趙 媛 劉 登 施 榮△

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201204；2.上海中醫(yī)藥大學，上海 201204）

膿毒癥是機體對感染失控的炎癥反應導致器官功能障礙的臨床綜合征，住院率及病死率極高［1］。膿毒癥易引發(fā)肺損傷，早期表現(xiàn)為肺泡毛細血管內皮細胞損傷，通透性增高，肺泡內滲出增加，影響氣體交換，導致急性肺損傷（ALI），甚至進展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。細胞焦亡是一種區(qū)別于凋亡、自噬、壞死的程序性細胞死亡新形式，其特征為依賴于半胱天冬酶-1（Caspase-1），并伴有大量促炎癥因子的釋放。研究證明細胞焦亡在膿毒癥進程中發(fā)揮了重要作用［2］，焦亡途徑最終釋放白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-18（IL-18）等炎癥因子，導致炎癥級聯(lián)放大反應［3］。炎癥反應是膿毒癥相關性肺損傷發(fā)病機制的關鍵環(huán)節(jié)，與肺損傷的病理生理過程相關［4］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，犀角地黃湯加減方可減輕膿毒癥小鼠的肺損傷，但具體機制尚不清楚?；诮雇鲈谀摱景Y致ALI 中的核心作用，本實驗擬觀察犀角地黃湯加減方對膿毒癥小鼠肺組織焦亡相關蛋白、炎癥介質水平及病理切片等的影響，探討犀角地黃湯加減方減輕膿毒癥肺損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠30只，清潔級，雄性，體質量16～18 g，購自上海必凱科翼有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2018-0006。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物房，自然照明，溫度25 ℃，相對濕度50%，自由進食、飲水，環(huán)境保持清潔、安靜，通風良好。適應性飼養(yǎng)1 周。動物實驗符合上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院倫理規(guī)定（PZSHUTCM2211070005）。

1.2 試藥與儀器

犀角地黃湯加減方：犀角（水牛角代替）30 g，生地黃24 g，白芍12 g，牡丹皮9 g，麻黃12 g，杏仁30 g，石膏30 g，炙甘草15 g，葶藶子15 g，大棗20 g。中藥材購于上海中醫(yī)藥大學曙光醫(yī)院，經浸泡、煎煮、過濾及濃縮后分別制成低質量濃度（3.3 g/mL）、高質量濃度（6.6 g/mL）的濃縮液。Ac-YVAD-CMK（Batch：0647578-10，Cayman）；抗Caspase-1抗體（貨號AF1681，碧云天）、抗NF-κB（貨號AF5243，碧云天）；抗NLRP3（單克隆兔抗）（貨號AF2155，碧云天）、抗GSDMD（貨號66387-1-Ig，Proteintech）；IL-1β、IL-18ELISA 試劑盒（貨號EK201B/3-AW1、EK218-AW1，杭州聯(lián)科生物技術有限公司）。化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能，型號：4200SF）；多功能酶標儀（BioTek，型號：Synergy 2）；實時熒光定量系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技公司，型號：ABI SetpOnePlus）。

1.3 分組與給藥

30 只小鼠隨機分為假手術組、模型組、抑制劑組、中藥低劑量組和中藥高劑量組，每組6 只。抑制劑組在造模前30min 予AC-YVAD-CMK（Caspase-1 抑制劑）0.1 mL/100 μg 腹腔內注射。藥物組在造模前予犀角地黃湯加減方連續(xù)灌胃7 d，每日1 次，每次0.2 mL（中藥低劑量組為3.3 g/mL，高劑量組為6.6 g/mL）。對照組予同等劑量的生理鹽水灌胃。

1.4 造模方法

采用盲腸結扎穿孔術（CLP）制備膿毒癥小鼠模型。麻醉小鼠后，用75%乙醇消毒小鼠腹部，行腹正中線切口，暴露盲腸，在距離盲腸遠端約1/3 處采用3-0號縫線進行結扎，采用21G針頭貫通穿刺結扎的盲腸2 次，輕輕擠壓使少量腸內容物從穿刺孔溢出；將處理好的盲腸回納入腹腔，逐層縫合腹膜、肌層和外層。假手術組照常手術，但不進行盲腸結扎和穿孔。

