楊嘉譽 馬小涵 張 蘊 李鉆芳 林如輝

（1.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122；2.福建技術(shù)師范學院，福建 福清 350300；3.福建中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建 福州 350122）

腦卒中是腦血管阻塞引發(fā)的腦組織及機體的缺血缺氧性損傷，是造成卒中后認知障礙（PSCI）的主要原因［1］。據(jù)報道，約57%的患者在卒中后第一年患有認知障礙，出現(xiàn)執(zhí)行、反應速度、記憶力和視覺空間的功能受損，學習記憶障礙作為認知損害的主要癥狀，若未及時給予干預治療，有可能進展為癡呆，嚴重者甚至導致死亡［2］。海馬是學習記憶的關(guān)鍵，研究表明，調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性對治療神經(jīng)退行性病變?nèi)鏟SCI 有著重要地位［3］。

根據(jù)PSCI 臨床選穴規(guī)律的數(shù)據(jù)挖掘，神庭、百會作為使用頻率和支持度最高的穴位組合［4］，常用于PSCI 的臨床治療。團隊前期研究亦發(fā)現(xiàn)電針神庭、百會穴可以改善卒中大鼠的神經(jīng)行為學變化，使突觸后膜的突觸小泡數(shù)量增加、突觸后致密物增厚［5］，但具體機制仍有待考究?；谀Ｐ瓦m配度，本研究采用制備大腦中動脈閉塞再灌注（MCAO/R）大鼠模型，從行為學、腦梗死灶面積、病理形態(tài)、突觸可塑性相關(guān)的指標表達情況，以期闡明電針神庭、百會穴調(diào)節(jié)突觸可塑性來改善MCAO/R 大鼠學習記憶的作用機制，為電針神庭、百會治療PSCI提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24 只雄性Sprague-Dawley 大鼠，SPF 級，體質(zhì)量280～300 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證編號：SCXK（滬）2017-0005。動物于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（閩）2019-0007。室內(nèi)恒溫（22 ℃）恒濕，飲水、進食自由，采用12 h 晝夜循環(huán)照明系統(tǒng)，適應喂食1 周。所有實驗都遵循動物實驗的倫理標準（倫理認同：2020078）。

1.2 儀器及試劑

7.0T小動物核磁共振儀（Bio Spec 70/20 USR，德國BRUKER 公司），新物體識別測試系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），華佗牌SDZ-V 型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。Western blotting 系統(tǒng)（美國BIORAD 公司），蘇木素-伊紅（HE）試劑盒（索萊寶G1120），ARC 抗體（批號16290-1-AP，Proteintech 公司），GluR2 抗體（批號11994-1-AP，Proteintech 公司），NMDAR2B 抗體（批號21920-1-AP，Proteintech 公司），GAPDH 抗體（批號60004-1-Ig，Proteintech 公司），BCA定量試劑盒（Thermo Fisher23225），0.5 寸針灸針（直徑0.25 mm，長度13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 模型制備

參照Longa［6］法制備左側(cè)MCAO/R 大鼠模型。造模前大鼠禁食不禁水8 h，稱重后隨機分為4 組，術(shù)中面罩吸入異氟烷持續(xù)麻醉。備皮，左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈輕柔鈍性分離，頸總動脈、頸外動脈用縫合線結(jié)扎，遠端頸內(nèi)動脈用微動脈夾夾閉。在左側(cè)頸總動脈分叉處，用微血管剪剪一切口，將線栓輕柔插入到頸內(nèi)動脈中，至輕微有阻力長度約18.0 mm 即止。常規(guī)縫合傷口，碘伏消毒。1.5 h 后，拔出線栓約10.0 mm 實現(xiàn)再灌注，腹腔注射青霉素鈉以消炎。過程中注意保持大鼠體溫，直至清醒并重新恢復活動。除插入線栓，假手術(shù)組其余操作同模型組。

1.4 干預方法

電針組：參考《實驗針灸學》［7］取大鼠神庭穴和百會穴行電針介入干預，頻率2/10 Hz，疏密波，刺激強度1 mA，可見針體輕微晃動，每日1 次，每次30 min，連續(xù)介入干預7 d。非穴組：雙側(cè)脅下非經(jīng)非穴（髂嵴垂直向上10、15 mm），除穴位外其余條件同電針組。模型組和假手術(shù)組不予治療，僅同等條件抓取。

1.5 觀察項目

1.5.1 神經(jīng)功能評分 在造模后2 h、7 d 記錄，用Zea longa 評分法評估大鼠的神經(jīng)損傷程度。0 分：無神經(jīng)功能缺損，活動正常。1 分：提尾時對側(cè)前腳彎曲，不完全伸直。2 分：行走時向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)。3 分：走路時傾倒在對面。4 分：不能自發(fā)行走，意識喪失。造模2 h后，去除0分、4分動物。

