楊珺亦 楊程夫 王 靜 王曉琳 尹 穎

(南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

微塑料(MPs)污染是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題。隨著塑料生產(chǎn)及應(yīng)用的不斷增加,越來(lái)越多的塑料垃圾被釋放到環(huán)境中,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間物理化學(xué)生物作用,破碎成為MPs[1],廣泛分布于全球水域,甚至可在人跡罕至的北冰洋檢出[2-4]。MPs可通過(guò)生物攝食進(jìn)入食物鏈、食物網(wǎng)[5],擁有較強(qiáng)黏附性,可能形成纖維影響生物消化吸收[6],可能吸附有機(jī)物、重金屬、抗生素等,除物理性損傷還存在多種毒性效應(yīng),造成嚴(yán)重環(huán)境健康危害[7-9]。

納米ZnO作為典型金屬納米材料,可通過(guò)呼吸、飲食等進(jìn)入人體吸收,造成健康危害[10],在水中釋放Zn2+富集于生物體內(nèi)產(chǎn)生毒性,使斑馬魚胚胎孵化率降低、產(chǎn)生氧化應(yīng)激,阻礙魚類繁殖和正常生長(zhǎng)發(fā)育[11-12]。通過(guò)模型計(jì)算,部分實(shí)際水環(huán)境中納米ZnO高達(dá)760 μg/L[13]。水體中納米材料復(fù)合會(huì)改變其表面活性、提高穩(wěn)定性[14],MPs和納米ZnO作為微小不穩(wěn)定顆粒物,同時(shí)存在可能表現(xiàn)出不同復(fù)合模式,造成更嚴(yán)重毒性效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn),聚乙烯吡咯烷酮(PVP)與納米Ag復(fù)合會(huì)限制Ag+還原,降低納米Ag對(duì)小球藻和柵藻毒性[15]。暴露于MPs與Cu復(fù)合體系中的斑馬魚氧化應(yīng)激水平提高、細(xì)胞凋亡失調(diào)、大腦神經(jīng)回路改變,復(fù)合毒性效應(yīng)顯著[16-17]。MPs和納米ZnO復(fù)合可能影響Zn的生物可利用性和納米ZnO的毒性。

目前研究主要探索MPs的粒徑、濃度及顆粒形態(tài)對(duì)生物造成的影響[18-20],關(guān)于MPs種類(化學(xué)結(jié)構(gòu))差異導(dǎo)致的影響、MPs和納米材料間的相互作用及聯(lián)合毒性效應(yīng)機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以3種產(chǎn)量較大、應(yīng)用廣泛、產(chǎn)品多樣的通用球狀MPs[21]為例,參考實(shí)際水環(huán)境中納米ZnO濃度及納米ZnO對(duì)魚類毒性效應(yīng)相關(guān)研究[22],設(shè)置1 mg/L實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度,研究聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)MPs與納米ZnO對(duì)錦鯽(Carassiusauratus)的復(fù)合生物效應(yīng)及作用機(jī)理,探索MPs種類差異可能存在的影響,為水環(huán)境中MPs和納米ZnO生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用納米ZnO((30±10) nm,99.9%)、PVC MPs(500 nm)、PMMA MPs(500 nm)均外購(gòu),PS MPs(500 nm)利用分散聚合法[23]自合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)生物

錦鯽購(gòu)自江蘇省南京市某市場(chǎng)。在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)兩周。實(shí)驗(yàn)用水充分曝氣,溶解氧不低于6 mg/L,水溫(25±1) ℃。正常光照,每?jī)商爝M(jìn)行喂食與換水。馴養(yǎng)結(jié)束隨機(jī)挑選64尾健壯錦鯽進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),設(shè)置8個(gè)暴露組別:空白對(duì)照組(CK組)、納米ZnO單一組(ZnO組)、PS MPs單一組(PS組)、PVC MPs單一組(PVC組)、PMMA MPs單一組(PMMA組)、PS MPs與納米ZnO復(fù)合組(PS+ZnO組)、PVC MPs與納米ZnO復(fù)合組(PVC+ZnO組)、PMMA MPs與納米ZnO復(fù)合組(PMMA+ZnO組)。3種MPs與納米ZnO暴露質(zhì)量濃度均為1 mg/L。暴露容器為42 L玻璃魚缸,實(shí)際水量30 L。每組隨機(jī)放入8尾錦鯽,分別加入提前用超聲清洗儀(KH-800KDE)分散均勻的暴露母液。暴露周期為14 d,每?jī)商爝M(jìn)行喂食與換水。每組設(shè)4個(gè)平行處理。

