李冠勝 吳 倩 張 瑾 王田田 鄧揚(yáng)嘉 孫小平

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400011）

重癥肺炎是一種嚴(yán)重的感染性疾病，其進(jìn)展迅速，死亡率達(dá)30%～50%。近年來(lái)，在重癥肺炎病程中早期干預(yù)腸道功能，實(shí)行“肺腸同治”［1］的理念，越來(lái)越被臨床重視。治療危重型新冠病毒肺炎積累的經(jīng)驗(yàn)顯示，早期使用含大黃的中藥方劑“肺腸同治”可降低促炎因子水平，減輕肺損傷，提高患者氧合指數(shù)［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸中表面活性蛋白-A（SP-A）與肺中SP-A基因序列完全相同［4］，兩器官具有相似的SP-A 蛋白表達(dá)。另一項(xiàng)研究表明肺與大腸在信號(hào)通路、黏膜免疫效應(yīng)上具有相關(guān)性［5］。上述研究均證實(shí)肺與大腸有相似或相同的生理病理調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)肺腸同治、宣肺通腑的中醫(yī)治療原則，以瓜蔞大黃湯對(duì)重癥肺炎大鼠肺、腸組織中SP-A 的影響為切入點(diǎn)，探討瓜蔞大黃湯對(duì)肺腸組織損傷的影響及其可能機(jī)制，為治療重癥肺炎提供新的理論和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量180～200 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。分籠飼養(yǎng)于恒溫（25 ℃）、恒濕（40%～70%）房間內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)備案審批（審批號(hào)：20220228S0601230）。

1.2 病原菌

肺炎克雷伯桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC700603）由重慶市中醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室提供。將肺炎克雷伯桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于羊血瓊脂糖平板上，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)菌。根據(jù)比濁法，用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋成含菌量400個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏幕鞈乙簜溆谩?/p>

1.3 試藥與儀器

瓜蔞大黃湯，組成：瓜蔞皮30 g，瓜蔞子30 g，生大黃10 g。藥材加水300 mL 煎煮至100 mL，生藥濃度0.7 g/L，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的人與動(dòng)物體型系數(shù)折算的中藥劑量稀釋備用。大鼠降鈣素原（PCT）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、大鼠SP-A 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自江萊生物公司；兔抗大鼠SP-A、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體以及內(nèi)參GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；山羊抗兔二抗購(gòu)于碧云天生物公司；免疫熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Varioskan-LUX）ThermoFisher；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、Trans-Blot轉(zhuǎn)膜裝置、電泳儀，Bio-Rad；多功能酶標(biāo)儀，Thermo Fisher；Tannon-4200 凝膠成像系統(tǒng)；共聚焦顯微鏡Leica：TCS SP8。

1.4 分組與造模

大鼠分籠飼養(yǎng)于恒溫（25 ℃）房間內(nèi)，光照和黑暗各12 h 交替，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水。隨機(jī)選取10只大鼠為空白組，70只構(gòu)建重癥肺炎模型組。隨機(jī)選取其中10只作為模型組，剩余60只隨機(jī)平均分為6組，隨機(jī)選取3組作為中藥灌腸24、48、72 h組。參考盧偉波等［6］關(guān)于重癥肺炎大鼠模型建立方法，將大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g 麻醉，切開(kāi)頸部皮膚，暴露上段氣管，用1 mL 注射器刺破氣管，造模組注入含菌量為400 個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏姆窝卓死撞畻U菌混懸液0.35 mL，對(duì)照組以相同方法注入0.35 mL的無(wú)菌生理鹽水。接種完后將大鼠先后保持直立位和倒立位各約2 min，使菌液均勻分布于雙肺各個(gè)肺葉。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：注入細(xì)菌72 h 后大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呆滯等意識(shí)障礙表現(xiàn)，同時(shí)呼吸急促（可見(jiàn)雙側(cè)胸廓急速運(yùn)動(dòng)）、可聞及痰鳴、毛發(fā)干枯，其口唇及四爪皮膚發(fā)紺；血?dú)夥治鍪镜脱跹Y（SaO2＜90%、動(dòng)脈血氧分壓≤60 mmHg，1 mmHg ≈0.133 kPa）；胸部X 線檢查出現(xiàn)多個(gè)肺葉彌漫性滲出影。

1.5 干預(yù)方法

造模成功后中藥組在6、18、30、42、54、66 h予以中藥湯劑，按1 mL/100 g 灌腸各1 次，鹽水灌腸組則在相同時(shí)間點(diǎn)予以1 mL/100 g的生理鹽水灌腸各1次。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