1.5.2 新物體識別實驗 測試前每天撫摸實驗大鼠1 min，降低大鼠對測試者的不適感。試驗前24 h，將動物放入試驗室，使其適應試驗環(huán)境。將A 和B 兩個物品放置在測試箱內(nèi)壁同側(cè)的左右端，大鼠背對著兩個物品放入場中，大鼠的鼻子前端距離兩個物品的長度必須相同。大鼠放置后立即開啟視頻設備，記錄大鼠的行為軌跡以判斷其對A 和B 物品的學習記憶情況，為避免干擾大鼠的行為，實驗人員立即離開測試室。10 min 的學習時間結(jié)束后，立即將大鼠放回原始飼養(yǎng)籠中，記錄過程包括大鼠鼻子或嘴接觸到物品的次數(shù)和大鼠在距離物品2～3 cm 范圍內(nèi)的探究時間。間隔24 h 后，測試箱B 物品被相同顏色的不同形狀或不同顏色的同形狀的D物品所取代，測試方法同前，觀察5 min，同樣視頻設備記錄大鼠行為軌跡和探究情況，主要觀察大鼠對D 物體的探索。SuperMaze 的動物軌跡追蹤系統(tǒng)記錄了各組大鼠對不同物體的搜索次數(shù)和行為軌跡。識別指數(shù)=新物體頭部探究次數(shù)÷（舊物體頭部探究次數(shù)+新物體頭部探究次數(shù)）×100%。

1.5.3 小動物核磁共振掃描 干預后，使用7.0T 小動物MRI裝置掃描。異氟烷吸入麻醉、俯臥位定位掃描和T2加權(quán)成像掃描。T2WI是弛豫增強快速采集（RARE）序列、重復時間TR 2 500 m、回波時間TE 33 ms、厚度0.8 mm、層間隔0 mm、視野（FOV）30 mm×30 mm，矩陣256×256、翻轉(zhuǎn)角度（FA）180 °，掃描時間5 min 23 s。梗死灶面積=各層面梗死區(qū)域面積之和÷各層面腦片面積之和×100%。在1HMRS 檢驗中，經(jīng)抑水、勻場后，用點分辨水譜脈沖序列PRESS：TR=1 000 ms，TE=135 ms，Scan time=8 min 32 s 獲取波譜。使用Topspin 5.0軟件分析每個代謝物含量，Cr用作計算其他代謝物的相對含量的內(nèi)部標準。N-乙酰天冬氨酸（NAA）、肌酸（Cr）和谷氨酸（Glu）的化學位移分別為2.02 ppm、3.02 ppm和2.2 ppm。

1.5.4 大鼠腦組織觀察 心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛溶液各150 mL，在4%多聚甲醛固定溶液中靜置48 h以充分固定完整腦組織，酒精梯度脫水，石蠟包埋后冠狀切片4～5 μm。HE 染色后使用中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5.5 腦組織ARC/GluR2/NMDAR2B 檢測 應用Western blotting檢測大鼠腦組織ARC/GluR2/NMDAR2B。取大鼠缺血側(cè)海馬，按照細胞組織蛋白提取試劑盒的指示，將裂解液加入組織后，離心提取蛋白樣品，采用BCA 法檢測蛋白濃度。SDS 凝膠用于蛋白分離，每孔5 μL，然后進行電泳及轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉配置封閉液（室溫1.5 h）。加入一抗（1∶1 500），在4 ℃下孵育過夜。根據(jù)一抗體種屬選擇二抗，在室溫下孵育2 h，PVDF膜清洗后ECL顯影。使用圖像Image la 軟件分析條帶的灰度值。目標蛋白水平的相對值=目標蛋白的灰度值/對應的內(nèi)參條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

見表1。根據(jù)Zea-Longa 評分標準對各組大鼠進行神經(jīng)功能評定，造模后2 h與假手術(shù)組相比，模型組、電針組及非穴組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，組間差異顯著（P＜0.01），提示MCAO 大鼠模型造模成功。干預治療7 d 后，各組評分均降低，但電針組評分低于模型組及非穴組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（分，±s）

注：與本組造模后2 h 比較，*P ＜0.05；與假手術(shù)組同時期比較，△P ＜0.05；與電針組同時期比較，▲P ＜0.05。下同。

干預7 d 0 2.00±0.89△▲0.83±0.41*△1.83±0.75△▲組 別假手術(shù)組模型組電針組非穴組n6 6 6 6造模后2 h 0 2.16±0.75 2.00±0.63△2.16±0.75△

