病情［2］。因此，降低腸道屏障損傷程度成為AP治療的重要目標(biāo)［3-4］。炎調(diào)方是由生大黃、桃仁、芒硝、玄參、赤芍、金銀花、連翹、麥冬、當(dāng)歸組成的中藥制劑。已有研究表明，口服炎調(diào)方可通過降低術(shù)后胰腺炎患者體內(nèi)多種炎癥因子水平，從而下調(diào)炎癥介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)，加快患者的康復(fù)［5］，但關(guān)于炎調(diào)方對AP 大鼠腸屏障損傷的影響鮮有報道。相關(guān)研究顯示，抑制Ras 同源基因家族成員A（RhoA）/Rho 激酶（ROCK）信號通路可緩解重癥AP大鼠胰腺損傷［6］，但炎調(diào)方能否通過調(diào)節(jié)RhoA/ROCK 信號通路影響AP大鼠腸屏障損傷尚不明確。因此，本研究主要探究炎調(diào)方對AP大鼠腸屏障損傷的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠84 只，6 周齡，體質(zhì)量為200～210 g，購自上海懿尚生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0011。飼養(yǎng)于本院實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實驗，實驗過程中動物自由進(jìn)食進(jìn)水，明暗周期12 h，所有動物實驗均按照本院實驗動物中心的實驗指南進(jìn)行，并符合3R原則。

1.2 試藥與儀器

炎調(diào)方由生大黃10 g，桃仁10 g，芒硝10 g，玄參15 g，赤芍15 g，金銀花15 g，連翹15 g，麥冬10 g，當(dāng)歸15 g 組成。所有中藥均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)大藥房，藥材煎煮收集藥液，合并兩次藥液過濾后，加入芒硝充分溶解，使生藥含量為1 g/mL，置于4℃保存?zhèn)溆?。牛磺脫氧膽酸鈉購自武漢靈靈九生物科技有限公司。烏司他丁購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。溶血磷脂酸（LPA）購自北京百靈威科技有限公司；大鼠淀粉酶、脂肪酶、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、D-乳酸、二胺氧化酶（DAO）ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔源一抗ZO-1、Occludin、RhoA、ROCK1、ROCK2、GAPDH、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.3 分組與造模

按照隨機(jī)數(shù)字表法將84 只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、炎調(diào)方低劑量組、炎調(diào)方高劑量組、烏司他丁組、LPA 組、炎調(diào)方+LPA 組，每組12 只。對照組大鼠僅分離、暴露及翻動胰腺，縫合傷口，不做其他處理。其他組大鼠構(gòu)建AP 模型。AP 大鼠模型的構(gòu)建：2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，分離并暴露胰腺，夾閉肝門與胰膽管連接處，從尾部推注5%?；敲撗跄懰徕c1 mL/kg使胰腺鼓起，松開夾閉處。若觀察到大鼠胰腺水腫且暗紅則表明模型成功［7］，進(jìn)行常規(guī)縫合傷口。

1.4 給藥方法

造模成功后立即進(jìn)行給藥處理，炎調(diào)方低劑量組、炎調(diào)方高劑量組［8］分別灌胃4.9、19.6 g/kg 炎調(diào)方藥液，且尾靜脈注射等量的生理鹽水；烏司他丁組［9］、LPA 組［10］分別尾靜脈注射7.5×103U/kg 烏司他丁、10 mg/kg LPA，且灌胃等量的生理鹽水；炎調(diào)方+LPA 組大鼠需灌胃19.6 g/kg 炎調(diào)方，尾靜脈注射10 mg/kg LPA。每6小時給藥1次，持續(xù)24 h，共給藥4次。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

末次處理結(jié)束后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心用于ELISA 試驗。血液收集后處死大鼠，分離并收集胰腺組織及回腸組織，胰腺組織固定于4%多聚甲醛溶液中用于HE 染色；回腸組織分為兩部分，一部分固定于4%多聚甲醛溶液中用于HE 染色和免疫組化染色，另一部分于-80 ℃保存用于Western blotting試驗。