1.5 標本采集與檢測

術后12 h眼球取血處死小鼠，將全血靜置后離心，留取血清。

1.5.1 ELISA 檢測血清IL-1β、IL-18 含量 實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.5.2 左側肺葉組織觀察 HE 染色，切片，光學顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學改變。

1.5.3 肺含水量檢測 麻醉后切開胸腔取下全肺，去除多余組織包膜以及心臟，用紗布擦凈表面水分與血漬，并用電子秤稱量肺濕重（W）。將濕肺放入80 ℃烤箱中烘烤48 h，以獲得干肺質量（D）并記錄，肺含水量=（WD）÷W×100%。

1.5.4 肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD、NLRP3 蛋白檢測 取肺組織加入RIPA 裂解液，勻漿60 s×2 次，于冰上裂解30 min，12 000 r/min 離心5 min，取上清，BCA試劑盒對蛋白濃度進行定量。上樣（80 μg蛋白），通過10%變性SDS-PAGE 分離蛋白質，轉PVDF 膜，5%脫脂牛奶于25 ℃封閉2 h，加入NLRP3（1∶500）、Caspase-1（1∶500）、Gasdermin D（1∶500）、NF-κB（1∶500）及GAPDH（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP 標記羊抗兔IgG 二抗（1∶500）室溫孵育2 h，顯影檢測免疫復合物，采用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內參。

1.5.5 肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD、NLRP 基因表達檢測 取肺組織，按Trizol 試劑盒提取組織總RNA。引物NLRP3，F(xiàn)：5′-GGCTGCTATCTGGAGGAA CTT-3′，R：5′-CATCTTCAGCAGCAGCCCTT-3′。Caspase-1，F(xiàn)：5′-ACTGACTGGGACCCTCAAGT-3′，R：5′-GCAAGACGTGTACGAGTGGT-3′。GSDMD，F(xiàn)：5′-GG CCCTACTGCCTTCTGAAC-3′ ，R：5′-TCCCATGCCTGACAACATCA-3′。NF-κB，F(xiàn)：5′-GACACGACAGAA TCCTCAGCATCC-3′，R：5′-CCACCAGCAGCAGCAGACATG-3′。β-Actin，F(xiàn)：5′-GCTCCTAGCACCATGAAGAT-3′ ，R：5′-GTGTAAAACGCAGCTCAGTA-3′ 。SYBR Green One-Step qRT-PCR 試劑混勻后置于實時熒光定量系統(tǒng)進行擴增反應，反應條件為50 ℃逆轉錄30 min，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火/延伸30 s，40個循環(huán)。以β-Actin作為內參，采用2-ΔΔCt法計算NF-κB、Caspase-1、GSDMD和NLRP3的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠血清IL-1β和IL-18水平比較

見表1。與假手術組比較，模型組血清IL-1β 和IL-18 水平均明顯增加，差異均具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組能夠下調血清中IL-1β和IL-18水平，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；中藥組IL-1β和IL-18水平顯著下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組IL-1β和IL-18水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05和P＜0.01）。

表1 各組小鼠血清IL-1β和IL-18水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組小鼠血清IL-1β和IL-18水平比較（pg/mL，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與中藥低劑量組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

IL-18 133.35±25.56 611.84±14.71 413.01±14.95**503.79±29.19**476.26±14.81**△△組 別假手術組模型組抑制劑組中藥低劑量組中藥高劑量組n6 6 6 6 6 IL-1β 126.49±10.15 421.86±13.96 226.26±25.43**319.75±34.49**250.44±27.62**△

2.2 各組小鼠肺組織HE染色比較

見圖1。可見對照組肺內的各級結構完整，無炎性細胞浸潤；模型組肺泡上皮細胞腫脹，肺間質及肺泡腔內大量炎性滲出，毛細血管明顯擴張和充血，微血栓形成；抑制劑組和中藥高、低劑量組的肺水腫、肺間質及肺泡出血滲出均減輕。

圖1 各組小鼠肺組織病理觀察（HE染色）

2.3 各組小鼠肺組織干/濕重比值比較

見表2。與假手術組相比，模型組肺組織肺干/濕重比值差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，抑制劑組、藥物組肺干/濕重比值差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。中藥高劑量組干/濕重比均值大于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺干/濕重比值比較（%，±s）

