王 苑 付建華 張業(yè)昊 劉光宇

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

腦缺血是全球第二大死因，目前的治療手段相對(duì)局限［1］。塞絡(luò)通是由人參、銀杏葉、西紅花組成的復(fù)方中藥，既往研究證實(shí)塞絡(luò)通可以調(diào)控多個(gè)通路改善腦缺血損傷［2-4］，但是機(jī)制并不明確。本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理與分子對(duì)接的方法探究塞絡(luò)通改善腦缺血疾病的潛在靶點(diǎn)，為塞絡(luò)通藥理機(jī)制的探索提供思路。

1 資料與方法

1.1 腦缺血相關(guān)疾病靶點(diǎn)的搜集 在OMIM 疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.Disgenet.org/）輸入疾病名稱(chēng)“stroke”“cerebral ischemia”“brain ischemia”“cerebral insufficiency”檢索腦缺血的疾病作用靶點(diǎn)，確保更全面地收集腦缺血疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，數(shù)據(jù)合并去重后將結(jié)果導(dǎo)入Excel表格以便進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 中藥成分的收集與篩選 塞絡(luò)通的組成成分比較復(fù)雜，本團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)了塞絡(luò)通中含有17 種活性物質(zhì)［5］，從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得生物活性物質(zhì)的SMILES格式。根據(jù)類(lèi)藥五原則（RO5，亦稱(chēng)Lipinski規(guī)則），即分子量（MW）＜500、氫鍵供體數(shù)目（Hdon）≤5、氫鍵受體數(shù)目（HACC）≤10、脂水分配系數(shù)（LogP）≤5、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)（≤）10，進(jìn)行基于化合物結(jié)構(gòu)的生物利用度評(píng)價(jià)［6-7］。根據(jù)RO5 評(píng)價(jià)化合物，篩選出與RO5 一致的塞絡(luò)通的主要活性成分［7］，同時(shí)使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估活性成分透過(guò)血腦屏障的難易程度［8］。藥物毒性的預(yù)測(cè)是藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，使用ProtoxⅡ分析11 種植物化學(xué)物質(zhì)的毒理參數(shù)，如肝毒性、致癌性、免疫毒性、致突變性和急性經(jīng)口毒性（LD50，mg/kg），數(shù)值越高，則毒性越低。

1.3 “化合物-疾病靶點(diǎn)”篩選 采用TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、PharmMapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、GeneCard（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)活性成分的潛在靶點(diǎn)。將“1.1”和此項(xiàng)得到的靶點(diǎn)結(jié)果導(dǎo)入Excel 中進(jìn)一步獲取交集基因，從而確定塞絡(luò)通活性成分靶點(diǎn)中與腦缺血疾病有關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 為進(jìn)一步明晰塞絡(luò)通干預(yù)腦缺血的作用機(jī)制，將交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING 平臺(tái)獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖由節(jié)點(diǎn)與邊組成，靶點(diǎn)由節(jié)點(diǎn)表示，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系由邊表示。網(wǎng)絡(luò)圖中由節(jié)點(diǎn)發(fā)出的邊越多，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中相互作用越多，節(jié)點(diǎn)的自由度和介數(shù)越大，該節(jié)點(diǎn)就越重要。

1.5 生物信息分析 Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）整合GO、KEGG、UniProt 和DrugBank 等多個(gè)權(quán)威數(shù)據(jù)資源，將“1.3”項(xiàng)篩選出的塞絡(luò)通活性成分與腦缺血相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析，選擇種屬為“H.sapiens（129）”進(jìn)行基因功能注釋?zhuān)℅O）富集分析（包括GOCC 細(xì)胞組分、GOBP 生物過(guò)程GOMF 分子功能）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析。

1.6 分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)塞絡(luò)通活性成分與關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力 通過(guò)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵靶蛋白的三維蛋白結(jié)構(gòu)，利用AutoDock-Tools1.5.6 軟件進(jìn)行分子對(duì)接參數(shù)的設(shè)置及AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合自由能的高低來(lái)評(píng)估蛋白與配體結(jié)合程度，一般結(jié)合自由能越低，兩者之間的構(gòu)象越穩(wěn)定，蛋白質(zhì)與活性成分之間發(fā)生作用的可能性就越大。

2 結(jié) 果

2.1 塞絡(luò)通復(fù)方中活性化合物的篩選

重點(diǎn)討論用HPLC-UV/UV 鑒定的塞絡(luò)通的17 種主要生物活性物質(zhì)，見(jiàn)表1。利用SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)得出與RO5 相關(guān)的性能數(shù)據(jù)，結(jié)果表明人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花素違反RO5，對(duì)剩余的11 種生物活性物質(zhì)進(jìn)行后續(xù)研究。藥物毒性的預(yù)測(cè)是藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的重要組成部分。因此，我們使用ProtoxⅡ分析了這11種活性成分的毒理參數(shù)，如肝毒性、致癌性、免疫毒性、致突變性（圖1）和急性經(jīng)口毒性（LD50，mg/kg）（圖2）。塞絡(luò)通中的所有活性成分均無(wú)肝毒性，其中的異鼠李素、山柰酚、西紅花酸的LD50值最高。

圖1 塞絡(luò)通中11種活性成分的肝毒性、致癌性、免疫毒性及致突變性

圖2 塞絡(luò)通中11種活性成分的LD50值

表1 塞絡(luò)通主要活性成分及性能

2.2 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

基于OMMI、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得腦缺血的疾病作用靶點(diǎn)，共收集到腦缺血疾病作用靶點(diǎn)358 個(gè)，篩選、剔除后共得到301個(gè)“成分-疾病靶點(diǎn)”相互作用的活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。將此數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)一步明確關(guān)鍵靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。其中關(guān)鍵靶點(diǎn)有Akt1、SRC、ESR1、GSK3B、EGFR 等，此處只展示Degree值在前20的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖3。

