龔陳盼 張然然,2# 莊海峰 周柳媛

(1.浙江科技學院浙江省廢棄生物質循環(huán)利用與生態(tài)處理技術重點實驗室,浙江 杭州 310023;2.西北工業(yè)大學生態(tài)環(huán)境學院,陜西 西安 710129)

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴大,為了增強畜禽免疫力,提高養(yǎng)殖業(yè)的經濟效益,抗生素和重金屬被廣泛作為飼料添加劑,這些添加劑濫用導致重金屬和抗生素含量遠超生物生長所需,動物腸胃中抗生素和重金屬無法被完全吸收,過量的抗生素在動物腸道中會誘導出抗性微生物,最終通過排泄物排出體外,造成畜禽糞便中抗生素殘留,誘導出抗生素抗性基因(ARGs),因此畜禽糞便成為了ARGs的重要儲存庫[1]。ZHU等[2]研究發(fā)現(xiàn)豬糞中ARGs種類多樣,共檢測出149種ARGs亞型。ARGs傳播擴散會誘導環(huán)境介質中微生物獲得抗性,進而出現(xiàn)“超級細菌”嚴重威脅人類健康,臨床衛(wèi)生安全也將面臨巨大的挑戰(zhàn)[3-4]。

厭氧發(fā)酵是糞肥資源化利用的主要處理方式[5],糞污通過發(fā)酵可以生產沼氣等清潔能源,產物中的沼渣、沼液也是優(yōu)質有機原料,可改良土壤。然而有研究發(fā)現(xiàn)厭氧發(fā)酵處理后的發(fā)酵產物中存在部分ARGs富集現(xiàn)象[6]。例如SUN等[7]研究發(fā)現(xiàn)牛糞厭氧發(fā)酵過程中氟喹諾酮抗性基因具有較高的持久性和富集動態(tài)。LU等[8]研究發(fā)現(xiàn)牛糞厭氧發(fā)酵后的沼渣沼液中多數(shù)ARGs豐度均要高于牛糞,且沼渣貯藏1個月后,磺胺類抗性基因富集程度顯著升高。發(fā)酵產物的沼渣沼液施用于農田會增加ARGs輸入食物鏈的風險,進而影響農作物生長和農產品安全[9]。

重金屬銅作為主要的飼料添加劑廣泛應用于養(yǎng)殖場,研究發(fā)現(xiàn)豬糞中有大量的銅殘留[10-11],可達286.7～1 905.0 mg/kg[12]。與抗生素相比,重金屬污染對ARGs的影響更為深遠,因為重金屬在環(huán)境介質中不易降解,同時還會對ARGs施加選擇性壓力,使得微生物對重金屬也產生抗性,進而誘導出重金屬抗性基因[13],在提高環(huán)境中ARGs多樣性的同時也加劇了多重ARGs的傳播風險。楊統(tǒng)一等[14]研究發(fā)現(xiàn)施用糞肥后的土壤重金屬含量顯著增加,尤其是銅、鋅,其含量與多種ARGs豐度呈顯著正相關,說明重金屬的賦存可能參與了ARGs共選擇。SUN等[15]研究發(fā)現(xiàn)受到抗生素和重金屬復合污染的糞肥中,sul1和sul2豐度顯著升高,但其研究使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)技術測得的ARGs數(shù)量較為單一,僅是測定了兩種四環(huán)素類抗性基因和兩種磺胺類抗性基因。在厭氧發(fā)酵體系下,關于重金屬銅對發(fā)酵產物中多種ARGs的分布特征研究較少,張然然[16]研究發(fā)現(xiàn)鋅、銅都顯著提高了豬糞厭氧發(fā)酵過程及產物中ARGs和可移動基因元件(MGEs)豐度,但僅測定了15種ARGs和4種MGEs,不能全面解釋各類ARGs的分布特征?，F(xiàn)實污染環(huán)境條件多樣且復雜,以往多數(shù)研究采用傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應(PCR)技術,側重于對有限種類的ARGs的定性與定量,但對各類ARGs的分布特征缺乏系統(tǒng)性解讀。