1.4 MPs表征

分別采集3種MPs粉末0.1 g,使用JEM-200CX型透射電子顯微鏡(TEM)觀察MPs顆粒形貌粒徑。使用ESCALAB-250Xi型X射線光電子能譜(XPS)儀分析MPs元素組成及含量。

1.5 水合粒徑及Zeta電位

分別取對(duì)應(yīng)超聲分散均勻的暴露液,使用NANO-ZSDLS型動(dòng)態(tài)光散射粒度儀測(cè)定水體中MPs及納米ZnO顆粒水合粒徑和Zeta電位。

1.6 Zn2+釋放

分別取對(duì)應(yīng)暴露后水樣,3 500 r/min離心10 min,取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜,分離溶液中Zn2+,使用SLT400SF型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定納米ZnO釋放的Zn2+濃度。

1.7 Zn在錦鯽體內(nèi)的分布與積累

取對(duì)應(yīng)暴露后錦鯽,依次剖出性腺、腸道、鰓、眼、腦,取適量魚肉,45 ℃烘干,分別稱重,消解,2%(體積分?jǐn)?shù))硝酸定容,過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定各組織中Zn含量。

1.8 錦鯽肝臟氧化損傷

取對(duì)應(yīng)暴露后錦鯽肝臟稱重,加入0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水制成10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))肝臟勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清液。按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)所述試驗(yàn)方法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)活性,評(píng)價(jià)錦鯽肝臟氧化損傷。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析,p<0.05認(rèn)為存在顯著性差異。圖表利用Excel 2019及Origin 2022繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 MPs表征

由圖1可見(jiàn),3種MPs顆粒均呈尺寸均一、光滑的圓球狀,平均粒徑約500 nm,無(wú)明顯黏附變形現(xiàn)象,單一球狀顆粒較完整,MPs種類差異在其顆粒形態(tài)上無(wú)明顯體現(xiàn)。環(huán)境中普遍存在的MPs形態(tài)包括球狀、顆粒狀、纖維狀等[24],不同形態(tài)的MPs表面性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞攝入、毒性效應(yīng)等不同[25]。相同暴露條件下,球狀PS MPs可能由于其光滑表面和在溶液中較分散的顆粒形態(tài),相較于纖維狀和碎片狀顆粒更易被生物攝食且難以消化,對(duì)生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)[26]。

圖1 3種MPs的TEM表征

XPS表面元素掃描結(jié)果顯示,3種MPs表面元素含量不同(見(jiàn)表1)。C在3種MPs表面均最大,超過(guò)70%;PVC MPs表面含Cl,含量介于C和O之間;PMMA MPs表面O較高,達(dá)到28.38%。由圖2可見(jiàn),3種MPs化學(xué)結(jié)構(gòu)不同,PS MPs分子中含苯環(huán),PMMA MPs分子中有酯基存在。不同MPs表面性質(zhì)存在差異,可能對(duì)其分子極性、水合粒徑、吸附能力及顆粒分散體系穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。PS MPs表面C-H鍵會(huì)斷裂與O反應(yīng)生成過(guò)氧自由基,過(guò)氧自由基還原為羧基,含氧基團(tuán)增加,更易與金屬絡(luò)合[27]。PVC MPs結(jié)構(gòu)中Cl可能氧化進(jìn)入含氧官能團(tuán),分子極性較大,熱穩(wěn)定性較差,能通過(guò)靜電作用吸附有機(jī)物、重金屬等[28]。PMMA MPs本身含氧量較高,易形成氫鍵,分子極性較大[29]。

表1 3種MPs的XPS表面元素掃描結(jié)果

圖2 3種MPs化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2 水合粒徑

不同組別水體中顆粒水合粒徑見(jiàn)圖3。水體中PS MPs水合粒徑最小,PMMA組MPs水合粒徑最大,MPs顆粒間相互團(tuán)聚[30],尺寸遠(yuǎn)大于實(shí)際粒徑。PMMA+ZnO組MPs水合粒徑顯著減小,但仍顯著大于PS+ZnO、PVC+ZnO組。與PMMA MPs共存時(shí),顆粒團(tuán)聚效應(yīng)增強(qiáng),納米ZnO水合粒徑顯著增大,與PS、PVC MPs共存無(wú)顯著影響。