每組動(dòng)物分別于灌腸后24、48、72 h給予腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g 麻醉，于腹主動(dòng)脈取血后處死。打開(kāi)胸腔，分離出氣管及肺組織，取右肺中葉肺組織（約2 cm）3 塊和肛門(mén)上5 cm 左右處結(jié)腸組織（約2 cm）3 塊，其中一塊以10%甲醛固定，用于HE 染色，另一塊組織OCT 包埋，-70 ℃保存，用于免疫熒光染色，第3 塊組織PBS 漂洗1～2 min，-70 ℃保存，制備組織勻漿。對(duì)照組大鼠及模型組大鼠于建模成功后同時(shí)處死，取標(biāo)本，方法同上。

1.6.1 ELISA檢測(cè)血清中C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）、SP-A 含量 操作按照ELISA 試劑盒步驟和要求進(jìn)行。

1.6.2 Western bloting 檢測(cè)SP-A、TNF-α 蛋白 取出制備好的肺、腸組織勻漿，提取蛋白，定量并配置好后加入膠孔中進(jìn)行電泳。在封閉前進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，加入一抗中4 ℃過(guò)夜。第二日洗膜，加二抗，最后曝光。

1.6.3 病理檢測(cè) 分別將各組中肺、結(jié)腸組織用甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察病理變化情況。

1.6.4 腸組織病理評(píng)分 參照Nadler 標(biāo)準(zhǔn)［7］，0 分：腸道絨毛及上皮完整，組織結(jié)構(gòu)正常。1 分：輕微黏膜下或固有層腫脹分離。2 分：中度黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫。3 分：重度黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫，局部絨毛脫落。4分：腸絨毛消失伴腸壞死。

1.6.5 肺組織病理評(píng)分 參照Szapiel 標(biāo)準(zhǔn)［8］，0 分：無(wú)肺泡炎。1 分：輕度肺泡炎，肺泡隔因細(xì)胞浸潤(rùn)增寬，病變范圍局限在全肺的20%以下。2 分：病變范圍占全肺的20%～50%。3 分：重度肺泡炎，呈彌漫性分布，病變范圍大于50%。

1.6.6 免疫熒光檢測(cè) 分別將各組中肺、結(jié)腸組織用OCT 包埋，切片，冰丙酮固定，血清封閉，一抗孵育，二抗染色后共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料正態(tài)分布檢驗(yàn)采用Komlogorov-Smirnov Normality，符合正態(tài)分布以（±s）表示，方差齊者兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布用M（QR）方式表達(dá)，方差不齊者采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組腸組織、肺組織病理變化比較

見(jiàn)圖1、表1。腸組織HE 染色：鹽水灌腸組各時(shí)間段病理?yè)p傷重于中藥灌腸組，各組間病理評(píng)分比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；中藥灌腸組組間比較，24 h 組、48 h 組組間損傷評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），72 h 組損傷評(píng)分升高，與前兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。肺組織HE 染色：鹽水組與中藥灌腸組各時(shí)間點(diǎn)比較，病理?yè)p傷無(wú)明顯差別，病理評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠腸組織和肺組織病理評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠腸組織和肺組織病理評(píng)分比較（分，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與本組24 h 比較，△P ＜0.05；與本組48 h比較，▲P ＜0.05；與鹽水灌腸組同時(shí)期比較，#P ＜0.05 。下同。

肺組織0.67±0.52 2.50±0.55 2.50±0.55 2.67±0.52 2.67±0.52 2.50±0.55 2.67±0.52 2.83±0.41組 別空白組模型組鹽水灌腸組n中藥灌腸組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 10 10 10 10 10 10 10 10腸組織0.50±0.55 0.67±0.52 1.50±1.05 2.83±1.17 3.50±0.55 1.33±1.03#1.50±1.05#2.33±1.03△▲#

圖1 各組大鼠肺腸組織（HE染色，10倍）

2.2 各組大鼠血清CRP、PCT、SP-A水平比較

見(jiàn)表2。CRP：與空白組比較，模型組CRP 升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽水灌腸組中CRP 各時(shí)間段呈上升趨勢(shì)（P＜0.05）；中藥灌腸組中，各時(shí)間段血清CRP 無(wú)明顯變化（P＞0.05）；72 h 組組間比較，中藥灌腸組血清CRP 低于鹽水灌腸組（P＜0.05）。PCT：與空白組比較，模型組PCT 升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽水灌腸組中各時(shí)間組血清PCT 呈上升趨勢(shì)（P＜0.05）；中藥灌腸組各時(shí)間段血清PCT 無(wú)明顯變化（P＞0.05）；24、48、72 h 組各組組間比較，中藥灌腸組血清PCT 低于鹽水灌腸組（P＜0.05）。SP-A：與空白組比較，模型組SP-A 升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽水灌腸組中各時(shí)間段血清SP-A 呈上升趨勢(shì)（P＜0.05）；中藥灌腸組在48、72 h血清SP-A升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清CRP、PCT、SPA水平比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠血清CRP、PCT、SPA水平比較（n=10，±s）