1.5.1 血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO 水平檢測 嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.5.2 HE 染色檢測大鼠胰腺組織和回腸組織病理變化 胰腺和回腸組織用4%甲醛洗滌固定，脫水、浸蠟、包埋后將組織切片切成4 μm厚的切片，脫蠟、入水后進(jìn)行HE 染色。光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺和回腸組織的病理變化。

1.5.3 免疫組化染色檢測回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白平均光密度 將石蠟包埋的回腸組織切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性后，將石蠟組織切片在4 ℃下與一抗ZO-1（1∶500）、Occludin（1∶1 000）孵育過夜。第2 天，在室溫下加入山羊抗兔HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000）孵育1 h。使用二氨基聯(lián)苯胺染色切片5 min，并用蘇木精復(fù)染1 min。使用ImageJ 軟件計算ZO-1、Occludin蛋白平均光密度。

1.5.4 Western blotting 檢測回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達(dá) RIPA 裂解緩沖液用于提取回腸組織總蛋白，將蛋白進(jìn)行定量、電泳分后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉后，在4 ℃下將膜與一抗RhoA（1∶2 000）、ROCK1（1∶2 000）、ROCK2（1∶2 000）過夜孵育。次日，將膜與二抗（1∶5 000）孵育1.5 h。加入ECL 試劑可視化蛋白。使用Image J 軟件對目的蛋白灰度值進(jìn)行量化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad PRISM 9.00 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)以（±s）表示。單因素方差分析用于多組間的比較，進(jìn)一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6 水平比較

見表1。與對照組比較，模型組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，炎調(diào)方低劑量組、炎調(diào)方高劑量組、烏司他丁組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，LPA 組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與炎調(diào)方高劑量組比較，炎調(diào)方+LPA 組大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與炎調(diào)方低劑量組比較，&P ＜0.05；與炎調(diào)方高劑量組比較，△P ＜0.05。下同。

組別對照組模型組炎調(diào)方低劑量組炎調(diào)方高劑量組烏司他丁組LPA組炎調(diào)方+LPA組n 12 12 12 12 12 12 12淀粉酶（U/L）715.56±34.48 2 654.45±125.56*2 028.77±131.35#1 169.53±79.96#&1 151.52±68.87#&3 066.79±148.87#1 756.23±121.23△脂肪酶（U/L）126.68±6.77 635.57±29.94*512.67±23.38#235.56±10.67#&230.36±9.89#&956.68±41.15#436.67±20.54△TNF-α（pg/mL）32.26±1.58 236.68±10.03*189.95±7.94#75.54±3.23#&71.15±3.06#&282.58±12.33#155.56±6.91△IL-6（pg/mL）27.73±1.31 145.52±6.82*114.46±5.03#56.68±2.11#&52.29±2.35#&179.93±8.04#86.68±3.77△

2.2 各組大鼠血清中D-乳酸、DAO水平比較

見表2。與對照組比較，模型組大鼠血清中D-乳酸、DAO 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，炎調(diào)方低劑量組、炎調(diào)方高劑量組、烏司他丁組大鼠血清中D-乳酸、DAO 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，LPA 組大鼠血清中D-乳酸、DAO 水平升高（P＜0.05）；與炎調(diào)方高劑量組比較，炎調(diào)方+LPA 組大鼠血清中D-乳酸、DAO水平升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中D-乳酸、DAO水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清中D-乳酸、DAO水平比較（±s）

組 別對照組模型組炎調(diào)方低劑量組炎調(diào)方高劑量組烏司他丁組LPA組炎調(diào)方+LPA組n 12 12 12 12 12 12 12 D-乳酸（μmol/L）21.44±1.01 36.67±1.52*30.56±1.47#23.38±1.25#&21.94±1.21#&42.28±2.15#28.86±1.34△DAO（mIU/mL）6.15±0.28 11.78±0.49*9.89±0.37#7.94±0.31#&7.86±0.28#&14.45±0.61#8.91±0.52△