為了管控有機肥施用導致ARGs在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的擴散傳播,考慮到重金屬賦存可能會提高ARGs的傳播擴散風險,更全面更系統(tǒng)地探討受銅污染的發(fā)酵產物中ARGs多樣性及分布特征顯得尤為重要。本研究模擬了兩種水平銅污染(75、227 mg/L)對豬糞厭氧發(fā)酵產物中ARGs和MGEs分布特征的影響,采用高通量實時熒光定量聚合酶鏈式反應(HT-qPCR)技術,共使用354組引物檢測296個ARGs、57個MGEs,定量分析發(fā)酵產物中ARGs的豐度變化及各類ARGs之間的相關性特征。本研究為評價銅在誘導微生物抗生素抗性中的作用提供了基礎數(shù)據(jù),對防控糞肥施用于農田的風險提供了理論評估依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及實驗設置

本研究使用的豬糞來自西北農林科技大學的一個中型農場。豬糞pH為7.87,總固體質量分數(shù)為41%,含碳量為398.29 g/kg,含氮量為26.57 g/kg。小麥秸稈pH為5.37,總固體質量分數(shù)為98%,含氮量為6.77 g/kg,含碳量為493.63 g/kg。將豬糞和小麥秸稈按一定比例混合后調節(jié)C/N(質量比)為20∶1,用去離子水使厭氧發(fā)酵體系的最初總固體質量分數(shù)維持在8%。厭氧發(fā)酵裝置參考文獻[17]、[18],實驗每個處理設置3個重復。實驗所用的CuCl2純度為99.0%,ACS級。參考文獻[19]的操作(設置豬糞中銅平均質量濃度為500 mg/kg(基于豬糞干質量,下同),最大質量濃度為1 500 mg/kg),本研究在厭氧發(fā)酵體系中共設置了1個對照組(CK,不添加銅)和兩個銅處理組(CuL中含銅75 mg/L,CuH中含銅227 mg/L)。厭氧發(fā)酵體系混合均勻后立即采集CK的3個平行作為0 d樣品。所有3種處理在52 d后收集100 mL樣品于棕色瓶中用于后續(xù)分析。

1.2 脫氧核糖核酸(DNA)提取和HT-qPCR

DNA的提取:冷干樣品利用FastDNA SPIN Kit for Soils試劑盒(MP Biomedicals)由 100 mg樣品中提取總基因組DNA,用低共熔溶劑(DES)洗脫總DNA。采用1.5%(質量分數(shù))凝膠電泳和酶板儀(Biotek Elx808)檢測分析DNA提取物的質量和濃度。HT-qPCR采用廣東某科技有限公司的SmartChip實時PCR系統(tǒng)進行?？偣彩褂?54組引物檢測296個ARGs、34個轉座子、11個質粒、9個插入序列、3個整合子。所有HT-qPCR均進行3次技術重復。

2 結 果

2.1 ARGs和MGEs數(shù)量的變化

3組不同處理下ARGs和MGEs數(shù)量如圖1所示,總共檢測到152個ARGs,涵蓋11個主要類別(包括氨基糖苷類、四環(huán)素類、多藥類、磺胺類等抗性基因)和33個MGEs(16個轉座子、7個插入序列、7個質粒和3個整合子)。

注:相對豐度由絕對豐度除以16S rDNA總量計算得出,圖2和圖3同。

CK、CuL和CuH中分別檢測到118、152和138個ARGs。銅處理組檢測到的ARGs數(shù)量多于CK。產物中檢測出多藥類和氨基糖苷類抗性基因最為豐富,均占所有處理中檢測到的ARGs數(shù)量總和的20%以上,其次是大環(huán)內酯類和四環(huán)素類抗性基因。CK、CuL和CuH中分別檢測到28、35和31個MGEs,大多數(shù)MGEs在3組處理中均被檢測出。