注:組間不同小寫字母表示差異顯著,圖4至圖7同。

PS MPs表面負(fù)電荷較強(qiáng),顆粒間靜電排斥力較大,不易聚集,水合粒徑較小且易保持恒定[31],不受納米ZnO復(fù)合影響。周欣[32]26測(cè)定發(fā)現(xiàn),粒徑為50 μm的PMMA MPs相較PS MPs親水性更強(qiáng)、等電點(diǎn)更大。分子極性較強(qiáng)的PMMA MPs易形成氫鍵團(tuán)聚,水合粒徑較大。納米ZnO與PMMA MPs復(fù)合后被含氧基團(tuán)絡(luò)合,團(tuán)聚在PMMA MPs表面,納米ZnO水合粒徑增大[33]。

2.3 Zeta電位

各組溶液Zeta電位均為負(fù)值。單一MPs體系Zeta電位絕對(duì)值較ZnO組顯著提高(見(jiàn)圖4)。PVC MPs單一與復(fù)合體系Zeta電位絕對(duì)值最大,均超過(guò)30 mV,與PVC MPs分子含Cl表面帶負(fù)電有關(guān)。PS、PMMA MPs與納米ZnO復(fù)合后Zeta電位絕對(duì)值顯著降低,分別由28.43、24.57 mV變?yōu)?2.43、20.87 mV。與單一納米ZnO相比,添加3種MPs均會(huì)使Zeta電位絕對(duì)值顯著上升,與PVC MPs復(fù)合效應(yīng)最顯著。

圖4 不同組別Zeta電位絕對(duì)值

Zeta電位可體現(xiàn)物質(zhì)表面帶電情況,反應(yīng)膠體體系穩(wěn)定性,Zeta電位絕對(duì)值越大,膠體顆粒間排斥力越大,膠體體系穩(wěn)定性越強(qiáng)[34]。各組Zeta電位均為負(fù)值,反應(yīng)納米ZnO及MPs表面均帶負(fù)電。ZnO組Zeta電位絕對(duì)值最小,說(shuō)明納米ZnO顆粒間排斥力較小,最易團(tuán)聚,體系不穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn),在顆粒間靜電作用下,納米Fe3O4會(huì)附著在PS MPs表面形成明顯核殼結(jié)構(gòu),顆粒間斥能增大,體系穩(wěn)定性增強(qiáng)[35]。納米ZnO與MPs復(fù)合同樣表現(xiàn)為Zeta電位絕對(duì)值增大,體系穩(wěn)定性增強(qiáng)。PMMA MPs相較其他兩種MPs含氧量高、分子極性大、團(tuán)聚效應(yīng)顯著[32]26,理論上Zeta電位絕對(duì)值大、體系穩(wěn)定性強(qiáng),然而實(shí)際測(cè)定PMMA MPs單一及復(fù)合組Zeta電位絕對(duì)值相對(duì)較小,與理論情況相反,具體需對(duì)溶液中PMMA MPs表面理化特性進(jìn)行測(cè)定。與納米ZnO復(fù)合后,PS、PMMA MPs的Zeta電位絕對(duì)值減小,體系穩(wěn)定性下降,可能由于納米ZnO取代了MPs表面帶電物質(zhì),誘導(dǎo)聚集于MPs表面,改變了顆粒間斥力[36]。分子表面自身帶負(fù)電基團(tuán)的PVC MPs與納米ZnO復(fù)合前后Zeta電位絕對(duì)值較大,受到復(fù)合影響較小,溶液穩(wěn)定性較強(qiáng)。

2.4 Zn2+釋放

不同組別水體中Zn2+質(zhì)量濃度見(jiàn)圖5。納米ZnO的Zn2+釋放率為39.79%,與PS、PVC、PMMA MPs復(fù)合后Zn2+釋放率分別為51.84%、46.97%、47.42%,均顯著升高,PS+ZnO組Zn2+釋放率較PVC+ZnO、PMMA+ZnO組顯著提高。3種MPs均可促進(jìn)納米ZnO釋放Zn2+,PS MPs促進(jìn)作用最強(qiáng)。