2.3 各組大鼠胰腺組織和回腸組織病理變化

見圖1。胰腺組織HE 染色結(jié)果顯示：對照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠可觀察到胰腺水腫和大量炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，炎調(diào)方低劑量組、炎調(diào)方高劑量組、烏司他丁組大鼠胰腺組織病理損傷減輕；與模型組比較，LPA組大鼠胰腺組織病理損傷加??；與炎調(diào)方高劑量組比較，炎調(diào)方+LPA 組大鼠胰腺組織病理損傷嚴(yán)重?；啬c組織HE 染色結(jié)果顯示：對照組大鼠腸道形態(tài)完整；模型組大鼠腸黏膜受損，腸絨毛倒伏和脫落，腸絨毛的高度降低且不均勻；與模型組比較，炎調(diào)方低劑量組、炎調(diào)方高劑量組、烏司他丁組大鼠回腸組織病理損傷減輕；與模型組比較，LPA組大鼠回腸組織病理損傷加?。慌c炎調(diào)方高劑量組比較，炎調(diào)方+LPA組大鼠回腸組織病理損傷嚴(yán)重。

圖1 大鼠胰腺組織和回腸組織病理變化（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)比較

見圖2、表3。與對照組比較，模型組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin 蛋白平均光密度降低（P＜0.05）；與模型組比較，炎調(diào)方低劑量組、炎調(diào)方高劑量組、烏司他丁組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin 蛋白平均光密度升高（P＜0.05）；與模型組比較，LPA 組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白平均光密度降低（P＜0.05）；與炎調(diào)方高劑量組比較，炎調(diào)方+LPA組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白平均光密度降低（P＜0.05）。

圖2 大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)（免疫組化染色，200倍）

表3 各組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白光密度值比較（%，±s）

表3 各組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白光密度值比較（%，±s）

組 別對照組模型組炎調(diào)方低劑量組炎調(diào)方高劑量組烏司他丁組LPA組炎調(diào)方+LPA組n 12 12 12 12 12 12 12 ZO-1蛋白16.67±0.69 10.21±0.43*12.35±0.46#15.52±0.51#&15.58±0.57#&8.67±0.34#13.35±0.58△Occludin蛋白12.26±0.46 7.88±0.31*9.21±0.36#11.35±0.42#&11.49±0.43#&5.56±0.23#9.65±0.41△

2.5 各組大鼠回腸組織中RhoA/ROCK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

見圖3、表4。與對照組比較，模型組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，炎調(diào)方低劑量組、炎調(diào)方高劑量組、烏司他丁組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，LPA 組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與炎調(diào)方高劑量組比較，炎調(diào)方+LPA組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白條帶

表4 各組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)比較（%，±s）

表4 各組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)比較（%，±s）

組 別對照組模型組炎調(diào)方低劑量組炎調(diào)方高劑量組烏司他丁組LPA組炎調(diào)方+LPA組n 12 12 12 12 12 12 12 RhoA/GAPDH 0.82±0.06 1.96±0.15*1.67±0.12#1.06±0.08#&1.03±0.09#&2.51±0.17#1.51±0.11△ROCK1/GAPDH 0.61±0.06 1.51±0.14*1.16±0.11#0.84±0.07#&0.82±0.07#&1.86±0.13#1.03±0.12△ROCK2/GAPDH 0.26±0.02 0.79±0.06*0.61±0.05#0.36±0.03#&0.34±0.03#&0.93±0.05#0.51±0.04△

3 討 論

AP 是一種常見的腹部急癥，通常會導(dǎo)致包括腸道在內(nèi)的多器官衰竭。腸功能障礙發(fā)生于AP早期，且預(yù)后差［11］。血清淀粉酶和脂肪酶濃度是AP 臨床診斷的常用指標(biāo)［12］，本研究通過構(gòu)建了AP 大鼠模型，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶水平升高，符合AP的特征。炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 參與AP 的發(fā)生和發(fā)展［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平升高，胰腺組織病理損傷嚴(yán)重，表明AP大鼠存在炎性損傷。另有研究報道，腸道屏障是人體的有效防御系統(tǒng)，將內(nèi)部和外部環(huán)境分開，以防止?jié)撛谟泻ξ镔|(zhì)的通過［14］。相關(guān)研究表明，D-乳酸、DAO 是腸黏膜損傷的常見標(biāo)志物，其水平越高，提示腸黏膜損傷越嚴(yán)重［15］；此外，緊密連接由跨膜細(xì)胞黏附分子組成，包括Occludin 和ZO-1 蛋白，它的主要功能是阻止炎癥介質(zhì)的入侵，只允許離子和小分子可溶性物質(zhì)通過腸道屏障，進(jìn)而維持腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能完整性［16-17］。本研究顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中D-乳酸、DAO水平升高，回腸組織病理損傷嚴(yán)重，回腸組織中ZO-1、Occludin 蛋白平均光密度降低，表明AP 大鼠存在腸屏障損傷。因此，改善腸屏障損傷可能成為治療AP的有效策略之一。