2.2 ARGs和MGEs相對豐度的分布特征

CuH中ARGs總相對豐度高于CuL和CK。與CK相比,CuL和CuH中ARGs總相對豐度分別提高了86%和91%。氨基糖苷類抗性基因相對豐度最高,其次就是四環(huán)素類抗性基因。CuH中四環(huán)素類抗性基因相對豐度分別是CK和CuL的3.6、1.5倍。多藥類和磺胺類抗性基因在銅處理組中的相對豐度占比明顯高于CK。在銅處理組中的MGEs相對豐度顯著(P<0.05,下同)高于CK,其中部分轉座子(如IS6100、IS613)和整合子(如intI1)的相對豐度在CuL中高于CuH。總體來看,受到銅污染的發(fā)酵體系中所檢測出的ARGs和MGEs相對豐度要顯著高于CK,且同一基因對不同濃度銅的響應不同,以下分別對各大類別的ARGs和MGEs進行分布特征分析,結果見圖2與圖3。

圖2 3組處理下的ARGs相對豐度的變化

圖3 3組處理下的MGEs相對豐度的變化

2.2.1 氨基糖苷類抗性基因

銅處理組下的氨基糖苷類抗性基因相對豐度要顯著高于CK,一些氨基糖苷類抗性基因的相對豐度在CuH中較高,尤其是aadA99、aadA17和aadA21,除此之外的大部分氨基糖苷類抗性基因相對豐度普遍表現(xiàn)為CuL高于CuH。

2.2.2 四環(huán)素類抗性基因

在四環(huán)素類抗性基因中,CuH中tetM的相對豐度最高,分別是CK和CuL的4.1、1.3倍。CuH中tet(44)、tetA(P)和tetG的相對豐度高于CK和CuL。在四環(huán)素類抗性基因中,只有tet(32)相對豐度表現(xiàn)為CuL高于CuH和CK。

2.2.3 多藥類抗性基因

與CK相比,多藥類抗性基因的相對豐度在銅處理組中均得到富集。CuL和CuH的qacH351相對豐度分別是CK的14.0、12.6倍。CuH的mefB相對豐度分別是CuL和CK的2.4、7.0倍。

2.2.4 β-內酰胺類抗性基因

對于β-內酰胺類抗性基因,其在CuL的相對豐度均高于CuH和CK,且ant(6)-Ia和aph(3”)-ia相對豐度在銅處理組中較高。

2.2.5 大環(huán)內酯類與磺胺類抗性基因

大環(huán)內酯類抗性基因ermF在所有處理中相對豐度均最高,表現(xiàn)為CuL>CuH>CK。大多數(shù)抗性基因在CuL中的相對豐度高于CuH和CK。此外,erm(36)和mphA、vatE、ermG僅在銅處理組中檢測到。磺胺類抗性基因sul1在CuL中的相對豐度高于CK和CuH,總體來看,磺胺類抗性基因在銅處理組中得到了富集。

2.2.6 MGEs

CuH和CuL中intI1和intI2相對豐度高于CK。CuH和CuL中部分質粒的相對豐度高于CK,尤其是CuH的pBS228-IncP-1α相對豐度分別是CuL和CK的2.0、5.0倍。此外,大部分插入序列的相對豐度在銅處理組中保持較高相對豐度,但TN5只在CK中被檢測出。大多數(shù)轉座子在CuH和CuL中的相對豐度均高于CK。

2.3 相關性分析結果

對厭氧發(fā)酵產物中ARGs與MGEs相對豐度進行Pearson相關性分析,繪制相關性氣泡圖(見圖4),氨基糖苷類、磺胺類、β-內酰胺類、大環(huán)內酯類、多藥類、氯霉素類、甲氧芐氨嘧啶類抗性基因之間的相對豐度都呈顯著正相關。

注:圖中氨基糖苷類抗性基因簡寫為氨基糖苷類,其余以此類推。

對比厭氧發(fā)酵產物中ARGs與MGEs相對豐度的相關性可以得出,氨基糖苷類、磺胺類、β-內酰胺類、大環(huán)內酯類、多藥類、氯霉素類、甲氧芐啶類抗性基因總和與MGEs呈極顯著(P<0.01)正相關,四環(huán)素類抗性基因與MGEs呈顯著正相關。

3 討 論

從ARGs數(shù)量水平上來看,發(fā)酵產物中ARGs種類非常豐富,其中檢測到多藥類抗性基因數(shù)量最多,其次為氨基糖苷類;但在相對豐度水平上,氨基糖苷類抗性基因的相對豐度最高,約占ARGs總相對豐度60%以上,其次是四環(huán)素類、多藥類和磺胺類抗性基因。氨基糖苷類抗性基因的高相對豐度特征主要歸因于氨基糖苷類是較為廣泛和高使用率的抗生素[20-21],可能在發(fā)酵過程中存在較高的持久性。QIAO等[22]發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類、磺胺類抗生素在畜禽糞便中檢出率較高,這與本研究測得的結果相佐。