組 別空白組模型組鹽水灌腸組中藥灌腸組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h CRP（ng/mL）77.83±28.71*316.43±24.41 520.69±62.32*670.08±22.58△*822.65±79.60△▲*454.02±59.24 570.08±77.81 455.99±76.21#PCT（pg/mL）23.74±14.23*75.39±14.96 147.36±19.07*161.71±27.80△*222.65±20.41△▲*77.31±8.40#87.74±16.73#112.89±5.70#SP-A（pg/mL）16.25±6.10*28.76±3.68 51.05±10.86*57.91±8.00△*65.04±13.50△▲*34.39±11.12 51.25±6.42#*61.71±20.33#*

2.3 各組大鼠腸組織SP-A表達(dá)比較

見(jiàn)圖2、表3。腸組織免疫熒光可見(jiàn)：與模型組比較，鹽水灌腸組各時(shí)間段腸組織SP-A 表達(dá)變化不明顯，中藥灌腸組各時(shí)間段腸組織SP-A 表達(dá)升高。Western blotting 結(jié)果顯示：與模型組比較，鹽水灌腸組24、48 h 腸組織SP-A 表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），72 h腸組織SP-A 明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，中藥灌腸組各時(shí)間段腸組織SP-A表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腸組織和肺組織SP-A的灰度值比較（±s）

表3 各組大鼠腸組織和肺組織SP-A的灰度值比較（±s）

組 別空白組模型組鹽水灌腸組n中藥灌腸組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 10 10 10 10 10 10 10 10腸組織SP-A 0.34±0.05 0.54±0.16 0.57±0.24 0.54±0.24 0.33±0.09*0.64±0.12*0.69±0.03*0.64±0.20*肺組織SP-A 0.50±0.10 0.36±0.07 0.41±0.08 0.34±0.08 0.32±0.10 0.84±0.11*0.90±0.11*0.96±0.27*

圖2 各組大鼠腸組織SP-A表達(dá)

2.4 各組大鼠肺組織SP-A的表達(dá)比較

見(jiàn)圖3、表3。肺組織免疫熒光可見(jiàn)：與模型組比較，鹽水灌腸組中各時(shí)間段肺組織SP-A表達(dá)變化不明顯；中藥灌腸組各時(shí)間段肺組織SP-A 表達(dá)升高。Western blotting 結(jié)果示：與模型組比較，鹽水灌腸組各時(shí)間段SP-A 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中藥灌腸組各時(shí)間段SP-A表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠肺組織SP-A的表達(dá)

2.5 各組大鼠肺、腸組織中TNF-α的表達(dá)比較

見(jiàn)圖4、表4。Western blotting 結(jié)果示：與空白組比較，模型組肺和腸組織TNF-α 均升高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽水灌腸組中肺組織TNF-α 在48 h 和72 h表達(dá)均升高（P＜0.05），而腸組織TNF-α 在24、48、72 h表達(dá)均升高（P＜0.05）；中藥灌腸組中肺組織TNF-α在72 h 下降（P＜0.05），而腸組織TNF-α 在48、72 h 均下降（P＜0.05）。

表4 各組大鼠肺和腸組織TNF-α的灰度值比較（±s）

表4 各組大鼠肺和腸組織TNF-α的灰度值比較（±s）

組 別空白組模型組鹽水灌腸組n中藥灌腸組24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 10 10 10 10 10 10 10 10肺組織TNF-α 0.37±0.05*0.53±0.10 0.61±0.35 0.73±0.55*0.80±0.08*0.91±0.08 0.68±0.17 0.36±0.15*腸組織TNF-α 0.67±0.17*0.94±0.20 1.61±0.30*2.10±0.10*2.07±0.20*0.78±0.13 0.48±0.06*0.24±0.12*

圖4 各組大鼠肺腸組織中TNF-α表達(dá)