圖5 不同組別水體中Zn2+質(zhì)量濃度

研究發(fā)現(xiàn),納米ZnO與納米TiO2復(fù)合,物質(zhì)表面會(huì)形成配合物,表面電荷及顆粒間靜電作用改變,Zn2+釋放增多[37]。納米ZnO同樣會(huì)附著于MPs表面形成配合物,改變顆粒表面電荷及顆粒間靜電作用,導(dǎo)致MPs復(fù)合促進(jìn)納米ZnO釋放Zn2+。PS MPs可能由于分子中含苯環(huán),得電子能力較強(qiáng)[38],更易吸附納米ZnO形成配合物,對(duì)Zn2+釋放的促進(jìn)作用最強(qiáng)。后續(xù)可進(jìn)一步研究3種MPs對(duì)Zn2+的吸附行為解釋MPs促進(jìn)Zn2+釋放的內(nèi)在機(jī)制。

2.5 Zn在錦鯽體內(nèi)的分布與積累

不同組別錦鯽各組織中Zn分布情況如圖6所示。腦部是Zn富集量最低的組織,與CK組相比,添加納米ZnO后腦部Zn均無(wú)顯著增加,說(shuō)明納米ZnO及其釋放的Zn2+無(wú)法單獨(dú)或經(jīng)MPs誘導(dǎo)或負(fù)載進(jìn)入腦部。眼部、魚肉、性腺和腸道中,ZnO組均出現(xiàn)Zn含量升高現(xiàn)象,其中腸道組織中Zn最高。與ZnO組相比,PS+ZnO組顯著增加了魚肉和鰓部中Zn含量;PVC+ZnO組顯著增加了腸道中Zn含量;MPs復(fù)合降低了Zn在性腺的積累,可能減輕納米ZnO對(duì)魚類子代的危害。整體來(lái)看,暴露于納米ZnO會(huì)導(dǎo)致魚體不同組織產(chǎn)生Zn累積,MPs復(fù)合會(huì)影響這種累積,且影響程度因MPs種類和Zn積累組織部位的不同而異。

圖6 不同組別錦鯽各組織中Zn分布情況

有關(guān)納米CuO在鯉魚體內(nèi)分布情況及毒性效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn),鯉魚腦部存在血腦屏障阻礙金屬進(jìn)入[39],與本實(shí)驗(yàn)錦鯽腦部Zn含量較低測(cè)定結(jié)果相符,說(shuō)明錦鯽腦部有類似阻礙金屬進(jìn)入的血腦屏障。與PS+ZnO組魚肉和鰓部中Zn含量增加,可能與復(fù)合體系中Zn2+釋放量增大有關(guān),Zn2+經(jīng)PS MPs負(fù)載進(jìn)入魚肉和鰓部富集。已有研究發(fā)現(xiàn),Zn在雄性中華絨螯蟹性腺內(nèi)參與多項(xiàng)酶催化過(guò)程及生理生化反應(yīng),轉(zhuǎn)化消除率較大[40]。同時(shí),BURGOS等[41]

證實(shí),聚集的納米顆粒水合粒徑較大,不利于細(xì)胞吸收。納米ZnO與MPs復(fù)合后顆粒團(tuán)聚作用增強(qiáng),水合粒徑增大,Zn的細(xì)胞吸收率下降。納米ZnO與MPs復(fù)合暴露時(shí)性腺中Zn的消除率大于吸收率導(dǎo)致Zn累積量下降。攝食作為水生生物最主要的攝入顆粒物途徑[42],導(dǎo)致腸道中大量富集Zn。在60～310 nm的單分散納米Fe3O4暴露體系中發(fā)現(xiàn),較小的納米顆粒更易穿透腫瘤細(xì)胞膜,但較大的納米顆粒在細(xì)胞中積累量反而更大,可能由于粒徑過(guò)小的納米顆粒易被細(xì)胞轉(zhuǎn)化消除[43]。PMMA+ZnO組納米ZnO水合粒徑最大,但錦鯽腸道中Zn富集量較小,可能由于顆粒物過(guò)大,Zn難以被PMMA MPs負(fù)載進(jìn)入細(xì)胞。PVC+ZnO組體系較穩(wěn)定,納米ZnO水合粒徑較大,納米ZnO與PVC MPs復(fù)合易被細(xì)胞內(nèi)化富集且較難被細(xì)胞轉(zhuǎn)化消除,腸道中Zn含量增加。整體來(lái)看,由于PS MPs分子極性大、表面靜電作用強(qiáng)、體系穩(wěn)定性差,復(fù)合體系中Zn2+含量最高,錦鯽的眼部、鰓部、魚肉中Zn富集相應(yīng)增加。