2.2 新物體識別實驗分析

見圖1。干預后7 d 后，模型組大鼠的新物體識別指數(shù)（18.17±0.07）%明顯低于假手術(shù)組（60.50±0.26）%（P＜0.001），而電針組大鼠的新物體識別指數(shù)（55.17±0.25）%明顯高于模型組的（18.17±0.07）%及非穴組的（26.83±0.05）%（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠新物體識別軌跡圖

2.3 各組大鼠腦梗死灶面積的比較

見圖2。觀察各組大鼠干預后海馬區(qū)T2WI 加權(quán)成像掃描圖，假手術(shù)組未觀察到腦梗死區(qū)，模型組、電針組、非穴組左側(cè)均出現(xiàn)明顯梗死灶，梗死灶面積占比分別為（15.35±0.04）%、（2.54±0.01）%、（7.23±0.03）%，與假手術(shù)組比較差異明顯（P＜0.01），且電針組大鼠梗死面積明顯小于模型組和非穴組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠干預后T2WI加權(quán)成像掃描圖

2.4 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)代謝物1HMRS分析

見圖3、表2。電針組與模型組及非穴組相比，NAA/Cr 比值顯著增加（P＜0.001）、Glu/Cr 比值顯著降低（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠1HMRS檢測圖

表2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)代謝物1HMRS分析比較（±s）

表2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)代謝物1HMRS分析比較（±s）

組 別假手術(shù)組模型組電針組非穴組n6 6 6 6 NAA/Cr 1.84±0.07 1.12±0.02△▲1.61±0.07△1.23±0.06△▲Glu/Cr 0.39±0.09 0.73±0.04△▲0.46±0.09△0.66±0.03△▲

2.5 各組大鼠缺血側(cè)海馬CA1病理觀察

見圖4。HE 染色觀察各組大鼠海馬CA1 區(qū)組織病理學形態(tài)?？梢娂偈中g(shù)組細胞排列緊密，間隙正常；細胞核形態(tài)清晰完整，細胞邊界清晰。模型組及非穴組細胞排列松散、雜亂，組織水腫；細胞核輪廓模糊，出現(xiàn)核固縮，細胞水腫，邊界不清晰。電針組細胞排列較為緊密，組織輕度水腫，間質(zhì)疏松不明顯；細胞核形態(tài)較為清晰，細胞邊界尚清晰、完整。

圖4 各組大鼠腦組織病理觀察（HE染色，400倍）

2.6 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)ARC/GluR2/NMDAR2B表達

見圖5、表3。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠ARC 及GluR2 表達顯著降低（P＜0.01 或P＜0.001），NMDAR2B 表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組和非穴組相比較，電針組大鼠ARC 受體及GluR2 表達均升高（P＜0.05或P＜0.01），NMDAR2B表達顯著降低（P＜0.01）。

圖5 各組大鼠缺血側(cè)海馬NMDAR2B、GluR2、ARC及GAPDH蛋白印跡圖

表3 各組大鼠ARC、GluR2、NMDAR2B蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠ARC、GluR2、NMDAR2B蛋白表達比較（±s）

組 別假手術(shù)組模型組電針組非穴組n3 3 3 3 ARC 1.00±0.13 0.65±0.11△▲0.90±0.07 0.63±0.10△▲GluR2 1.00±0.07 0.66±0.06△▲0.89±0.12 0.67±0.17△▲NMDAR2B 1.00±0.15 1.39±0.13△▲1.10±0.11 1.39±0.09△▲

3 討 論

PSCI 在我國有較高的發(fā)病率［4］，主要表現(xiàn)為學習記憶障礙。百會為督脈、足太陽、手足少陽和足厥陰之會，是百脈所匯、陽氣所聚之處。神庭屬督脈，為督脈、足太陽、陽明之會，神志所在，神處其中則靈，靈則應，應則保身。百會穴和神庭穴皆為督脈要穴，兩穴共用，能起到形神共調(diào)的作用，自古以來就被用于治療認知相關(guān)疾?。?］。多項研究表明，針刺百會、神庭穴能有效改善腦卒中后認知功能障礙［9-10］，但具體機制尚不明確。

團隊前期研究發(fā)現(xiàn)電針神庭、百會穴可以改善MCAO/R 大鼠神經(jīng)行為學，提高水迷宮穿越平臺次數(shù)、降低逃避潛伏期［11］。本實驗采用新物體識別［12］實驗評定各組大鼠的學習記憶能力，在大鼠自發(fā)探索行為的基礎上，避免剝奪食物或水淹的動機下進行學習。結(jié)果顯示電針組較模型組及非穴組新物體識別指數(shù)升高，提示電針神庭、百會可以提高MCAO/R 大鼠的學習記憶能力。