3 討 論

重癥肺炎發(fā)病率和死亡率高，西醫(yī)治療主要以抗感染、呼吸機(jī)輔助支持等方法為主，但在疾病后期常常效果不佳。中醫(yī)方面將重癥肺炎歸為“暴喘”范疇，由于呼吸機(jī)使用影響正常進(jìn)食通道，且胃腸功能處于衰竭狀態(tài)，中藥湯劑的口服及吸收被嚴(yán)重阻礙。中藥湯劑的灌腸不受呼吸機(jī)影響，且灌腸可以潤(rùn)腸通便，有利于胃腸功能的恢復(fù)；同時(shí)，中醫(yī)有“肺與大腸相表里”的藏象學(xué)說(shuō)，故我們選用中藥灌腸的方法通過(guò)肺腸同治的途徑達(dá)到治療重癥肺炎的目的。本研究所選用瓜蔞大黃湯中瓜蔞皮與瓜蔞子有寬胸散結(jié)、滌痰潤(rùn)肺之功，瓜蔞子還兼有潤(rùn)腸通便之效；大黃瀉下通腑、涼血解毒；作用一宣一降，相輔相成。不僅在傳統(tǒng)的藥性上有協(xié)同作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證實(shí)瓜蔞和大黃有協(xié)同作用，瓜蔞皮提取物還有抗血栓、抗氧化作用［9-10］，大黃具有廣譜抗菌的效果［11］。

本研究在成功建立大鼠重癥肺炎模型后，對(duì)肺及結(jié)腸組織進(jìn)行病理染色，發(fā)現(xiàn)肺組織損傷重于結(jié)腸組織，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞腫脹、壞死、出血。而結(jié)腸組織僅見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯出血和壞死，由此推斷在重癥肺炎發(fā)生時(shí)，肺腸組織的損傷是不同步的。本實(shí)驗(yàn)給予瓜蔞大黃湯中藥灌腸后，炎癥指標(biāo)CRP 及PCT 高峰指標(biāo)延后，而鹽水灌腸組在24 h 即達(dá)高峰，推測(cè)中藥灌腸可在早期抑制炎癥反應(yīng)。SP-A 是一種免疫調(diào)節(jié)分子，在肺部感染時(shí)可與多種微生物結(jié)合，易被巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬，利于病原體的清除［12］；在腸道中，SP-A 具有類(lèi)似的作用［13］。研究證實(shí)重癥肺炎患者血清SP-A升高，且隨著病情進(jìn)展，肺、腸組織內(nèi)的SP-A 的表達(dá)可不同程度的降低［14］。本研究給予重癥肺炎大鼠中藥灌腸后，肺、腸組織SP-A 的表達(dá)均有升高，故推測(cè)瓜蔞大黃湯能在重癥肺炎發(fā)生后減輕組織損傷。腸組織SP-A 表達(dá)在24～72h 持續(xù)升高，其損傷明顯輕于肺組織，肺組織SP-A 雖亦有升高，但對(duì)病理影響不明顯，其原因可能系灌腸中藥直接作用于大腸黏膜，透過(guò)黏膜經(jīng)靜脈吸收，避免了首過(guò)效應(yīng)對(duì)藥物的損失，對(duì)腸組織作用強(qiáng)于肺組織。故本研究揭示瓜蔞大黃湯對(duì)重癥肺炎大鼠肺腸同治的機(jī)制之一是通過(guò)上調(diào)肺腸SP-A 發(fā)揮其免疫作用，以減輕炎性反應(yīng)。近年來(lái)研究［15］顯示，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路是重癥肺炎發(fā)病機(jī)制的核心通路之一，當(dāng)NF-κB 被激活后可啟動(dòng)細(xì)胞免疫，炎癥因子TNF-α 產(chǎn)生增加。亦有研究［16］證實(shí)TNF-α 在肺和腸組織的免疫調(diào)節(jié)中與SP-A 有一定聯(lián)系，SP-A 可通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路減少TNF-α 生成。本實(shí)驗(yàn)中給予中藥灌腸后，肺、腸組織TNF-α 表達(dá)有下降，而SP-A 表達(dá)升高，因此我們推測(cè)瓜蔞大黃湯通過(guò)上調(diào)SP-A，抑制NF-κB 介導(dǎo)的TNF-α表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，在重癥肺炎發(fā)生時(shí)使用瓜蔞大黃湯灌腸可通過(guò)上調(diào)肺、腸組織SP-A 的表達(dá)，從而降低炎性因子TNF-α 的表達(dá)，起到保護(hù)大鼠肺、腸組織的作用，從而減輕全身炎癥反應(yīng)，可對(duì)臨床治療重癥肺炎提供新的思路和一定的基礎(chǔ)支持。但限于本研究樣本量較小，且僅在動(dòng)物層面實(shí)施研究，方法和結(jié)論有局限性，故更多樣本量的動(dòng)物層面的研究及多種中藥劑型和劑量調(diào)整的臨床試驗(yàn)是我們未來(lái)的研究方向和目標(biāo)。