炎調(diào)方是由生大黃、桃仁、芒硝、玄參、赤芍、金銀花、連翹、麥冬、當(dāng)歸組成的中藥制劑。方中大黃、桃仁、芒硝共為君藥，具有清熱通腑之功；玄參、赤芍為臣藥，助君藥以清熱養(yǎng)陰、涼血泄熱；金銀花、連翹佐臣不僅能清熱解毒，還能使?fàn)I分熱毒從氣分而解，同時佐用麥冬、當(dāng)歸補(bǔ)陰養(yǎng)血通便。全方配伍具有通腑泄熱、涼血活血之功效。據(jù)報道，炎調(diào)方可減輕膿毒癥大鼠過度的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)膿毒癥致腑實營熱證患者的胃腸功能，對膿毒癥大鼠腸黏膜屏障起保護(hù)作用［2，18-19］。本研究亦顯示，炎調(diào)方可改善AP大鼠炎癥反應(yīng)及腸屏障損傷，且炎調(diào)方劑量越高，改善作用越明顯。烏司他丁是臨床上常用于治療AP 的藥物［20］，本研究以該藥物為陽性藥物，結(jié)果顯示，烏司他丁與高劑量炎調(diào)方對AP 大鼠炎癥反應(yīng)及腸屏障損傷的改善作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示炎調(diào)方可能成為治療AP的潛在有效藥物。

在炎癥等病理狀態(tài)下，RhoA/ROCK 信號通路可通過影響細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)和配體，抑制細(xì)胞分化，削弱腸道屏障的完整性，引起局部炎癥擴(kuò)散到全身，加重疾病進(jìn)展［21］。據(jù)報道，抑制RhoA/ROCK 信號通路可改善膿毒癥小鼠胰腺損傷［22］；抑制RhoA/ROCK 信號通路可以保護(hù)重癥AP 大鼠腸道屏障功能，改善通透性［23］。本研究顯示，與模型組比較，LPA 組大鼠回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達(dá)升高，炎癥反應(yīng)及腸屏障損傷嚴(yán)重，且LPA 為RhoA 激活劑，表明RhoA/ROCK 信號通路確實參與了AP 大鼠炎癥反應(yīng)及腸屏障損傷過程。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，炎調(diào)方可抑制回腸組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表達(dá)，且炎調(diào)方劑量越高，抑制作用越明顯，推測炎調(diào)方可能通過抑制RhoA/ROCK 信號通路改善AP 大鼠炎癥反應(yīng)及腸屏障損傷。為了驗證該猜想，本研究在高劑量炎調(diào)方作用的基礎(chǔ)上再加上RhoA 激活劑LPA 來干預(yù)AP 大鼠，結(jié)果顯示，LPA 減弱了高劑量炎調(diào)方對AP大鼠炎癥反應(yīng)及腸屏障損傷的改善作用，證實了猜想的正確性。

綜上所述，炎調(diào)方可能通過抑制RhoA/ROCK 信號通路改善AP 大鼠炎癥反應(yīng)及腸屏障損傷。炎調(diào)方改善AP大鼠炎癥反應(yīng)及腸屏障損傷的機(jī)制較為復(fù)雜，具體通過RhoA/ROCK 信號通路下游的哪些蛋白來發(fā)揮作用有待后續(xù)實驗進(jìn)一步深入探討。