2.6 錦鯽肝臟氧化損傷

錦鯽肝臟組織中氧化應(yīng)激酶活性見(jiàn)圖7。與CK組比較,納米ZnO表現(xiàn)出對(duì)SOD的應(yīng)激誘導(dǎo)作用,而PS、PVC MPs則顯著降低了SOD活性;PS+ZnO組SOD活性顯著上升;PMMA MPs單一和復(fù)合組SOD活性與CK組均沒(méi)有顯著差異,但比ZnO組顯著下降。

圖7 錦鯽肝臟組織中氧化應(yīng)激酶活性

與MPs單獨(dú)暴露相比,復(fù)合均顯著增加MDA活性。與CK或ZnO組相比,復(fù)合后MDA活性沒(méi)有顯著差異。

與CK或ZnO組相比,PS、PMMA MPs單一與復(fù)合組ROS活性均顯著上升。3種MPs單一與復(fù)合組間ROS活性均無(wú)顯著差異。不同MPs種類對(duì)其單一或與納米ZnO復(fù)合造成的生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)響應(yīng)存在差異。整體來(lái)看,納米ZnO對(duì)鯽魚肝臟抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生效應(yīng)大于MPs,與PS MPs復(fù)合對(duì)納米ZnO造成的錦鯽肝臟氧化損傷影響更大。

暴露于8 mg/L納米ZnO的羅非魚肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重充血、壞死、凋亡癥狀,尤其通過(guò)喂食暴露時(shí)納米ZnO顯著改變肝臟組織結(jié)構(gòu),產(chǎn)生嚴(yán)重毒性效應(yīng)[44],本實(shí)驗(yàn)納米ZnO濃度較低,同樣對(duì)鯽魚肝臟產(chǎn)生生物效應(yīng)。高之茵[45]在研究PS MPs與納米CuO對(duì)青島大扁藻的聯(lián)合毒性機(jī)制時(shí)提出,MPs對(duì)金屬離子的吸附及對(duì)納米氧化物顆粒的異質(zhì)聚集可能改變兩者聯(lián)合毒性。PS MPs與納米ZnO復(fù)合后,Zeta電位絕對(duì)值下降,溶液穩(wěn)定性較差,Zn2+釋放增強(qiáng),納米ZnO與Zn2+同時(shí)產(chǎn)生毒性效應(yīng)。已有研究證實(shí),與0.1、3 μm的PS MPs復(fù)合均會(huì)增強(qiáng)納米ZnO對(duì)大型蚤氧化應(yīng)激效應(yīng)[46]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符,MPs與納米ZnO復(fù)合對(duì)錦鯽肝臟氧化應(yīng)激產(chǎn)生顯著影響,對(duì)錦鯽氧化損傷增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

500 nm的3種球狀MPs化學(xué)結(jié)構(gòu)與表面元素含量不同,含量最高的元素是C和O,PS MPs表面C高達(dá)93.07%,PMMA MPs表面含O 28.38%,PVC MPs表面含Cl 18.39%。PMMA MPs單一與復(fù)合體系中顆粒水合粒徑最大,Zeta電位絕對(duì)值較小,體系不穩(wěn)定。PVC MPs單一與復(fù)合體系中Zeta電位絕對(duì)值最大,體系穩(wěn)定。納米ZnO溶液Zeta電位絕對(duì)值最小,顆粒物更易團(tuán)聚,與MPs復(fù)合后Zeta電位絕對(duì)值均顯著增大,溶液穩(wěn)定性增強(qiáng)。MPs促進(jìn)納米ZnO釋放Zn2+,PS MPs復(fù)合體系中Zn2+含量最高。錦鯽腦部中Zn含量較低,眼部、鰓部、魚肉中Zn含量較高,腸道中更易富集Zn,性腺中MPs與納米ZnO復(fù)合后Zn含量降低。MPs單一暴露未對(duì)錦鯽肝臟產(chǎn)生氧化損傷,納米ZnO暴露產(chǎn)生氧化損傷,與PS MPs復(fù)合總體顯示損傷作用加劇。分子極性大、表面靜電作用強(qiáng)、團(tuán)聚效應(yīng)顯著、體系穩(wěn)定性差的MPs與納米ZnO復(fù)合易改變物質(zhì)表面性質(zhì),促進(jìn)納米ZnO釋放Zn2+,增強(qiáng)對(duì)錦鯽毒性效應(yīng)。