表2 各組小鼠肺干/濕重比值比較（%，±s）

組 別假手術組模型組抑制劑組中藥低劑量組中藥高劑量組n6 6 6 6 6干/濕重24.70±0.11 21.58±0.48 24.02±0.53**22.93±0.28**23.01±0.66**△

2.4 各組小鼠肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD 和NLRP3基因表達比較

見表3。與假手術組相比，模型組NF-κB、Caspase-1、GSDMD 和NLRP3 基因表達水平顯著上調，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組Caspase-1、GSDMD 基因表達水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），NF-κB 和NLRP3 表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。中藥低、高劑量組NFκB、Caspase-1、GSDMD和NLRP3基因表達水平均顯著下降，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組NF-κB、Caspase-1、GSDMD 和NLRP3 基因相對表達水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD和NLRP3基因相對表達量比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD和NLRP3基因相對表達量比較（±s）

組 別假手術組模型組抑制劑組中藥低劑量組中藥高劑量組n6 6 6 6 6 NF-κB 1.03±0.26 12.58±1.63 10.21±1.36 6.45±0.13**2.89±0.13**△Caspase-1 1.16±0.72 3.73±0.89 0.24±0.10**1.37±0.29**0.70±0.24**△GSDMD 1.08±0.55 5.80±1.64 0.24±0.07**2.72±0.31**1.58±0.40**△NLRP3 1.01±0.13 12.35±2.31 11.12±0.94 5.20±0.69**1.51±0.40**△

2.5 各組小鼠肺組織中NF-κB、NLRP3、Caspase-1 和GSDMD蛋白表達的比較

見圖2。與假手術相比，模型組小鼠肺組織中NFκB、NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達明顯上調。與模型組相比，抑制劑組Caspase-1 和GSDMD-N 蛋白的表達降低，中藥高劑量組、中藥低劑量組NF-κB、NLRP3、Caspase-1、和GSDMD-N 蛋白表達量均下降。與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組NF-κB、NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達有下降趨勢。

圖2 各組小鼠肺組織NF-κB、Caspase-1、NLRP3、GSDMD和GSDMD-N焦亡相關蛋白條帶

3 討 論

肺損傷是膿毒癥病程中最常見的并發(fā)癥之一，在膿毒癥早期即可出現(xiàn)，其院內死亡率高，極度耗費醫(yī)療資源，嚴重威脅人類生命健康。國內流行病學調查顯示，68.2%的膿毒癥患者合并肺損傷，死亡率約35%［5］。西醫(yī)主要以機械通氣治療為主，但即使是保護性的通氣策略，也只是為肺屏障的修復及藥物發(fā)揮作用爭取時間，無法避免肺損傷［6］。

近年來，中醫(yī)中藥在膿毒癥急性肺損傷防治中發(fā)揮著重大作用。葉天士在《外感溫熱篇》指出：“溫邪上受，首先犯肺”。中醫(yī)認為，膿毒癥屬于溫病，主要為熱毒侵襲，熱毒致病暴戾猛烈，常入內毒害臟腑，導致疾病急速惡化。宋代張杲提出“肺為嬌臟，怕寒而惡熱，故邪氣易傷而難治”。肺主氣司呼吸，肺為水之上源，通過肺氣的宣發(fā)肅降推動全身水液輸布。熱毒致病并入肺，一方面熱毒耗傷津液，表現(xiàn)為燥、渴；另一方面，肺臟受熱毒所傷，主水之功能失司，致水熱互結于肺，表現(xiàn)為氣促、燥熱。因此，我們認為膿毒癥肺損傷核心病機為熱毒壅盛、水熱結肺。基于以上認識，我們以犀角地黃湯為基礎，加麻杏石甘湯、葶藶大棗湯應用于臨床。犀角地黃湯清熱解毒，麻杏石甘湯清宣肺熱，葶藶大棗湯逐飲、泄肺平喘。全方配伍共起清熱涼血、瀉肺逐水作用。以上方劑均為臨床治療膿毒癥、肺損傷之經典方劑。研究顯示，犀角地黃湯能顯著降低膿毒癥患者血清中白細胞、超敏CRP、降鈣素原、IL-6、TNF-α等炎癥介質水平［7］，改善凝血功能指標及其預后，降低ICU 住院率、ICU 住院時間和28 d病死率［8］。有學者報道麻杏石甘湯化裁能有效清泄肺熱［9］，緩解LPS 所致急性肺損傷的炎癥反應［10］。