圖3 塞絡(luò)通干預(yù)腦缺血的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將301 個(gè)交集基因?qū)隡etascape 網(wǎng)站，GO 和KEGG 通路富集分析后結(jié)果見(jiàn)圖4。分析顯示，大部分通路都與物質(zhì)代謝密切相關(guān)，其中30 個(gè)基因與PI3KAkt 信號(hào)通路（hsa04151）有關(guān)，同時(shí)PI3K-Akt 通路又是促進(jìn)代謝的經(jīng)典通路。為了進(jìn)一步明確物質(zhì)代謝的重要性，我們分析了GO 通路，結(jié)果顯示絲氨酸/蘇氨酸的調(diào)控在GOCC、GOMF、GOBP通路的分析中均處于重要位置，絲氨酸/蘇氨酸也與新陳代謝的調(diào)控密切相關(guān)。據(jù)此我們猜測(cè)，塞絡(luò)通中的有效成分可能通過(guò)調(diào)控體內(nèi)的物質(zhì)代謝起到抗腦缺血的作用。絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化是蛋白常見(jiàn)的一種修飾方式，后續(xù)可以據(jù)此開(kāi)啟實(shí)驗(yàn)研究。

圖4 塞絡(luò)通干預(yù)腦缺血潛在靶點(diǎn)的KEGG、GO生物學(xué)過(guò)程富集分析

2.3 分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)塞絡(luò)通活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力

為了研究核心靶標(biāo)與塞絡(luò)通活性成分結(jié)合的可能性，我們進(jìn)行了分子對(duì)接分析。見(jiàn)表2。結(jié)果表明，所有核心靶標(biāo)都與塞絡(luò)通活性成分有較好的結(jié)合能力。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合能小于-4.25 kcal/mol 提示有一定的結(jié)合活性，小于-5.0 kcal/mol 有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal/mol有強(qiáng)烈的結(jié)合活性［9］。

表2 塞絡(luò)通中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能預(yù)測(cè)

3 討 論

塞絡(luò)通具有補(bǔ)氣活血祛瘀之效。張業(yè)昊等［10］研究證明，塞絡(luò)通可以抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)缺血造成的損傷。范曉迪等［4］研究證明，塞絡(luò)通可以激活Nrf2通路，緩解缺血引起的氧化應(yīng)激損傷。李珺瑗等［11］研究證明，塞絡(luò)通可以作用于小鼠TLR4/MYD-88/NF-κB 通路促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)發(fā)生與神經(jīng)修復(fù)。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選塞絡(luò)通復(fù)方中各個(gè)組分的活性成分，獲取其作用靶點(diǎn)，建立活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，從而系統(tǒng)說(shuō)明塞絡(luò)通干預(yù)腦缺血的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制。

在塞絡(luò)通干預(yù)腦缺血的主要活性化合物中，拓?fù)鋮?shù)分析結(jié)果表明，人參抗腦缺血主要活性成分為皂苷類(lèi)化合物。人參皂苷Rg1可增強(qiáng)對(duì)缺血再灌注和氧化應(yīng)激損傷的拮抗作用［12］。銀杏葉中抗腦缺血的主要成分為黃酮類(lèi)和內(nèi)酯類(lèi)，銀杏類(lèi)黃酮和萜類(lèi)化合物的混合物具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，調(diào)控凋亡因子和細(xì)胞色素c信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血-再灌注損傷［13］。銀杏內(nèi)酯通過(guò)Akt/Nrf2 信號(hào)通路上調(diào)抗氧化蛋白表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)元免受氧化損傷［14］。西紅花抗腦缺血的主要成分包括西紅花酸、西紅花苷、西紅花苦苷等單萜苷類(lèi)成分，其中西紅花素可以調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的功能，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生來(lái)修復(fù)缺血性中風(fēng)［15］。

網(wǎng)絡(luò)中通過(guò)拓?fù)鋮?shù)篩選得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)Akt1與腦缺血緊密相關(guān)，Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，其活化與內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化關(guān)系密切，參與因內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化與斑塊形成［16］。分子對(duì)接結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出排名靠前的活性成分與靶點(diǎn)均有一定的結(jié)合能力。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為中藥的一種研究方法目前仍存在諸多不足。首先大部分網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)口服生物利用度和類(lèi)藥性篩選活性成分，沒(méi)有考慮到量效關(guān)系。第二，利用數(shù)據(jù)庫(kù)分析活性成分的靶點(diǎn)，沒(méi)有考慮到活性成分之間的相互作用，更有些活性成分通過(guò)產(chǎn)生次生代謝物來(lái)發(fā)揮藥效，如此分析難免不全面。第三，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)只考慮活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的交叉靶點(diǎn)而忽視了非交叉靶點(diǎn)，并且沒(méi)有論證非交叉靶點(diǎn)的重要性。第四，疾病在不斷的變化發(fā)展，而數(shù)據(jù)庫(kù)具有滯后性。在此我們使用了一種新的藥物活性成分篩選辦法，即RO5 原則，但這種方法也有一定的局限性，據(jù)此原則篩除掉的西紅花素被證明可以在大鼠腦缺血再灌注后促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，通過(guò)mTOR途徑發(fā)揮抗缺血作用，保護(hù)神經(jīng)元功能［17］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以為藥理實(shí)驗(yàn)提供預(yù)測(cè)，同時(shí)也有很多爭(zhēng)議問(wèn)題亟待解決。