在本研究中,受到銅污染的發(fā)酵體系檢測的ARGs相對豐度都高于CK,說明銅通過協(xié)同和交叉選擇增加了ARGs豐度[23]。通過對各類ARGs分布特征的描述,也可以發(fā)現(xiàn)不同ARGs對不同濃度的銅也表現(xiàn)出了多樣的響應特征,其中多數(shù)的氨基糖苷類、大環(huán)內酯類和β-內酰胺類抗性基因相對豐度在CuL中較高;而四環(huán)素類抗性基因在CuH中保持較高相對豐度。此外,同一ARGs對不同濃度的銅的響應也不同,例如CuH中tetM、tet(44)相對豐度高于CuL,而銅處理組中tetB(p)、tetT相對豐度卻要低于CK。經過Pearson相關性分析,發(fā)現(xiàn)多數(shù)ARGs之間也存在顯著相關性,值得關注的是糖肽類抗性基因與檢測到的其他ARGs相關性均較弱。萬古霉素作為臨床醫(yī)學中用于治療細菌感染的重要抗生素,被譽為人類的最后一道防線[24],它也是糖肽類抗生素的一種。銅處理沒有顯著提高萬古霉素抗性基因相對豐度?？傮w來說,銅能影響發(fā)酵體系中的ARGs分布特征,且有增加體系中大多數(shù)ARGs污染水平的趨勢。

在銅處理下的MGEs總相對豐度要顯著高于CK,其中轉座子和部分整合子(intI1和intI2)相對豐度在銅處理組中顯著增加,WU等[25]在豬糞和秸稈混合好氧堆肥研究中也發(fā)現(xiàn)整合子intI1和轉座子IS6100持續(xù)以高豐度存在。整合子是水平基因轉移的重要指標之一,對ARGs的轉移有重要影響[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)銅污染后的發(fā)酵產物中intI1相對豐度顯著增高,且通過對厭氧發(fā)酵產物中的ARGs和MGEs進行Pearson相關性分析,發(fā)現(xiàn)了多數(shù)ARGs與MGEs之間存在著顯著相關性,這與課題組先前的研究結果[27]一致。與CK相比,CuL和CuH中MGEs的相對豐度更高。這些結果也表明,受到銅污染的發(fā)酵體系提高了ARGs基因水平轉移的能力,可能會加劇環(huán)境中ARGs的傳播風險。因此施用有機肥后農田土壤ARGs傳播的風險不容忽視,同時也應該關注MGEs豐度及其對ARGs轉移和傳播的影響機制。

課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)在受到銅污染豬糞的厭氧發(fā)酵體系中,添加氧化石墨烯可顯著降低ARGs和MGEs豐度[28]。針對復雜的發(fā)酵體系,添加有效的基質和添加劑對ARGs的響應還有待進一步研究。因此應該控制飼料添加劑中重金屬含量,嚴格控制動物糞便中重金屬含量,以減少ARGs的傳播風險。

4 結 論

未受到銅污染的豬糞經過厭氧發(fā)酵后仍檢測到豐富的ARGs。多藥類抗性基因數(shù)量最多,其次為氨基糖苷類抗性基因,并且受到銅污染的發(fā)酵產物中新增了多種ARGs。然而在相對豐度水平上,氨基糖苷類ARGs的相對豐度最高,其次是四環(huán)素類、多藥類和磺胺類抗性基因。相較于CK,在受到銅污染的厭氧發(fā)酵產物中ARGs和MGEs豐度均顯著增加,不同ARGs對銅的響應不同,同一種ARGs對不同濃度水平的銅脅迫反應也不同。銅會提升基因水平轉移的趨勢,也促進ARGs和MGEs的共選擇。ARGs與MGEs多呈顯著正相關性,MGEs對ARGs傳播擴散的促進水平可能在銅的選擇壓力下被放大了。