本實驗中采用活體小動物核磁成像，客觀、動態(tài)地觀察各組大鼠的腦梗死面積變化，在降低動物成本的同時，達到活體影像和離體檢測相結(jié)合的目的。我們觀察到，電針組大鼠較模型組及非穴組腦梗死面積明顯減小，缺血側(cè)海馬水腫減輕、細胞數(shù)量增加，提示電針神庭、百會可以在腦缺血再灌注時發(fā)揮腦保護作用。N-乙酰天冬氨酸（NAA）標志著神經(jīng)元的數(shù)量和活力，與卒中后神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)［13］，NAA/Cr比值的下降提示突觸完整性被破壞［14］?；钚韵嚓P(guān)的細胞骨架蛋白（ARC）為神經(jīng)元活動的標記物，ARC 蛋白的增加影響微管相關(guān)蛋白復合物的聚合，通過與神經(jīng)元骨架的相互作用影響神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的可塑性［15］。本研究中，在體1HMRS檢測顯示：電針組NAA/Cr比值顯著增加；離體Western blotting 檢測：電針組細胞骨架蛋白ARC 表達升高，提示電針神庭、百會穴可以通過影響神經(jīng)元突觸形態(tài)可塑性，激發(fā)神經(jīng)元活力，改善腦區(qū)功能。結(jié)合前期發(fā)現(xiàn)，電針干預能使突觸后膜的突觸小泡數(shù)量增加、突觸后致密物增厚［5］，我們進一步將重點聚焦于損傷側(cè)海馬的突觸可塑性相關(guān)指標的檢測。

突觸是神經(jīng)元信息傳遞的特殊結(jié)構(gòu)，突觸的形態(tài)可塑性和功能可塑性被認為是學習記憶的基礎。研究發(fā)現(xiàn)，早期突觸可塑性障礙是腦卒中后認知功能受損的主要原因之一［3，16］。當腦組織發(fā)生缺血缺氧性損傷時，過量Glu在突觸間隙累積導致突觸后膜大量Glu受體激活，胞外鈣離子內(nèi)流，引發(fā)細胞興奮性神經(jīng)毒性［17］。研究發(fā)現(xiàn)，注意力缺陷患兒治療后腦區(qū)Glu/Cr降低，提示其神經(jīng)可塑性改善［18］。本研究中，電針組在1HMRS檢測中Glu/Cr比值顯著降低，提示電針神庭、百會穴可以降低卒中大鼠海馬突觸后膜過量累積的Glu，改善神經(jīng)突觸可塑性。Glu 受體中AMPA 和NMDAR 受體在突觸后膜的動態(tài)表達與長時程增強（LTP）、長時程抑制（LTD）的誘發(fā)和維持有關(guān)，并且對急性突觸重塑具有重要作用［19］。GluR2 亞基是AMPAR 受體中決定鈣離子通透性的關(guān)鍵分子，能維持胞漿中鈣離子濃度在正常范圍，腦缺血性損傷會引起GluR2 亞基表達降低［20］。NMDA受體阻斷劑可以減輕MCAO/R大鼠的神經(jīng)功能損傷情況［21］，MK801 拮抗劑抑制大鼠海馬NMDAR 的功能時會顯著降低大鼠八臂迷宮的學習和記憶能力［22］。NR2B 亞基作為NMDA 受體主要的調(diào)節(jié)單位，在缺血再灌注后期NR2B磷酸化水平增高［23］，影響突觸功能可塑性。Lu 等［24］在新生小鼠腦缺血缺氧模型中發(fā)現(xiàn)，突觸后NR2B 蛋白復合物的形成與缺血后神經(jīng)功能恢復有關(guān)。本實驗中電針組大鼠缺血側(cè)海馬GluR2顯著增高、NMDAR2B顯著降低，提示電針神庭、百會可能通過調(diào)節(jié)位于突觸后膜的谷氨酸受體GluR2、NMDAR2B 來調(diào)節(jié)鈣離子通透性，改善急性期突觸后膜谷氨酸的過度積累，平衡LTP/LTD 的誘發(fā)與維持，進而提高缺血再灌注大鼠的學習記憶能力。

綜上，電針神庭、百會穴能夠改善MCAO/R 大鼠的神經(jīng)缺損情況、提高學習記憶能力，降低缺血側(cè)梗死面積、改善病理形態(tài)，提高神經(jīng)元興奮性、降低膜后谷氨酸累積，其機制可能與促進MCAO/R大鼠海馬區(qū)ARC、GluR2，抑制NMDAR2B 的表達，進而改善卒中后突觸可塑性損傷有關(guān)。本實驗亦存在不足之處：未能進行膜片鉗及神經(jīng)電生理實驗檢測突觸后膜LTP、LTD 的動態(tài)表達；未進行鈣成像檢測缺血性腦損傷后鈣離子濃度變化，以后的研究中將進一步探索。