膿毒癥肺損傷的病因及發(fā)病機制錯綜復雜，炎癥反應失控是其發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)［11-12］。膿毒癥肺組織損傷表現(xiàn)為肺泡壁通透性增加，彌漫性肺泡及肺間質水腫，大量炎性細胞浸潤，毛細血管淤血與微血栓形成等。本實驗肺組織病理切片中，模型組肺組織病損程度嚴重，中藥組肺組織炎癥反應明顯減輕，表明犀角地黃湯加減方能減輕膿毒癥炎癥反應、降低肺損傷、保護肺組織。

NF-κB 是多種信號通路的核心，LPS 通過胞膜模式識別受體（TLRs 等）可以激活NF-κB 途徑，為NLRP3 炎性小體的激活奠定物質基礎［13］。有研究報道NF-κB 是犀角地黃湯減輕炎癥的重要靶點之一［14］。地黃、石膏可抑制促炎基因的表達和NF-κB的激活［15-16］，牡丹皮可通過抑制TLR4 信號通路抑制炎癥反應［17］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，應用犀角地黃湯加減方灌胃的膿毒癥小鼠肺組織的NF-κB表達較模型組明顯下調。在經典細胞焦亡途徑中，NLRP3 等炎癥小體被激活后將活化并裂解Pro-Caspase-1形成具有活性的Caspase-1，活化的Caspase-1裂解GSDMD蛋白形成具有活性的N端和C端，N端作用于胞膜形成孔洞，釋放出IL-1β和IL-18；同時Caspase-1 還可以處理pro-IL-1β 形成有活性的IL-1β，釋放到細胞外擴大炎癥反應，最終導致組織損害。在非經典細胞焦亡途徑中，活化的Caspase-4/5/11可以直接與細菌的LPS 等接觸激活，然后切割GSDMD蛋白，并間接激活Caspase-1，引發(fā)焦亡［3］。

邵峰院士團隊［18］證實膿毒癥病程中活化的Caspase-1可誘導炎癥介質釋放，從而引起炎癥反應，表明焦亡在膿毒癥進程中發(fā)揮了重要作用。本研究顯示，與假手術組相比，模型組小鼠肺組織Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達水平上調，提示在膿毒癥早期，肺組織內細胞焦亡已經發(fā)生。Ming 等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，在內毒素血癥動物模型中，Caspase-1基因敲除的小鼠與野生型小鼠相比有著更高的存活率。本研究中，與模型組相比，Caspase-1 抑制劑組小鼠的血清IL-1β、IL-18 水平下降，Caspase-1和GSDMD 蛋白表達均下調，肺組織損傷減輕，說明通過抑制焦亡途徑可以減輕膿毒癥肺損傷。與模型組相比，犀角地黃湯加減方藥物組小鼠肺組織NF-κB、NLRP3、Caspase-1和GSDMD 蛋白表達水平均下調，小鼠的血清IL-1β、IL-18 水平均明顯下降，肺組織損傷顯著減輕，且中藥高劑量組比中藥低劑量組改善更明顯，表明犀角地黃湯加減方可以通過抑制TLR4 信號通路減少NF-κB 激活，從而抑制了NLRP3 炎性小體的激活以及Caspase-1 活化所引發(fā)的一系列焦亡、炎癥反應，減少肺損傷，且與藥物的濃度呈現(xiàn)相關性。

基于以上結果，我們認為犀角地黃湯加減方能通過抑制NLRP3 炎性小體的激活及Caspase-1 活化所致的焦亡相關通路來改善炎癥反應，減輕膿毒癥所致的肺損傷。

綜上，本研究通過動物體內實驗驗證了犀角地黃湯加減方對膿毒癥肺損傷的調控作用及相關通路，但也存在一定局限性，雖然檢測了焦亡相關蛋白，但未對焦亡主要細胞進行明確。后期我們將篩選出藥物作用的具體成分以及焦亡細胞的種類，進一步明確犀角地黃湯加減方緩解膿毒癥致ALI 的機制，為臨床運用提供實驗依據(jù)。